第八章_抗生素药物的分析.ppt

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1、第八章 抗生素药物的分析第一节第一节 概概 述述抗生素的概念：抗生素的概念：具有抑制或杀灭微生物的一类物质。具有抑制或杀灭微生物的一类物质。抗生素的特征：抗生素的特征：生物体在生命活动过程中合成的次级代谢产物。生物体在生命活动过程中合成的次级代谢产物。性质不稳定，易降解、聚合性质不稳定，易降解、聚合纯度一般较低纯度一般较低临床上会引起不良反应临床上会引起不良反应临床应用广泛，影响大临床应用广泛，影响大抗生素药品质量研究的项目：抗生素药品质量研究的项目：性性状状及及鉴鉴别别试试验验，含含量量测测定定或或效效价价测测定定，酸酸碱碱度度测测定定，澄澄明明度度，水水分分或或干干燥燥失失重重，安安全全试

2、试验验（异常毒性），热原，降压物质，无菌。（异常毒性），热原，降压物质，无菌。其其他他检检查查：组组分分、杂杂质质、晶晶型型、比比旋旋度度、灰灰分分、重金属、熔点等。重金属、熔点等。抗生素药品分析常用的方法：抗生素药品分析常用的方法：物理方法物理方法:旋光法、紫外、红外、色谱等旋光法、紫外、红外、色谱等化化学学方方法法（专专属属性性不不强强）：功功能能团团反反应应，鉴鉴别别和和含含量量的的测测定定。容容量量分分析析法法：酸酸碱碱滴滴定定（青青霉霉素素含量测定）和碘量法。含量测定）和碘量法。生物学方法：酶反应、微生物法测定效价生物学方法：酶反应、微生物法测定效价第二节第二节 抗生素效价微生物检定

3、法抗生素效价微生物检定法 一、微生物检定法定义：一、微生物检定法定义：是是利利用用微微生生物物发发育育时时对对某某些些物物质质的的特特殊殊依依赖赖性性，按按这这些些物物质质对对微微生生物物生生长长的的影影响响，对对他他们们作作出出定定量量鉴鉴定定的的方方法法。微微生生物物检检定定法法可可分分为为三三类类：稀稀释释法法（dilute dilute methodmethod）、比比浊浊法法 （turbid turbid compare compare methodmethod）、琼琼 脂脂 扩扩 散散 法法（diffuse diffuse methodmethod）。与化学方法相比：与化学方法相比

4、：优点：优点：1 1、原理与医疗要求基本一致、原理与医疗要求基本一致 2 2、对微生物作用直接反映其抗菌活性、对微生物作用直接反映其抗菌活性缺点：缺点：1 1、结果是总效价，无法区分多组分、结果是总效价，无法区分多组分 2 2、时间长，有一定误差，操作繁杂、时间长，有一定误差，操作繁杂二、抗生素标准效价（二、抗生素标准效价（potency)potency)单位单位牛牛津津单单位位:抑抑制制5050毫毫升升肉肉汤汤培培养养基基中中金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌生长的青霉素的最低含量为一个牛津单位菌生长的青霉素的最低含量为一个牛津单位.一一个个牛牛津津单单位位相相当当于于0.60.6ugug的的青青霉

5、霉素素钠钠盐盐所所具具有有的的抗抗生生活活力力，1 1mgmg青青霉霉素素G G钠钠盐盐含含有有16671667个个牛牛津津单单位位,(,(IU)IU)（一）一）稀释单位稀释单位 (u/mlu/ml，u/mg)u/mg)将将1 1mgmg抗抗生生素素配配成成溶溶液液，在在一一定定条条件件下下进进行行稀稀释释，对对某某一一细细菌菌能能抑抑制制其其生生长长的的最最高高稀稀释释度度，即即为为1 1mgmg抗生素中可含有的单位。抗生素中可含有的单位。（二）二）重量单位重量单位(u/mg)u/mg)以以抗抗生生物物有有效效成成分分（即即生生理理活活性性部部分分）的的重重量量作作为为抗抗生生素素的的单单位

