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1、第十六章经典液相色谱法本讲稿第一页，共四十四页2第一节概 述 第一节第一节 色色谱谱分析法分析法概述概述 u色谱法（色谱法（chromatography）是一种根据物质的物理或物理）是一种根据物质的物理或物理化学性质不同而进行分离分析的方法。化学性质不同而进行分离分析的方法。本讲稿第二页，共四十四页3第一节概 述一、一、色谱法的发展概况色谱法的发展概况 u色谱法的创始人是俄国植物学家茨维特色谱法的创始人是俄国植物学家茨维特Tsweet。u20世纪世纪30与与40年代相继出现了薄层色谱和纸色谱，与柱色年代相继出现了薄层色谱和纸色谱，与柱色谱一起统称为经典的液相色谱法，使色谱法成为一门分离谱一起统
2、称为经典的液相色谱法，使色谱法成为一门分离技术。技术。u20世纪世纪 50年代气相色谱的兴起，使色谱法在理论、仪器年代气相色谱的兴起，使色谱法在理论、仪器以及分离与以及分离与“在线在线”分析等方面得到长足发展，奠定了分析等方面得到长足发展，奠定了现代色谱法的基础。现代色谱法的基础。本讲稿第三页，共四十四页4第一节概 述u20世纪世纪 70年代高效液相色谱的崛起，弥补了气相色谱不能年代高效液相色谱的崛起，弥补了气相色谱不能直接用于分析难挥发、对热不稳定及高分子试样等方面的直接用于分析难挥发、对热不稳定及高分子试样等方面的不足，拓宽了色谱法的应用范围，成为色谱发展史上又一不足，拓宽了色谱法的应用范
3、围，成为色谱发展史上又一个里程碑个里程碑。u20世纪世纪 80年代是色谱迅猛发展的重要时期，相继出现了液年代是色谱迅猛发展的重要时期，相继出现了液相色谱的各种联用技术相色谱的各种联用技术。u经过一个多世纪的发展，色谱法已成为重要的分离分析方经过一个多世纪的发展，色谱法已成为重要的分离分析方法。法。本讲稿第四页，共四十四页5第一节概 述二、色谱法的分类二、色谱法的分类（一）按两相的分子聚集状态分类（一）按两相的分子聚集状态分类 u液相色谱法液相色谱法（LC）：流动相为液体的色谱法。）：流动相为液体的色谱法。u气相色谱法气相色谱法（GC）：流动相为气体的色谱法。）：流动相为气体的色谱法。u超临界流
4、体色谱法（超临界流体色谱法（SFC）：是以超临界流体作为流动相）：是以超临界流体作为流动相的一种色谱法。的一种色谱法。本讲稿第五页，共四十四页6第一节概 述（二）按操作形式分类 u柱色谱法（CC）:将固定相装于柱管内构成色谱柱，色谱过程在色谱柱内进行的色谱法，称为柱色谱。u平面色谱法:色谱过程在固定相构成的平面层内进行的色谱法，称为平面色谱。本讲稿第六页，共四十四页7第一节概 述（三）按色谱过程的分离机制分类 u吸附色谱法（adsorption chromatography，AC）u分配色谱法（distribution chromatography，DC）u离子交换色谱法（ion exchan
5、ge chromatography，IEC）u空间排阻色谱法（steric exclusion chromatography，SEC）本讲稿第七页，共四十四页8第一节概 述三、色谱过程三、色谱过程 u色谱法具有相对运动的两相，其一色谱法具有相对运动的两相，其一是固定不动的，称为固定相是固定不动的，称为固定相（stationary phase）；而另一相则）；而另一相则是携带试样向前移动的，称为流动相是携带试样向前移动的，称为流动相（mobile phase）。）。u色谱过程是物质在相对运动的固定色谱过程是物质在相对运动的固定相和流动相之间达到分配平衡的过相和流动相之间达到分配平衡的过程。例：顺
