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1、实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定第1页，本讲稿共26页一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km和Vm值。第2页，本讲稿共26页二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1原理第3页，本讲稿共26页2主要方法：（1）比较吸收光谱曲线（2）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。1.苯丙氨酸2.酪氨酸3.色氨酸第4页，本讲稿共26页（3）比较吸光度的比值纯DNA第5页，本讲稿共26页（二）利用吸收光谱对物质
2、进行定量分析1原理Beer-Lambert（比尔）定律：T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度第6页，本讲稿共26页2常用方法（1）标准曲线法OD或浓度标准曲线与样品的测定条件必须一致。第7页，本讲稿共26页（2）标准管法CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。（3）摩尔吸光系数法C=A/（为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。第8页，本讲稿共26页(三)米氏常数的测定原理酶促反应v-S曲线vS推导出米氏方程为：其中S为底物浓
3、度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数第9页，本讲稿共26页米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/S作图，可得一条直线第10页，本讲稿共26页1/v1/Vm-1/Km1/S本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-无色黄色可通过分光光度法测定产物pN
4、P的含量，求出反应速度v。第11页，本讲稿共26页三、试剂与器材三、试剂与器材试剂：0.5mol/mLpNP、10mmol/LpNPP、20mmol/LMgCl2、0.1mol/L碳酸钠碳酸氢钠pH10.1缓冲液、0.1mol/LNaOH、6 g/mL碱性磷酸酶酶液器材：恒温水浴锅、722分光光度计第12页，本讲稿共26页四、分光光度计的使用第13页，本讲稿共26页1722型分光光度计的外形第14页，本讲稿共26页2.仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”键：用于自动调
5、整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长第15页，本讲稿共26页3.样品测试操作打开电源开关，使仪器预热20分钟用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A)将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成
6、后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。第16页，本讲稿共26页返回第17页，本讲稿共26页返回第18页，本讲稿共26页返回第19页，本讲稿共26页五、操作方法五、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作 取5支试管编号,0号一支,17号各二支,按下表操作：管号0123456pNP含量(mol)00.050.100.150.200.250.300.5mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.6H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.2Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(m
7、L)各管加入2.0mLOD405nm以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。第20页，本讲稿共26页(二）测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。No.12345底物终浓度S(mM)0.50.751.01.5310mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6蒸馏水（mL）0.50.450.40.30碳酸盐缓冲液（mL）各加1.0mL20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL预热混匀，37，5分钟酶液（mL）测定管各加0.2mL酶液反应时间37，精确反应10分钟0.1mol/
8、LNaOH（mL）各加2mL酶液（mL）空白管各补加0.2mL酶液OD405第21页，本讲稿共26页（三）数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/S作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。第22页，本讲稿共26页六、注意事项1.取液量一定要准确。2.反应时间一定要精确。3.加酶前后一定要将试剂混匀。4.空白对照一定要先加NaOH，后加酶。5.测定OD405时要以各自的空白调零点。6.移液管或取液器的使用7.比色杯的使用第23页，本讲稿共26页返回第24页，本讲稿共26页管号1122334455加酶时间（min）0.511.522.533.544.55加NaOH时间10.5 1111.5 1212.51313.51414.515反应时间（min）10101010101010101010返回第25页，本讲稿共26页七、思考题七、思考题(1)试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。(2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？第26页，本讲稿共26页