6、位。称称重重量量单单位位.。如如一一个个链链霉霉素素碱碱单单位位的的重重量量为为1 1微微克克，一一个个青青霉霉素素G G钠钠盐盐的的单单位位的的重重量量为为0.60.6微微克克。同同一一种种抗抗生生素素的的各各种种盐盐的的校校价价可可根根据其分子量与标准盐类进行换算而得。据其分子量与标准盐类进行换算而得。青霉素G钾盐的理论效价（U/mg）=（U/mg）1 1类似重量单位类似重量单位:以以抗抗生生素素盐盐类类纯纯品品的的重重量量为为单单位位。包包括括无无生生物活性的酸根和金属离子。物活性的酸根和金属离子。2 2重量折算单位重量折算单位 以以与与原原始始的的生生物物活活性性相相当当的的纯纯抗抗生

7、生素素实实际际重量为一个单位，重量为一个单位，3 3特定单位特定单位 以以特特定定抗抗生生素素某某一一批批产产品品的的某某一一重重量量为为一一个个单位，经有关国家权威机构认可而定单位，经有关国家权威机构认可而定.效价测定的方法：效价测定的方法：一、稀释法（一、稀释法（dilute method）二、比浊法二、比浊法（turbid compare method）三、琼脂扩散法（三、琼脂扩散法（diffuse method）一、稀释法一、稀释法 原理：用液体培养基逐级将抗生素稀释，原理：用液体培养基逐级将抗生素稀释，在各管中加入等量的试验菌液，进行培养，在各管中加入等量的试验菌液，进行培养，观察抑

8、制细菌生长的最低抗生素浓度，再观察抑制细菌生长的最低抗生素浓度，再与同法测定的标准品终点作比较，从而求与同法测定的标准品终点作比较，从而求得被测抗生素的效价。得被测抗生素的效价。nX=(T/S)*CX=(T/S)*CnX X样品效价样品效价(U/ml)U/ml)nT T检品液最大稀释倍数检品液最大稀释倍数nS S标准品液最大稀释倍数标准品液最大稀释倍数nC C标准品液效价标准品液效价(U/ml)U/ml)试管编号试管编号1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010稀释倍数稀释倍数标准品标准品供试品供试品2 2-4 4-8 8-1616-3232-+6464+128128+25

9、6256+512512+10241024+-：细菌被抑制 +：细菌生长X=(T/S)*C=X=(T/S)*C=（16/3216/32）*40=20*40=20（U/ml)U/ml)检测终点判断：检测终点判断：1、试验菌生长完全抑制、试验菌生长完全抑制2、生长、生长50%抑制抑制3、指示剂变色、指示剂变色4、电位差的改变、电位差的改变5、菌种的溶血现象等、菌种的溶血现象等二、比浊法二、比浊法 原原理理：将将一一定定量量的的抗抗生生素素加加至至接接种种有有试试验验微微生生物物的的液液体体培培养养基基内内，混混匀匀后后，经经短短期期培培养养（约约3-43-4h h），测测量量培培养养基基浊浊度度，其

10、其浊浊度度与与细细菌菌数数、细细菌菌群群体体质质量量存存在在直直接接关关系系，在一定的范围内符合比耳定律。在一定的范围内符合比耳定律。细细菌菌数数、细细菌菌群群体体质质量量又又直直接接受受抗抗生生素素效效价的影响。价的影响。影响因素：影响因素：一、影响比浊法的物理因素一、影响比浊法的物理因素 1 1、散射现象、散射现象 2 2、菌液浓度：、菌液浓度：3 3、细菌体大小的变化、细菌体大小的变化二二、培培养养基基：在在没没有有外外加加抑抑制制剂剂的的情情况况下下，菌菌体体的的生生长长受受培培养养基基的的成成分分、酸酸度度、培培养养温温度度、通通气气等等条条件件影影响响。一一般般的的试试验验菌菌是是

11、金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，pHpH在在6.8-7.86.8-7.8。三三、培培养养：温温度度、振振摇摇。一一般般培培养养时时间间3 3小小时，可缩短为时，可缩短为2 2小时。小时。操作流程如图：操作流程如图：基本要点：基本要点：1 1 培培养养条条件件的的控控制制：试试管管规规格格均均一一 水水浴浴箱箱水温均匀，试管按拉丁方排列。水温均匀，试管按拉丁方排列。2 2 细菌生长误差的控制：细菌生长误差的控制：3 3 测测量量时时间间的的控控制制：各各管管应应先先充充分分混混匀匀，将菌液移入比色皿后静止将菌液移入比色皿后静止2 2分钟后测定。分钟后测定。三、琼脂扩散法（三、琼脂扩散法（diff

