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1、第十六章色谱分析法第十六章色谱分析法概论概论本讲稿第一页，共四十三页概述色谱法是一种重要的分离、分析技术。色谱法是一种重要的分离、分析技术。一、色谱法（起源）一、色谱法（起源）19061906年，俄国植物学家茨维特年，俄国植物学家茨维特（TswettTswett）首次研究了植物叶的色）首次研究了植物叶的色素成分。（如图）素成分。（如图）分析过程为离线的，即不能连续分析过程为离线的，即不能连续进行。进行。人们将这种方法称为色谱法，人们将这种方法称为色谱法，随着色谱法的发展，可对大量无色随着色谱法的发展，可对大量无色物质进行分离，但仍沿用了色谱法物质进行分离，但仍沿用了色谱法这一名词。这一名词。本
2、讲稿第二页，共四十三页 现代色谱法现代色谱法的分离、分析的分离、分析过过 程是在线程是在线的，即连续进的，即连续进行。行。本讲稿第三页，共四十三页二、色谱法特点二、色谱法特点分离效率高分离效率高选择性好选择性好集分离、分析于一体集分离、分析于一体灵敏度高（可测灵敏度高（可测1010-11-111010-13-13g g）分析速度快分析速度快易与其它仪器联用，应用范围广易与其它仪器联用，应用范围广本讲稿第四页，共四十三页第一节第一节 色谱法的分类和发展色谱法的分类和发展一、色谱法的分类色谱法的分类1.1.按两相（固定相与流动相）状态分类按两相（固定相与流动相）状态分类 气相色谱法气相色谱法 色谱
3、法色谱法 液相色谱法液相色谱法 超临界色谱法超临界色谱法 本讲稿第五页，共四十三页2.2.按分离原理分类按分离原理分类 吸附色谱吸附色谱 分配色谱分配色谱色谱法色谱法 离子交换色谱离子交换色谱 凝胶色谱凝胶色谱（扩散）、（扩散）、（扩散）、（扩散）、亲和色谱、络合色谱、热色谱等亲和色谱、络合色谱、热色谱等亲和色谱、络合色谱、热色谱等亲和色谱、络合色谱、热色谱等本讲稿第六页，共四十三页3.3.按固定相形式分类按固定相形式分类 填充柱色谱填充柱色谱 柱色谱柱色谱色谱法色谱法 毛细管色谱毛细管色谱 纸层色谱纸层色谱 薄层色谱薄层色谱本讲稿第七页，共四十三页二、色谱法的发展二、色谱法的发展色谱法的历史
4、色谱法的历史色谱法的现状和发展趋势色谱法的现状和发展趋势1.新型固定相和检测器的研制新型固定相和检测器的研制2.色谱新方法的研究色谱新方法的研究3.色谱联用技术色谱联用技术4.色谱专家系统色谱专家系统本讲稿第八页，共四十三页第二节第二节 色谱过程和基本原理色谱过程和基本原理一、色谱过程及色谱图一、色谱过程及色谱图本讲稿第九页，共四十三页二、色谱流出曲线和有关概念二、色谱流出曲线和有关概念色谱流出曲线色谱流出曲线1.1.色谱流出曲线色谱流出曲线 当试样流经色谱柱后，各组分随流动相的移动当试样流经色谱柱后，各组分随流动相的移动当试样流经色谱柱后，各组分随流动相的移动当试样流经色谱柱后，各组分随流动
5、相的移动而在两相间反复进行吸附、解吸、或分配、萃取而在两相间反复进行吸附、解吸、或分配、萃取而在两相间反复进行吸附、解吸、或分配、萃取而在两相间反复进行吸附、解吸、或分配、萃取过程，最后依次得到各组分，将各组分浓度经检过程，最后依次得到各组分，将各组分浓度经检过程，最后依次得到各组分，将各组分浓度经检过程，最后依次得到各组分，将各组分浓度经检测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线。时间变化的曲线，称为色谱流出曲线。时间变化的曲线，称为
6、色谱流出曲线。时间变化的曲线，称为色谱流出曲线。本讲稿第十页，共四十三页2.基线基线 操作条件稳定后，仅有流动相通过时，检操作条件稳定后，仅有流动相通过时，检操作条件稳定后，仅有流动相通过时，检操作条件稳定后，仅有流动相通过时，检测器响应讯号随时间变化的曲线。测器响应讯号随时间变化的曲线。测器响应讯号随时间变化的曲线。测器响应讯号随时间变化的曲线。3.3.色谱峰色谱峰（P339)P339)4.4.色谱峰区域宽度色谱峰区域宽度 它是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，可反它是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，可反它是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，可反它是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，可反映出色谱柱的分离效