6、式与反式偶氮苯的色谱程。例：顺式与反式偶氮苯的色谱过程。过程。顺式与反式偶氮苯的顺式与反式偶氮苯的色谱过程示意图色谱过程示意图a.加样加样 b.洗脱洗脱 c.继续洗脱继续洗脱1.顺式偶氮苯顺式偶氮苯 2.反式偶氮苯反式偶氮苯本讲稿第八页，共四十四页9第二节第二节 色谱法的基本概念色谱法的基本概念 一、色谱图一、色谱图 u色谱流出曲线色谱流出曲线（一）基线（一）基线：是在操作条件下，仅有流动相通过检测系统时所：是在操作条件下，仅有流动相通过检测系统时所产生的信号曲线。产生的信号曲线。（二）色谱峰（二）色谱峰：色谱流出曲线上的突起部分。分为对称峰与：色谱流出曲线上的突起部分。分为对称峰与不对称峰，
7、后者又分为前延峰和拖尾峰。不对称峰，后者又分为前延峰和拖尾峰。第二节色谱法的基本概念 本讲稿第九页，共四十四页10第二节色谱法的基本概念 色谱流出曲线和色谱峰区域宽度色谱流出曲线和色谱峰区域宽度 本讲稿第十页，共四十四页11第二节色谱法的基本概念ufs处处于于0.951.05之之间间为为对对称称峰峰；小小于于0.95者者为为前前延延峰峰；大于大于1.05者为拖尾峰。者为拖尾峰。u色色谱谱流流出出曲曲线线上上，一一个个组组分分的的色色谱谱峰峰可可用用峰峰位位、峰峰高高或或峰峰面面积积及及色色谱谱峰峰的的区区域域宽宽度度等等三三项项参参数数描描述述，分分别别作作为为定定性性、定量及衡量柱效的依据。
8、定量及衡量柱效的依据。峰高（峰高（h）：色谱峰顶至基线的垂直距离。）：色谱峰顶至基线的垂直距离。峰面积（峰面积（A）：色谱峰与基线所包围的面积。）：色谱峰与基线所包围的面积。本讲稿第十一页，共四十四页12第三节基本色谱法的分离机制u吸附色谱过程就是组分不断被吸附、解吸附，再吸附、再解吸附色谱过程就是组分不断被吸附、解吸附，再吸附、再解吸附，吸附，如此反复多次的过程。，如此反复多次的过程。u吸附平衡常数吸附平衡常数组分的吸附平衡常数越大，组分越容易被吸附，保留时间越长，组分的吸附平衡常数越大，组分越容易被吸附，保留时间越长，迁移速度就越慢，即后流出色谱柱。迁移速度就越慢，即后流出色谱柱。三、分配
9、系数和容量因子三、分配系数和容量因子本讲稿第十二页，共四十四页13第二节色谱法的基本概念分配系数与容量因子的关系分配系数与容量因子的关系u分配系数比（分配系数比（）容量因子（容量因子（capacity factor，k）本讲稿第十三页，共四十四页14第二节色谱法的基本概念分配系数、容量因子与保留值的关系分配系数、容量因子与保留值的关系 分分配配系系数数（或或容容量量因因子子）越越小小，组组分分的的迁迁移移速速度度越越快快，保保留留时间越短，即先流出色谱柱；反之亦然。时间越短，即先流出色谱柱；反之亦然。分配系数（或容量因子）不等是组分分离的前提分配系数（或容量因子）不等是组分分离的前提。本讲稿第
10、十四页，共四十四页15第三节基本色谱法的分离机制 基本色谱法的分离机制基本色谱法的分离机制 一、吸附色谱法分离机制一、吸附色谱法分离机制u吸附色谱法是以吸附剂为固定相，液体（或气体）为流动相，利吸附色谱法是以吸附剂为固定相，液体（或气体）为流动相，利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异进行分离的色谱法。用吸附剂对不同组分的吸附能力差异进行分离的色谱法。u吸附是指溶质在液吸附是指溶质在液-固（或气固（或气-固）两相的交界面上集中浓固）两相的交界面上集中浓缩的现象。缩的现象。本讲稿第十五页，共四十四页16第三节基本色谱法的分离机制 二、分配色谱法分离机制二、分配色谱法分离机制 u分配色谱法是利用混合物