12、use method）即管碟法即管碟法n管碟法原理管碟法原理:n 抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散，形成抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散，形成一定浓度抗生素的球型区，抑制试验菌生长，通过透一定浓度抗生素的球型区，抑制试验菌生长，通过透明培养基观察抑菌圈，抗生素剂量的对数与抑菌圈面明培养基观察抑菌圈，抗生素剂量的对数与抑菌圈面积或直径成正比。在同样条件下将已知效价的标准品积或直径成正比。在同样条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应(抑菌圈抑菌圈)进进行比较；当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素行比较；当标准品和供试品是属于同一性

13、质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液对一定试验菌所得的时，标准品溶液和供试品溶液对一定试验菌所得的剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。根据剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。根据以上原理，可设计为一剂量法、二剂量法及三剂量法。以上原理，可设计为一剂量法、二剂量法及三剂量法。从而可以较为准确地测定供试品的效价。从而可以较为准确地测定供试品的效价。抑菌圈的形成抑菌圈的形成 nM:抗生素在管中的量抗生素在管中的量nD：扩散系数扩散系数nT：扩散时间扩散时间nC：最低抑菌浓度最低抑菌浓度nH：培养基厚度培养基厚度D的影响因素：的影响因素：抗生素本身结构、分子量等，结构简单者容易扩抗生素本身

14、结构、分子量等，结构简单者容易扩散，分子量大的扩散就慢，散，分子量大的扩散就慢，杂质：抗生素或培养基中含有杂质，杂质本身也杂质：抗生素或培养基中含有杂质，杂质本身也有扩散系统，看干扰抗生素的扩散，影响抑菌圈有扩散系统，看干扰抗生素的扩散，影响抑菌圈的大小和清晰度。的大小和清晰度。琼脂含量：含量过多影响抗生素的扩散，过少又琼脂含量：含量过多影响抗生素的扩散，过少又使钢管下陷，影响抑菌圈的大小。使钢管下陷，影响抑菌圈的大小。菌种对抗生素的吸附作用：菌种对抗生素的吸附作用：pH影响分子的形式、影响分子的形式、温度影响扩散温度影响扩散D增大，增大，r也增大也增大nT的影响：的影响：n 一般一般T增加，

15、增加，r增大，但时间太长影响抑菌圈增大，但时间太长影响抑菌圈清晰度。清晰度。nM的影响：在一定的范围内，小管内的影响：在一定的范围内，小管内M越大，越大，抑菌圈直径越大抑菌圈直径越大，M还与抗生素的抗菌活性、还与抗生素的抗菌活性、浓度、钢管的大小、剂型、辅料等有关。浓度、钢管的大小、剂型、辅料等有关。nC的影响：的影响：C越小，抑菌圈直径越大，越小，抑菌圈直径越大，C与菌种、与菌种、菌量、培养菌量、培养基、温度等有关基、温度等有关nH的影响：培养基增厚，则抑菌圈减小。的影响：培养基增厚，则抑菌圈减小。n操作中要注意：操作中要注意：n1试试验验菌菌种种：挑挑选选合合适适的的敏敏感感菌菌；用用适适

16、宜宜的的菌菌种种保保存存方方法法；定定期期对对菌菌种种分分离离纯纯化化；控制菌龄菌量。控制菌龄菌量。n2培培养养基基：培培养养基基的的成成分分影影响响抑抑菌菌圈圈的的大大小和清晰度，小和清晰度，pH也很重要。也很重要。一剂量法（标准曲线法一剂量法（标准曲线法）n一剂量法（标准曲线法）原理：在一定一剂量法（标准曲线法）原理：在一定范围内，抑菌圈的直径随抗生素浓度的范围内，抑菌圈的直径随抗生素浓度的增减而增减。并且抑菌圈的直径与抗生增减而增减。并且抑菌圈的直径与抗生素的对数剂量成线性关系。据此测定抗素的对数剂量成线性关系。据此测定抗生素效价。生素效价。Y=a+Y=a+bXbXY:Y:抑菌圈直径抑菌

