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1、食品中大肠菌群的检验1.食品微生物检验的意义l有害微生物对人类和生产的影响：引起食品变质引起食物中毒导致人体患病1.食品微生物检验的意义l是衡量食品卫生质量的重要指标,也是判定被检食品能否食用的科学依据l可以判断食品加工环境及食品卫生的情况,为卫生管理工作提供科学依据l可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生l保证产品的质量,避免不 必要的损失生产环境的检验生产环境的检验生产环境的检验生产环境的检验原辅料的检验原辅料的检验原辅料的检验原辅料的检验食品加工、储藏、销售食品加工、储藏、销售食品加工、储藏、销售食品加工、储藏、销售储环节的检验储环节的检验储环节的检验储环节的检验食品的检验食品的
2、检验食品的检验食品的检验2.食品微生物检验的范围3.食品卫生标准中的微生物指标l指示菌概念:在常规安全卫生监测中，用以指示检样卫生状况及安全性的指示性微生物类型：一般性、特定性（如粪便污染）、其他项目：菌落总数、大肠菌群、耐热大肠菌群、总大肠菌群一、实验目的一、实验目的l1.1.了解大肠菌群在食品检验中的意义。了解大肠菌群在食品检验中的意义。l2.2.掌握检验的程序和步骤。掌握检验的程序和步骤。l3.3.通过通过MPNMPN检索表的检索得出实验结果。检索表的检索得出实验结果。二、基本原理二、基本原理l大肠菌群系指一群在大肠菌群系指一群在32323737下下24h24h内，能内，能发酵乳糖产酸、
3、产气、需氧或兼性厌氧的革发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为畜粪便，故以此作为粪便污染指标粪便污染指标，来评价，来评价食品卫生质量状况，食品卫生质量状况，推断食品中肠道致病菌推断食品中肠道致病菌污染的可能污染的可能。具有广泛的卫生学意义。具有广泛的卫生学意义。产气气克雷白氏菌克雷白氏菌ETEC EIEC 阴沟阴沟肠肠杆菌杆菌EHEC 产气气克雷白氏菌克雷白氏菌大大肠埃希氏菌埃希氏菌柠檬檬酸杆菌酸杆菌O157：H7大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌是人和温血动物肠道是人和温血动物肠道是人和温血动物肠道是
4、人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中内普遍存在的细菌，是粪便中内普遍存在的细菌，是粪便中内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大的主要菌种。一般生活在人大的主要菌种。一般生活在人大的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体肠中并不致病，但它侵入人体肠中并不致病，但它侵入人体肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染一些部位时，可引起感染一些部位时，可引起感染一些部位时，可引起感染 。大肠菌群大肠菌群大肠菌群大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，并非细菌学分类命
5、名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、
6、非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。总大肠菌群总大肠菌群总大肠菌群总大肠菌群系指一系指一系指一系指一群在群在群在群在3737培养培养培养培养2424小小小小时能发酵乳糖、产时能发酵乳糖、产时能发酵乳糖、产时能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼酸产气、需氧和兼酸产气、需氧和兼酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性厌氧的革兰氏阴性厌氧的革兰氏阴性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。性无芽胞杆菌。性无芽胞杆菌。性无芽胞杆菌。耐热大肠菌群耐热大肠菌群耐热大肠菌群耐热大肠菌群即粪大肠菌即
7、粪大肠菌即粪大肠菌即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，群，作为一种卫生指标菌，群，作为一种卫生指标菌，群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含耐热大肠菌群中很可能含耐热大肠菌群中很可能含耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物有粪源微生物有粪源微生物有粪源微生物，因此耐热，因此耐热，因此耐热，因此耐热大肠菌群的存在表明可能大肠菌群的存在表明可能大肠菌群的存在表明可能大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存受到了粪便污染，可能存受到了粪便污染，可能存受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热在大肠杆菌。但是，耐热在大肠杆菌。但是，耐热在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在大肠菌群的存在大肠菌群