7、能映出色谱柱的分离效能映出色谱柱的分离效能映出色谱柱的分离效能本讲稿第十一页，共四十三页度量色谱峰区域宽度常用三种方法：度量色谱峰区域宽度常用三种方法：标准偏差标准偏差 即即0.6070.607倍峰高处色谱峰宽的一半。倍峰高处色谱峰宽的一半。半峰宽半峰宽W W1/21/2 即峰高一半处对应的峰宽即峰高一半处对应的峰宽W W1/21/2=2.354=2.354 峰底宽峰底宽W Wb b 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距W Wb b=4=4本讲稿第十二页，共四十三页保留值保留值 保留值是试样各组分在色谱柱中保留行保留值是试样各组分在色谱柱中保留行为的量度
8、，可反映出组分与固定相间作用力为的量度，可反映出组分与固定相间作用力大小。大小。1.1.死时间死时间t t0 0 不被固定相吸附或溶解的组分，即非滞不被固定相吸附或溶解的组分，即非滞留组分（如空气、甲烷）从进样开始到出现留组分（如空气、甲烷）从进样开始到出现其色谱峰最大值所需的时间。它也是气体流其色谱峰最大值所需的时间。它也是气体流经色谱柱中空隙所需时间。经色谱柱中空隙所需时间。本讲稿第十三页，共四十三页2.2.保留时间保留时间t t t tR R R R 某组分从进样到出现色谱峰最大值的时某组分从进样到出现色谱峰最大值的时间。它取决于色谱过程的热力学因素，是定间。它取决于色谱过程的热力学因素
9、，是定间。它取决于色谱过程的热力学因素，是定间。它取决于色谱过程的热力学因素，是定性依据。性依据。性依据。性依据。3.3.调整保留时间调整保留时间t t t tR R 扣除死时间后的保留时间。扣除死时间后的保留时间。它反映了组分与固定相作用所消耗的时它反映了组分与固定相作用所消耗的时间，是各组分产生差速迁移的物化基础。间，是各组分产生差速迁移的物化基础。本讲稿第十四页，共四十三页4.4.死体积死体积 V V0 0 指在指在t t0 0这段时间内通过色谱柱的载气体这段时间内通过色谱柱的载气体积。即色谱柱内载气所占的体积。积。即色谱柱内载气所占的体积。V V0 0=t t0 0 F Fc c (F
10、 Fc c，ml/minml/min为流动相流速为流动相流速)5.5.保留体积保留体积V VR R 指从进样到出现某组分色谱峰最大值时指从进样到出现某组分色谱峰最大值时所通过的载气体积。所通过的载气体积。V VR R=t tR R F Fc c本讲稿第十五页，共四十三页6.6.调整保留体积调整保留体积 V VR R 指扣除死体积后的保留体积。指扣除死体积后的保留体积。V VR R=V VR R-V-V0 0=t tR R F Fc c7.相对保留值相对保留值r r2 2，1 1 指在相同操作条件下，某组分指在相同操作条件下，某组分2 2的调整保的调整保留值与另一组分留值与另一组分1 1的调整保
11、留值之比。即的调整保留值之比。即本讲稿第十六页，共四十三页 相对保留值仅与柱温、固定相性质有相对保留值仅与柱温、固定相性质有关。可用来表示色谱柱的选择性。关。可用来表示色谱柱的选择性。*r r2 2，1 1，两组分越易实现分离。两组分越易实现分离。*r r2 2，1 1=1=1时，两组分色谱峰重叠。时，两组分色谱峰重叠。本讲稿第十七页，共四十三页8.保留指数保留指数 I 在在GC中，把组分的保留行为换算成相当中，把组分的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为，也就是以正构烷于正构烷烃的保留行为，也就是以正构烷烃系列作为组分相对保留值的标准，用两烃系列作为组分相对保留值的标准，用两个保留时间紧邻