17、圈直径A A：截距截距B B：斜率斜率X X：抗生素浓度的对数。抗生素浓度的对数。方方法法：为为了了消消除除平平板板间间的的差差异异，在在每每一一平平板板的的含含菌菌培培养养基基上上放放置置6 6个个小小钢钢管管，相相间间的的3 3个个小小管管内内加加入入抗抗生生素素标标准准品品的的某某一一浓浓度度（CkCk）,他他所所产产生生的的抑抑菌菌圈圈直直径径平平均均值值为为 ，另另外外3 3个个小小管管内内加加入入标标准准品品的的中中心心浓浓度度（CoCo）,他他所所产产生生的的抑抑菌菌圈圈直直径径平平均均值值为为 。令令f fk k=这这样样采采用用自自身身对对照照的的方方法法，可可以以消消除除平

18、平板板间间的的误误差差，使结果更加准确。使结果更加准确。f=a+f=a+bXbX标标准准曲曲线线的的制制备备：做做8 8个个浓浓度度，取取2424个个平平皿皿，分分8 8组组，每组每组3 3个取平均值。个取平均值。fkfk对对X X作图。作图。-检品的效价检定：检品的效价检定：取取3 3个个平平皿皿，每每个个放放6 6个个小小管管。在在间间隔隔的的3 3个个小小管管内内加加入入抗抗生生素素标标准准品品的的中中心心浓浓度度(Co),Co),另另3 3 个个小小管管内内加加入入估估计计浓浓度度相相当当于于CoCo的的检检品品溶溶液液。测测量量出出f fk k,从从标标准准曲曲线线中中计计算算出出检

19、检品品的的浓浓度度，在在换换算算出出每每毫毫克克的的单位数。单位数。二剂量法：二剂量法：将将抗抗生生素素的的标标准准品品及及检检品品各各稀稀释释成成有有一一定定比比例例的的二二种种剂剂量量（2 2：1 1或或4 4：1 1），即即高高剂剂量量和和低低剂剂量量，在在同同一一平平板板上上进进行行对对比比，根根据据所所产产生生抑抑菌菌圈圈大大小小来来计计算算检检品品效效价价的的方法。方法。nSH:SH:为为抗抗生生素素标标准准品品高高剂剂量量（dS2dS2）所所致致的的抑抑菌菌圈圈直直径径nSLSL：为为抗抗生生素素标标准准品品低低剂剂量量(dS1)dS1)所所致致的的抑抑菌菌圈圈直直径径nUHUH

20、：为抗生素检品高剂量为抗生素检品高剂量(dT2)dT2)所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径nULUL：为抗生素检品低剂量为抗生素检品低剂量(dT1)dT1)所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径nn要求：要求：1、高剂量抑菌圈直径应为、高剂量抑菌圈直径应为2024nm，个别个别可可为为1824mm，高剂量与低剂量抑菌圈直高剂量与低剂量抑菌圈直径之差应大于或等于径之差应大于或等于2mm。2、底层琼脂底层琼脂20ml，上层上层5ml，每一检品所用每一检品所用平板不少于平板不少于4个。个。3、等距安置小钢管、等距安置小钢管4个，相对角为同一物质。个，相对角为同一物质。4、为为10010%（更精确要求（更精确

21、要求1005%）5、标准品与检品同质、标准品与检品同质三剂量法：三剂量法：应用高、中、低三种剂量，在同一实应用高、中、低三种剂量，在同一实验条件下比较标准品及检品溶液的抑菌圈验条件下比较标准品及检品溶液的抑菌圈大小，以求得检品效价的方法。大小，以求得检品效价的方法。S3:S3:为抗生素标准品高剂量（为抗生素标准品高剂量（dS3dS3）所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径S2:S2:为抗生素标准品中剂量（为抗生素标准品中剂量（dS2dS2）所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径S1:S1:为抗生素标准品低剂量（为抗生素标准品低剂量（dS1dS1）所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径U3U3：为抗生素检品高剂量