11、中的不同组分在固定相和流动相分配色谱法是利用混合物中的不同组分在固定相和流动相中的溶解度不同，即在两相中的分配系数不同而实现分离中的溶解度不同，即在两相中的分配系数不同而实现分离的。的。u分离机制：流动相携带样品流经固定相时，各组分在两相间不分离机制：流动相携带样品流经固定相时，各组分在两相间不断地进行溶解、萃取，再溶解、再萃取，断地进行溶解、萃取，再溶解、再萃取，如此多次后，如此多次后，使分配系数稍有差异的组分得以分离。使分配系数稍有差异的组分得以分离。本讲稿第十六页，共四十四页17第三节基本色谱法的分离机制三、离子交换色谱法分离机制三、离子交换色谱法分离机制u离子交换色谱法是利用被分离组分
12、离子交换能力的差别而实现分离子交换色谱法是利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离的。离的。u分离机制：被分离的离子随流动相流经离子交换树脂时，与分离机制：被分离的离子随流动相流经离子交换树脂时，与离子交换树脂上可被交换的离子连续进行竞争交换，因不同离子交换树脂上可被交换的离子连续进行竞争交换，因不同离子与交换树脂的竞争交换能力不同，其迁移的速度亦不同，离子与交换树脂的竞争交换能力不同，其迁移的速度亦不同，交换能力弱的离子，迁移速度快，保留时间短，先流出色谱交换能力弱的离子，迁移速度快，保留时间短，先流出色谱柱。柱。本讲稿第十七页，共四十四页18第三节基本色谱法的分离机制u离子交换反应：离子
13、交换反应：R-B+A+R-A+B+离子交换反应的选择性系数（离子交换反应的选择性系数（KA/B）用于衡量离子对树脂）用于衡量离子对树脂的亲和能力，的亲和能力，KA/B越大，说明越大，说明A的交换能力大，保留时间的交换能力大，保留时间长，则长，则A比比B后流出色谱柱；若后流出色谱柱；若KA/B较小（较小（KA/B1），说），说明明B离子的交换能力大，保留时间长，则离子的交换能力大，保留时间长，则A比比B先流出色先流出色谱柱。谱柱。本讲稿第十八页，共四十四页19第三节基本色谱法的分离机制四、空间排阻色谱法分离机制四、空间排阻色谱法分离机制空空间间排排阻阻色色谱谱法法是是利利用用被被分分离离组组分分
14、分分子子的的大大小小或或渗渗透透系系数数的的大大小小而而进进行行分分离离分分析析的的色谱法。色谱法。分分离离机机制制：类类似似于于反反分分子子筛筛的作用（见右图）。的作用（见右图）。凝胶色谱分离机制示意图凝胶色谱分离机制示意图O：凝胶颗粒：凝胶颗粒o：大分子组分：大分子组分：小分子组分：小分子组分本讲稿第十九页，共四十四页20第三节基本色谱法的分离机制 u各组分在流经凝胶表面时，由于小分子能完全渗透进入凝胶内各组分在流经凝胶表面时，由于小分子能完全渗透进入凝胶内部孔穴而被滞留，中等分子可以部分进入较大的一些孔穴，大部孔穴而被滞留，中等分子可以部分进入较大的一些孔穴，大分子则完全不能进入孔穴而只
15、能沿凝胶颗粒之间的空隙随流动分子则完全不能进入孔穴而只能沿凝胶颗粒之间的空隙随流动相流动。于是样品中各组分按大分子、中等大小的分子、小分相流动。于是样品中各组分按大分子、中等大小的分子、小分子的先后顺序流出色谱柱，从而得以分离。子的先后顺序流出色谱柱，从而得以分离。本讲稿第二十页，共四十四页21第四节经典液相色谱法 第四节第四节 经典液相色谱法经典液相色谱法 一、柱色谱法一、柱色谱法（一）吸附柱色谱法（一）吸附柱色谱法 u固定相固定相：吸附剂：吸附剂 硅胶硅胶硅硅胶胶的的吸吸附附活活性性与与含含水水量量有有关关。含含水水量量越越大大，活活性性级级数数越越大，吸附活性越低，吸附能力越弱。大，吸附