12、待侧组分的基准物质来标个保留时间紧邻待侧组分的基准物质来标定组分，这个相对值称为保留指数。定组分，这个相对值称为保留指数。本讲稿第十八页，共四十三页色谱峰高和峰面积色谱峰高和峰面积1.峰高峰高h 是组分在柱后出现浓度极大时的检测是组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。信号，即色谱峰顶至基线的距离。2.峰面积峰面积A 色谱曲线与基线间包围的面积。色谱曲线与基线间包围的面积。本讲稿第十九页，共四十三页分离度（分辨率）分离度（分辨率）R柱效能和选择性对分离的影响柱效能和选择性对分离的影响柱效柱效 选择性选择性 差差 差差 差差 好好 好好 好好本讲稿第二十页，共四十三页 因此，
13、单独用柱效或选择性不能真实反因此，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中的分离情况，需引入一个映组分在色谱柱中的分离情况，需引入一个综合指标综合指标分离度分离度R R 分离度：分离度：相邻两组分色谱峰保留值之差与相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰底宽度平均值之比。即两组分色谱峰峰底宽度平均值之比。即本讲稿第二十一页，共四十三页 理论证明，若相邻两色谱峰对称且满足理论证明，若相邻两色谱峰对称且满足正态分布，正态分布，当当 R R1 5050），曲线接近正态分布），曲线接近正态分布曲线。曲线。给出了给出了n n与与W Wb b的关系式（由此关系式可得的关系式（由此关系式可得出流出曲线
14、与分离效果关系）出流出曲线与分离效果关系）n n ，柱效，柱效 。若两组分若两组分K K相同，则无论相同，则无论n n多大，都无法分离多大，都无法分离。本讲稿第三十六页，共四十三页塔板理论不足：塔板理论不足：无法解释峰扩展原因。无法解释峰扩展原因。（为使（为使n n，则，则W Wb b应应 ，如何使，如何使W Wb b？）？）无法解释影响塔板高度的因素无法解释影响塔板高度的因素（L L一定，一定，n1/H,n1/H,如何使如何使H H？）？）本讲稿第三十七页，共四十三页二、速率理论二、速率理论 1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起
15、来，提出了色谱过程的动力学理论-速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。本讲稿第三十八页，共四十三页速率理论的简化方程式速率理论的简化方程式速率理论的简化方程式速率理论的简化方程式:H=A+H=A+B B/u+Cu/u+Cu影响塔板高度影响塔板高度影响塔板高度影响塔板高度(柱效柱效柱效柱效)的动力学因素的动力学因素的动力学因素的动力学因素涡流扩散：涡流扩散：涡流扩散：涡流扩散：A=2A=2ddp p 由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在由于色谱柱内填充剂的几
16、何结构不同，分子在 色谱柱中色谱柱中色谱柱中色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。的流速不同而引起的峰展宽。的流速不同而引起的峰展宽。的流速不同而引起的峰展宽。d dp p为填料直径，为填料直径，为填料直径，为填料直径，为填充不规则因子，填充越不均匀为填充不规则因子，填充越不均匀为填充不规则因子，填充越不均匀为填充不规则因子，填充越不均匀 越大。越大。越大。越大。HPLCHPLC常用填料粒度一般为常用填料粒度一般为常用填料粒度一般为常用填料粒度一般为310m310m，最好，最好，最好，最好35m35m，粒，粒，粒，粒度分布度分布度分布度分布RSD5%RSD5%。但粒度太小难于填充均匀（。但粒度太小
17、难于填充均匀（。但粒度太小难于填充均匀（。但粒度太小难于填充均匀（大），且大），且大），且大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，规则均匀，规则均匀，规则均匀，越小。越小。越小。越小。总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。毛细管无填料，效。毛细管无填料，效