22、为抗生素检品高剂量(dT3)dT3)所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径U2U2：为抗生素检品中剂量为抗生素检品中剂量(dT2)dT2)所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径U1:U1:为抗生素检品低剂量为抗生素检品低剂量(dT1)dT1)所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径要求：要求：1、标准品中剂量抑菌圈直径、标准品中剂量抑菌圈直径1518mm2、高、中、低剂距为高、中、低剂距为1:0.83、每一检品不得少于、每一检品不得少于6个平皿个平皿4、每板上等距安放小钢管、每板上等距安放小钢管6个个5、:10010%（100%5%）三三 影响抗生素效价管碟法测定结果的影响抗生素效价管碟法测定结果的因素及其控制因

23、素及其控制（一）影响抑菌圈形状的因素与控制（一）影响抑菌圈形状的因素与控制 1稀释抗生素用的缓冲液稀释抗生素用的缓冲液的的PH值、盐浓度的影值、盐浓度的影响响.pH值低或含盐浓度高，就会不显抑菌圈或呈卵值低或含盐浓度高，就会不显抑菌圈或呈卵圆形抑菌圈。这是因为抗生素溶液的盐浓度高或圆形抑菌圈。这是因为抗生素溶液的盐浓度高或pH值过低，可能改变抗生素分子的解离状态，值过低，可能改变抗生素分子的解离状态，影响了抗生素对试验菌抑制作用。影响了抗生素对试验菌抑制作用。2制各琼脂培养基菌层，加菌时培养基温度的制各琼脂培养基菌层，加菌时培养基温度的影响影响 3测试用的器材洗净度的影响测试用的器材洗净度的影

24、响 4 双碟培养温度的影响双碟培养温度的影响 5 其他操作的影响其他操作的影响（二）影响抑菌圈边缘清晰度的因素与控制（二）影响抑菌圈边缘清晰度的因素与控制 1 试验菌长时间放置菌群中的一些菌株生理特试验菌长时间放置菌群中的一些菌株生理特性有所变化，或是生长速度改变，或对抗生素的性有所变化，或是生长速度改变，或对抗生素的敏感度有所变化，往往出现双圈，抑菌圈的边缘敏感度有所变化，往往出现双圈，抑菌圈的边缘不清。不清。在检定时菌层培养基中的菌量影响抑菌圈，菌层在检定时菌层培养基中的菌量影响抑菌圈，菌层培养基中的菌量过低，抑菌圈边缘模糊不清，菌培养基中的菌量过低，抑菌圈边缘模糊不清，菌量过高、使抑菌圈

25、太小并且影响试验菌灵敏度。量过高、使抑菌圈太小并且影响试验菌灵敏度。因此，在正式检测之前，找出最适菌量。因此，在正式检测之前，找出最适菌量。2 培养基的原材料品种与质量，生测用培养基用培养基的原材料品种与质量，生测用培养基用的原材料的选择很重要。的原材料的选择很重要。3调节培养基调节培养基的的pH值或增加适量的盐浓度可使抑值或增加适量的盐浓度可使抑菌圈清晰菌圈清晰.4不适当延长双碟的培养时间，使抑菌圈边缘不适当延长双碟的培养时间，使抑菌圈边缘不清。不清。抗生素效价管碟法测定的操作技术抗生素效价管碟法测定的操作技术操作分为八步：操作分为八步：1 1试验菌的纯化与悬液的制备试验菌的纯化与悬液的制备

26、2 2 缓冲液、灭菌水与培养基的制备缓冲液、灭菌水与培养基的制备3 3标准品、供试品的称量、溶解与稀释标准品、供试品的称量、溶解与稀释4 4 双碟的制备及放管双碟的制备及放管5 5 滴加药液滴加药液6 6恒温培养恒温培养7 7 测量抑菌圈直径或面积测量抑菌圈直径或面积8 8 计算计算操作流程：操作流程：四、比浊法与管碟法比较比浊法比浊法管碟法管碟法优点优点 1、快速、快速1、结果较稳定、结果较稳定2、客观、精确、客观、精确2、大批量、大批量3、无扩散影响、无扩散影响缺点缺点 1、对样品洁净度、对样品洁净度要求高要求高1、扩散因素影响较、扩散因素影响较大大2、实验要求较严实验要求较严2、时间长（