16、活性越低，吸附能力越弱。本讲稿第二十一页，共四十四页22第四节经典液相色谱法 硅硅胶胶呈呈微微酸酸性性，主主要要用用于于分分离离酸酸性性和和中中性性物物质质，如如有有机机酸酸、氨氨基酸、甾体、萜类等。基酸、甾体、萜类等。氧化铝氧化铝 吸吸附附活活性性与与其其含含水水量量密密切切相相关关，水水分分的的增增加加能能降降低低其其吸吸附附能能力。力。中中性性氧氧化化铝铝用用于于分分离离酸酸性性、中中性性和和碱碱性性化化合合物物，如如生生物物碱碱、挥发油、甾体、萜类及在酸碱中不稳定的酯类、苷类等。挥发油、甾体、萜类及在酸碱中不稳定的酯类、苷类等。本讲稿第二十二页，共四十四页23第四节经典液相色谱法 聚酰
17、胺聚酰胺 主主要要通通过过分分子子中中的的酰酰氨氨基基与与化化合合物物质质子子给给予予体体形形成成氢氢键键而而对对该该物物质质产产生生吸吸附附，因因形形成成氢氢键键的的能能力力不不同同，吸吸附附能能力也不同，从而使各化合物得以分离。力也不同，从而使各化合物得以分离。主主要要用用于于酚酚类类（含含黄黄酮酮类类、蒽蒽醌醌类类、鞣鞣质质类类等等）、酸酸类类、硝硝基类等物质的分离。基类等物质的分离。本讲稿第二十三页，共四十四页24第四节经典液相色谱法 大孔吸附树脂：大孔吸附树脂：主主要要通通过过范范德德华华引引力力或或产产生生氢氢键键而而吸吸附附被被分分离离物物质质，选选择性则由其多孔性网状结构所决定
18、。择性则由其多孔性网状结构所决定。主主要要用用于于水水溶溶性性化化合合物物的的分分离离及及纯纯化化，如如皂皂苷苷、其其它它苷苷类类物质等。物质等。本讲稿第二十四页，共四十四页25第四节经典液相色谱法 u流动相流动相 吸吸附附色色谱谱中中，流流动动相相的的洗洗脱脱作作用用实实质质上上是是流流动动相相分分子子与与被被分分离离组组分分分分子子竞竞争争占占据据吸吸附附剂剂表表面面活活性性中中心心的的过过程程，极极性性强强的的流流动动相相分分子子占占据据吸吸附附活活性性中中心心的的能能力力强强，具具有有强强的的洗洗脱脱作作用用；而而极极性性弱弱的的流流动动相相分分子子竞竞争争占占据据吸吸附附活活性性中中
19、心心的的能力弱，洗脱作用就弱。能力弱，洗脱作用就弱。本讲稿第二十五页，共四十四页26第四节经典液相色谱法 流动相的选择流动相的选择必必须须同同时时兼兼顾顾被被测测物物的的性性质质、吸吸附附剂剂的的活活性性和和流流动动相相的的极极性性等等三三方面方面。一一般般原原则则是是：若若被被分分离离组组分分极极性性较较小小，宜宜选选用用吸吸附附活活性性较较大大的的吸吸附附剂剂和和极极性性较较小小的的洗洗脱脱液液；反反之之，则则应应选选择择吸吸附附活活性性小小的吸附剂和极性较强的洗脱液。的吸附剂和极性较强的洗脱液。本讲稿第二十六页，共四十四页27第四节经典液相色谱法 被测物质的极性、吸附剂活性和流动相极性之
20、间的关系示意图被测物质的极性、吸附剂活性和流动相极性之间的关系示意图 本讲稿第二十七页，共四十四页28第四节经典液相色谱法（二）分配柱色谱法（二）分配柱色谱法 u固定相固定相 由载体及涂渍或键合在载体表面的固定液组成。由载体及涂渍或键合在载体表面的固定液组成。载体载体是一种惰性物质，主要起负载或支撑固定液的作用。是一种惰性物质，主要起负载或支撑固定液的作用。固定液固定液正相色谱：强极性溶剂，如水、甲醇等。正相色谱：强极性溶剂，如水、甲醇等。反相色谱：非极性或弱极性溶剂，如液体石蜡等。反相色谱：非极性或弱极性溶剂，如液体石蜡等。本讲稿第二十八页，共四十四页29第四节经典液相色谱法 u流动相流动相