18、。毛细管无填料，效。毛细管无填料，A A0 0。本讲稿第三十九页，共四十三页纵向扩散：纵向扩散：纵向扩散：纵向扩散：B=2B=2 DDmm 由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。扩散而引起的峰展宽。扩散而引起的峰展宽。扩散而引起的峰展宽。u u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u u小），展宽越严重
19、。在低流速时，它对峰形的影响较大。小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。D Dmm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的D Dmm很很很很小，通常仅为气相的小，通常仅为气相的小，通常仅为气相的小，通常仅为气相的1010-4-41010-5-5，因此在，因此在，因此在，因此在HPLCHPLC中，只要流中，只要流中，只要流中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。速不太低的
20、话，这一项可以忽略不计。速不太低的话，这一项可以忽略不计。速不太低的话，这一项可以忽略不计。是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对散，而引入的柱参数，用以对散，而引入的柱参数，用以对散，而引入的柱参数，用以对D Dmm进行校正。进行校正。进行校正。进行校正。一般在一般在一般在一般在0.60.70.60.7左右，毛细管柱的左右，毛细管柱的左右，毛细管柱的左右，毛细管柱的 1 1。本讲稿第四十页，共四十三页传质阻力传质阻力传质阻力传质阻
21、力 由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。质过程而导致的峰展宽。质过程而导致的峰展宽。质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有
22、限的，这一过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。生峰展宽。生峰展宽。生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项液相色谱的传质阻抗项液相色谱的传质阻抗项液相色谱的传质阻抗项CuCu又分为三项。又分为三项。又分为三项。又分为三项。流动相线速度对塔板高度的影响流动相线速度对塔板高度的影响流动相线速度对塔板高度的影响流动相线速度对塔板高度的影响见见见见P353P353页页页页本讲稿第四十一页，共
23、四十三页本讲稿第四十二页，共四十三页 从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：分析，一般可采用以下措施：分析，一般可采用以下措施：分析，一般可采用以下措施：进样时间要短进样时间要短进样时间要短进样时间要短。填料粒度要小。填料粒度要小。填料粒度要小。填料粒度要小。改善传质过程。改善传质过程。改善传质过程。改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽
24、和拖尾，甚至不可逆吸附。和拖尾，甚至不可逆吸附。和拖尾，甚至不可逆吸附。和拖尾，甚至不可逆吸附。适当的流速。适当的流速。适当的流速。适当的流速。以以以以HH对对对对u u作图，则有一最佳线速度作图，则有一最佳线速度作图，则有一最佳线速度作图，则有一最佳线速度u u u uoptoptoptopt，在此线速度时，在此线速度时，在此线速度时，在此线速度时，HH最小。一般在液相色谱中，最小。一般在液相色谱中，最小。一般在液相色谱中，最小。一般在液相色谱中，u u u uoptoptoptopt很小很小很小很小(大约大约大约大约0.030.030.030.030.1mm/s)0.1mm/s)0.1mm/s)0.1mm/s)在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s1mm/s1mm/s1mm/s的条件下操作。的条件下操作。的条件下操作。的条件下操作。较小的检测器死体积。较小的检测器死体积。较小的检测器死体积。较小的检测器死体积。本讲稿第四十三页，共四十三页