27、、时间长（2天天)3、操作繁琐、操作繁琐,人为因人为因素的干扰素的干扰第二节 抗生素类药物的鉴别一、一、-内酰胺类抗生素的鉴别内酰胺类抗生素的鉴别结构的共同点：结构的共同点：1 1、和内酰胺相邻的碳原子上有一、和内酰胺相邻的碳原子上有一羧基，羧基，2 2、内酰胺中氮原子相对的碳原子上有一、内酰胺中氮原子相对的碳原子上有一功能团氨基。功能团氨基。分类：青霉烷类，头孢烯类，碳青霉烯类（硫霉分类：青霉烷类，头孢烯类，碳青霉烯类（硫霉素），单环素），单环-内酰胺（克拉维酸）。内酰胺（克拉维酸）。鉴别：鉴别：1 1、酶法：、酶法：-内酰胺酶内酰胺酶2 2、红外吸收光谱法：、红外吸收光谱法：3000-28

28、00(3000-2800(C-H),3350cmC-H),3350cm-1-1(N-(N-H),1800-1600(H),1800-1600(羰基羰基)，1460-13751460-1375（甲基或次甲基）（甲基或次甲基）3 3、紫外吸收光谱法、紫外吸收光谱法4 4、茚三酮反应：、茚三酮反应：是是氨基的反应，与茚三酮缩合，氨基的反应，与茚三酮缩合，生成蓝紫色化合物。生成蓝紫色化合物。5 5、色谱法：、色谱法：薄薄层层色色谱谱后，后，氯铂氯铂酸与硫酸与硫醚醚基反基反应应是灵敏度高的是灵敏度高的显显色色试剂试剂 二、氨基糖苷类抗生素二、氨基糖苷类抗生素环己醇配基以糖苷键与氨基糖相连。环己醇配基以糖

29、苷键与氨基糖相连。链霉素，布鲁霉素，卡那霉素，庆大霉素，新霉素。链霉素，布鲁霉素，卡那霉素，庆大霉素，新霉素。（一）呈色反应（一）呈色反应1、茚三酮反应：、茚三酮反应：2、坂口反应：、坂口反应：链霉素水解产物链霉胍特有。链霉胍，链霉素水解产物链霉胍特有。链霉胍，8-羟喹啉羟喹啉分别与次溴酸钠反应，其各自的产物在相互作用生成橙红色化分别与次溴酸钠反应，其各自的产物在相互作用生成橙红色化合物。合物。3、糖类反应：莫利西反应、糖类反应：莫利西反应 脱水脱水 -奈酚奈酚糖糖 糠醛糠醛 红紫色产物红紫色产物4、埃尔松、埃尔松-摩根：摩根：样品在强酸或强碱水解后释放出氨样品在强酸或强碱水解后释放出氨基乙糖

30、，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，形成吡咯样基乙糖，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，形成吡咯样的衍生物，在碱性条件下与对二甲胺基苯甲醛的乙醇的衍生物，在碱性条件下与对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液成红色，在及盐酸溶液成红色，在540nm处可定量测定。处可定量测定。5、麦芽酚反应：、麦芽酚反应：水解、重排水解、重排 Fe3+链霉糖链霉糖 麦芽酚麦芽酚 紫红色络合物紫红色络合物 OH-H+三、四环类抗生素三、四环类抗生素结构结构:氢化四骈苯氢化四骈苯,四环素，土霉素，金霉素，强力霉素。四环素，土霉素，金霉素，强力霉素。（一）呈色反应（一）呈色反应 1、浓硫酸反应、浓硫酸反应 四环素四环素 深紫色；深紫色；

31、金霉素金霉素 蓝色至绿色；蓝色至绿色；土霉素土霉素 朱红色；朱红色；强力霉素强力霉素 黄色；黄色；2、三氯化铁反应：酚羟基、三氯化铁反应：酚羟基 （二）荧光反应（二）荧光反应:土霉素绿色荧光，四环素黄色土霉素绿色荧光，四环素黄色荧光荧光 （三）紫外光谱（三）紫外光谱 （四）色谱（四）色谱四、大环内酯抗生素四、大环内酯抗生素 结构：一个大环内酯环为母核，通过糖苷键与结构：一个大环内酯环为母核，通过糖苷键与1-31-3个糖相连。个糖相连。（红霉素，螺旋霉素，柱晶白红霉素，螺旋霉素，柱晶白霉素霉素）（一）呈色反应（一）呈色反应 1、硫酸反应：、硫酸反应：遇硫酸均呈红棕色遇硫酸均呈红棕色 2、莫利西反