21、 正相色谱：极性小于固定相的醇类、酮类、酯类、卤代烷、苯正相色谱：极性小于固定相的醇类、酮类、酯类、卤代烷、苯或其混合物。或其混合物。反相色谱：水、稀醇等极性溶剂。反相色谱：水、稀醇等极性溶剂。u应用应用 各类化合物的分离，特别是亲水性物质，如极性较大的酚类、各类化合物的分离，特别是亲水性物质，如极性较大的酚类、糖类、氨基酸衍生物等。糖类、氨基酸衍生物等。本讲稿第二十九页，共四十四页30第四节经典液相色谱法（三）离子交换柱色谱法（三）离子交换柱色谱法 u固定相离子交换树脂固定相离子交换树脂 选选择择系系数数：用用于于衡衡量量离离子子交交换换树树脂脂的的交交换换能能力力，交交换换容容量量大大，树
22、脂的交换能力强。树脂的交换能力强。性能参数：性能参数：1、交联度：离子交换树脂中所含交联剂的量。、交联度：离子交换树脂中所含交联剂的量。用用于于衡衡量量离离子子交交换换树树脂脂的的选选择择性性，交交联联度度大大，树树脂脂的的网网状状结构紧密，网眼小，选择性好。结构紧密，网眼小，选择性好。2、交交换换容容量量：实实验验条条件件下下，每每克克干干树树脂脂真真正正参参加加交交换换的的活活性基团数。性基团数。本讲稿第三十页，共四十四页31第四节经典液相色谱法 u流动相流动相 水为溶剂的缓冲溶液。水为溶剂的缓冲溶液。u应用应用 去离子水的制备，天然药物化学成分的分离，各种有机酸、氨去离子水的制备，天然药
23、物化学成分的分离，各种有机酸、氨基酸的分离制备，抗生素的纯制、去除干扰离子、测定某些盐基酸的分离制备，抗生素的纯制、去除干扰离子、测定某些盐类的含量等。类的含量等。本讲稿第三十一页，共四十四页32第四节经典液相色谱法（四）空间排阻柱色谱法（四）空间排阻柱色谱法（分子阻排色谱法）（分子阻排色谱法）u固定相固定相多孔性凝胶，常用葡聚糖凝胶。多孔性凝胶，常用葡聚糖凝胶。选选择择凝凝胶胶时时应应使使试试样样的的相相对对分分子子量量落落入入凝凝胶胶的的相相对对分分子子质质量范围内。量范围内。流动相流动相 一般水溶性试样选择水溶液为流动相，而非水溶性试样则一般水溶性试样选择水溶液为流动相，而非水溶性试样则
24、选择四氢呋喃、氯仿、甲苯等有机溶剂为流动相。选择四氢呋喃、氯仿、甲苯等有机溶剂为流动相。本讲稿第三十二页，共四十四页33第四节经典液相色谱法 u应用应用 天然药物化学和生物化学的研究，水溶性高分子化合物如蛋白天然药物化学和生物化学的研究，水溶性高分子化合物如蛋白制剂等的分析。制剂等的分析。本讲稿第三十三页，共四十四页34第四节经典液相色谱法 二、平面色谱法二、平面色谱法（一）薄层色谱法（一）薄层色谱法 u薄层色谱法是将固定相（如：吸附剂）均匀地涂铺在光洁的玻薄层色谱法是将固定相（如：吸附剂）均匀地涂铺在光洁的玻璃板、塑料板或金属板上形成薄层，在薄层板上进行分离分析璃板、塑料板或金属板上形成薄层
25、，在薄层板上进行分离分析的方法。的方法。u分离机制分离机制与吸附柱色谱的分离机制相似。与吸附柱色谱的分离机制相似。本讲稿第三十四页，共四十四页35第四节经典液相色谱法 u比移值与相对比移值比移值与相对比移值 比移值（比移值（retardation factor，Rf）：）：L0原点原点溶剂前沿溶剂前沿ABL1L2Rf的测量示意图的测量示意图本讲稿第三十五页，共四十四页36第四节经典液相色谱法 Rf可用范围是可用范围是0.20.8，最佳范围是，最佳范围是0.30.5。相对比移值（相对比移值（relative retardation factor，Rr）Rr可以大于可以大于1，也可以小于，也可以小