32、应：糖类的反应、莫利西反应：糖类的反应 3、Seliwanaff 反应：反应：脱水脱水 间苯二酚间苯二酚糖糖 糖醛衍生物糖醛衍生物 具颜色产物具颜色产物 红霉素红霉素 淡黄色；淡黄色；螺旋霉素螺旋霉素 亮紫红色；亮紫红色；碳霉素碳霉素 深青紫色；深青紫色；柱晶白霉素柱晶白霉素 淡青色；淡青色；（二）薄层色谱二）薄层色谱(三三)光谱学鉴别光谱学鉴别紫外光谱紫外光谱红外光谱红外光谱五、利福霉素类抗生素的鉴别五、利福霉素类抗生素的鉴别结结构构：一一个个脂脂肪肪链链经经过过酰酰胺胺键键与与一一个个平平面面的的芳芳香香基基团团连连接成一个环桥式化合物，所以又称环桥类抗生素。接成一个环桥式化合物，所以又称

33、环桥类抗生素。代表药物：利福平代表药物：利福平（rifampicinrifampicin）鉴别：鉴别：呈色反应：呈色反应：1 1浓盐酸反应：浓盐酸反应：2 2三三氯氯化化铁铁：，向向1 1毫毫升升利利福福霉霉素素的的溶溶液液中中，滴滴加加三三氯氯化化铁乙醇溶液，有绿色，蓝绿色。表明有酚羟基铁乙醇溶液，有绿色，蓝绿色。表明有酚羟基3 3硝硝酸酸盐盐反反应应：利利福福平平，溶溶液液中中加加入入硝硝酸酸钠钠溶溶液液，颜颜色色由橙色变为暗红色。由橙色变为暗红色。六、多肽类抗生素：六、多肽类抗生素：抗抗感感染染的的杆杆菌菌肽肽（BacitracinBacitracin）、多多粘粘菌菌素素、万万古古霉霉素

34、素。用用于于癌癌症症治治疗疗的的放放线线菌菌苏苏D D、搏来霉素。搏来霉素。鉴别：鉴别：茚三酮反应：茚三酮反应：磷钨酸反应：磷钨酸反应：双缩脲反应：双缩脲反应：第三节第三节 抗生素类药物的杂质检查抗生素类药物的杂质检查一、高分子杂质、降解产物及异构体一、高分子杂质、降解产物及异构体 1、青霉素、青霉素 过敏原：青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白过敏原：青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白 凝胶过滤法分离，用凝胶过滤法分离，用Penamaldate法测定法测定 HgCl2 青霉噻唑衍生物青霉噻唑衍生物 Penamaldate 半合成半合成-内酰胺类抗生素中微量杂质内酰胺类抗生素中微量杂质N,NN,N二二甲基苯胺的

35、测定：甲基苯胺的测定：2、链霉素、链霉素毒性杂质毒性杂质:链霉胍链霉胍,链胍双氢链糖链胍双氢链糖;双氢链霉素双氢链霉素;链霉素链霉素醛基结合物醛基结合物;神经毒性：二链霉胺神经毒性：二链霉胺二链霉胺含量测定原理二链霉胺含量测定原理:二链霉胺等不被二链霉胺等不被KBH4还原，能与盐酸氨基脲还原，能与盐酸氨基脲反应，生成的缩氨脲在反应，生成的缩氨脲在233nm有吸收峰有吸收峰3、土霉素、土霉素 脱水土霉素、差向土霉素、脱水土霉素、差向土霉素、-阿扑土阿扑土霉素、霉素、-阿扑土霉素等降解产物阿扑土霉素等降解产物 薄层分离，荧光测定薄层分离，荧光测定4、四环素、四环素 脱水四环素、差向四环素、差向脱水

36、脱水四环素、差向四环素、差向脱水四环素四环素 HPLC测定测定二、无机杂质的检查二、无机杂质的检查三、溶媒残留量三、溶媒残留量 1、比色法：、比色法：甲醇氧化成甲醛，用品红试剂测定甲醇氧化成甲醛，用品红试剂测定 丙酮与水杨醛缩合比色丙酮与水杨醛缩合比色 醋酸丁酯与盐酸羟胺反应后比色测定醋酸丁酯与盐酸羟胺反应后比色测定 2、气相色谱气相色谱 3、HPLC 4、红外光谱红外光谱青霉素钠青霉素钠 拼音名：拼音名：Qingmeisuna 英文名：英文名：Benzylpenicillin Sodium C16H17N2NaO4S 356.38 本本品品为为(2S,5R,6R)-3,3-二二甲甲基基-6-

37、(2-苯苯乙乙酰酰氨氨基基)-7-氧氧代代-4-硫硫杂杂-1-氮氮杂杂双双环环3.2.0 庚庚烷烷-2-甲甲酸酸钠钠盐盐。按按无无水水物物计计算算，含含青青霉霉素素按按C16H17N2NaO4S 计算，不得少于计算，不得少于96.0 【性性状状】本本品品为为白白色色结结晶晶性性粉粉末末；无无臭臭或或微微有有特特异异性性臭臭；有有引引湿湿性性；遇遇酸酸、碱碱或或氧氧化化剂剂等等即即迅迅速速失失效效，水水溶液在室温放置易失效。溶液在室温放置易失效。本本品品在在水水中中极极易易溶溶解解，在在乙乙醇醇中中溶溶解解，在在脂脂肪肪油油或液状石蜡中不溶。或液状石蜡中不溶。【鉴鉴别别】(1)取取本本品品与与已

38、已知知含含量量的的青青霉霉素素适适量量，分分别别加加水水制制成成每每1ml中中约约含含50g的的溶溶液液，各各取取1ml，加加入入不不少少于于200 单单位位的的青青霉霉素素酶酶溶溶液液1ml,在在37灭灭活活1小小时时后后，取取灭灭菌菌滤滤纸纸片片，分分别别用用上上述述溶溶液液浸浸湿湿后后，用用滤滤纸纸吸吸去去多多余余的的液液体体，置置摊摊布布金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌CMCC(B)26003的的培培养养基基上上，在在37培培养养约约16小小时时后后均均无无抑抑菌菌作用，而用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用。作用，而用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用。(2)取取

39、本本品品约约0.1g，加加水水5ml 溶溶解解后后，加加稀稀盐盐酸酸2 滴滴，即即生生成成白白色色沉沉淀淀；此此沉沉淀淀能能在在乙乙醇醇、醋醋酸酸戊戊酯酯、氯氯仿仿、乙乙醚醚或或过过量量的的盐盐酸酸中溶解。中溶解。(3)本本品品的的红红外外光光吸吸收收图图谱谱应应与与对对照照的的图图谱谱（光光谱谱集集222 图图）一一致。致。(4)本品显钠盐的火焰反应（附录本品显钠盐的火焰反应（附录）。）。如如果果已已做做(1)、(2)、(4)项项，则则(3)项项可可不不做做。如如果果已已做做(3)、(4)项，则项，则(1)、(2)项可不做。项可不做。【检查】【检查】酸碱度酸碱度 溶液的澄清度与颜色溶液的澄清

40、度与颜色 吸吸收收度度 取取本本品品，加加水水制制成成每每1ml 中中含含1.80mg的的溶溶液液，照照分分光光光光度度法法（附附录录 A），在在280nm 的的波波长长处处测测定定吸吸收收度度，不不得得大大于于0.10；在；在264nm 的波长处有最大吸收，吸收度应为的波长处有最大吸收，吸收度应为0.800.88。水水分分 取取本本品品，照照水水分分测测定定法法（附附录录 M第第一一法法 A）测测定定，含含水水分不得过分不得过0.5。细细菌菌内内毒毒素素 取取本本品品，依依法法检检查查（附附录录 E），每每100青青霉霉素素单单位位中含内毒素的量应小于中含内毒素的量应小于0.01EU。无无菌菌 取取本本品品，分分别别用用青青霉霉素素酶酶法法灭灭活活后后，依依法法检检查查（附附录录 H），应符合规定。应符合规定。【含含量量测测定定】每每1mg的的C16H17N2NaO4S 相相当当于于1670青青霉霉素素单单位。位。【类别】【类别】抗生素类药。抗生素类药。【贮藏】【贮藏】严封，在凉暗干燥处保存。严封，在凉暗干燥处保存。【制剂】【制剂】