26、于1。本讲稿第三十六页，共四十四页37第四节经典液相色谱法 u操作方法操作方法 操作程序可分为制板、点样、展开、斑点定位等。操作程序可分为制板、点样、展开、斑点定位等。u定性和定量分析定性和定量分析 定性定性分析：分析：利用利用Rf或或Rr进行定性进行定性。定量定量分析分析-处于半定量或限量检查阶段处于半定量或限量检查阶段 常用的定量方法有目视比色法、洗脱法和薄层扫描法。常用的定量方法有目视比色法、洗脱法和薄层扫描法。本讲稿第三十七页，共四十四页38第四节经典液相色谱法 u应用应用适用于有机化合物的分离与鉴定，也可用于小量物质的提适用于有机化合物的分离与鉴定，也可用于小量物质的提纯与精制。在药
27、学领域中，可用于测定药品纯度和检查降纯与精制。在药学领域中，可用于测定药品纯度和检查降解产物；判断药品合成反应进行的程度、监控反应历程；解产物；判断药品合成反应进行的程度、监控反应历程；分离和测定天然药物的有效成分。分离和测定天然药物的有效成分。本讲稿第三十八页，共四十四页39第四节经典液相色谱法（三）纸色谱法（三）纸色谱法u纸色谱法是以纸为载体的平面色谱法。纸色谱法是以纸为载体的平面色谱法。u分离机制分离机制 属于分配色谱的范畴属于分配色谱的范畴，根据溶质在两相间分配系数差异而根据溶质在两相间分配系数差异而分离分离。一般为正相色谱，化合物的极性越大或亲水性越大，则一般为正相色谱，化合物的极性
28、越大或亲水性越大，则分配分配系数越大，系数越大，Rf越小越小；化合物的极性越小或亲脂性越强，则；化合物的极性越小或亲脂性越强，则分分配系数越小，配系数越小，Rf越大越大。本讲稿第三十九页，共四十四页40第四节经典液相色谱法 化合物一定时，展开剂的极性越大，化合物的分配系数越化合物一定时，展开剂的极性越大，化合物的分配系数越小，小，Rf越大；展开剂的极性越小，化合物的分配系数越大，越大；展开剂的极性越小，化合物的分配系数越大，Rf越小。越小。u固定相与展开剂固定相与展开剂 固定相固定相 一般为纸纤维及其吸着的水。一般为纸纤维及其吸着的水。展开剂（流动相）展开剂（流动相）常为一些含水的有机溶剂。常
29、为一些含水的有机溶剂。本讲稿第四十页，共四十四页41第四节经典液相色谱法 u实验方法实验方法 1、色谱滤纸的选择、色谱滤纸的选择 应满足：应满足：纯净，无明显荧光斑点。纯净，无明显荧光斑点。均匀无痕，有一定的机械强度。均匀无痕，有一定的机械强度。纸纤维松紧适宜。纸纤维松紧适宜。应针对分离组分及分离分析目的选择合适的滤纸型号。应针对分离组分及分离分析目的选择合适的滤纸型号。本讲稿第四十一页，共四十四页42第四节经典液相色谱法 点样点样 与薄层色谱法相似。与薄层色谱法相似。展开展开 展展开开剂剂的的选选择择主主要要考考虑虑欲欲分分离离物物质质在在两两相相中中的的溶溶解解度度和和展展开剂的极性。开剂的极性。常用上行展开方式展开。常用上行展开方式展开。本讲稿第四十二页，共四十四页43第四节经典液相色谱法 斑点的定位斑点的定位 与薄层色谱法相似，应注意：纸色谱不能使用具有腐蚀性的显与薄层色谱法相似，应注意：纸色谱不能使用具有腐蚀性的显色剂，以免腐蚀滤纸；也不能在高温下显色。色剂，以免腐蚀滤纸；也不能在高温下显色。定性和定量分析定性和定量分析 定性方法同薄层色谱法。定性方法同薄层色谱法。定量方法则采用剪洗法，亦可采用目视比色法作半定量分析。定量方法则采用剪洗法，亦可采用目视比色法作半定量分析。本讲稿第四十三页，共四十四页44本章结束!谢谢!本讲稿第四十四页，共四十四页