8、的存在大肠菌群的存在并不代表并不代表并不代表并不代表对人有什么直接的危害。对人有什么直接的危害。对人有什么直接的危害。对人有什么直接的危害。致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌能引起食物能引起食物能引起食物能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠中毒。致病性菌株能侵入肠中毒。致病性菌株能侵入肠中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆粘膜上皮细胞，具有痢疾杆粘膜上皮细胞，具有痢疾杆粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠菌样致病力。肠致病性大肠菌样致病力。肠致病性大肠菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（杆菌（杆菌（杆菌（EPECEPEC）、肠毒素性大）、肠毒素性大）、肠毒
9、素性大）、肠毒素性大肠杆菌（肠杆菌（肠杆菌（肠杆菌（ETECETEC）和肠侵袭性）和肠侵袭性）和肠侵袭性）和肠侵袭性大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（EIECEIEC）等。）等。）等。）等。O157:H7O157:H7（EHEC)EHEC)肠出血性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻感染性腹泻感染性腹泻感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠是近年来新发现的危害严重的肠是近年来新发现的危害严重的肠是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群道传染病，已逐渐成为威胁人群道传染病，已逐渐成为威胁人群道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生
10、问题。健康的重要公共卫生问题。健康的重要公共卫生问题。健康的重要公共卫生问题。大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系大肠菌群的食品卫生学意义大肠菌群的食品卫生学意义l作为粪便污染食品的指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低l作为肠道致病菌污染食品的指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系l要求食品中大肠菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量GB 4789.3-2010 GB 4789.3-2
11、010 大肠菌群计数大肠菌群计数第一法：大肠菌群第一法：大肠菌群MPNMPN计数法计数法第二法：大肠菌群平板计数法第二法：大肠菌群平板计数法三、检测方法三、检测方法l 最近似数测定法（最近似数测定法（MPN）是指对未知样品做）是指对未知样品做连续的连续的1010倍稀释，选择倍稀释，选择3 3个连续的个连续的1010倍稀释液，每倍稀释液，每种稀释液接种种稀释液接种3 3管装有培养基的试管中培养，根据管装有培养基的试管中培养，根据LSTLST初发酵试验以及初发酵试验以及BGLBBGLB发酵证实实验，证实大肠发酵证实实验，证实大肠菌群的阳性管数，查菌群的阳性管数，查MPNMPN检索表，检索表，报告每
12、报告每g g（mLmL）样品中大肠菌群的最可能数。样品中大肠菌群的最可能数。l 食品中大肠菌群数以每食品中大肠菌群数以每g g（mLmL）样品中大肠菌）样品中大肠菌群的最可能数来表示，即为大肠菌群群的最可能数来表示，即为大肠菌群MPNMPN值。值。需要用到的培养基需要用到的培养基（1 1）LSTLST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨成分：成分：胰蛋白胨或胰酪胨（胰蛋白胨或胰酪胨（TryticaseTryticase）20g20g，NaCL NaCL 5.0g5.0g，乳糖，乳糖5.0g5.0g，K K2 2HPOHPO4 4 2.75g 2.75g，KHKH2
13、2POPO4 4 2.75g 2.75g，月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠0.1g0.1g，蒸馏水，蒸馏水1000mL1000mL。制法：制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的管的20mm150mm20mm150mm试管中，每管试管中，每管10mL10mL。121121高压灭高压灭菌菌15min15min。最终。最终pH6.80.2pH6.80.2。（2 2）BGLBBGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤：煌绿乳糖胆盐肉汤成分：成分：蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g，乳糖，乳糖10.0g10.0g，牛胆粉溶液，牛胆粉溶液200mL200mL，0.1%0.1%煌绿
14、水溶液煌绿水溶液13.3mL13.3mL，蒸馏水，蒸馏水800mL800mL，pH7.20.1pH7.20.1。l3 3个三角瓶（个三角瓶（含玻珠含玻珠）中，）中，225ml/225ml/个个l9 9支试管，支试管，3 3支支/组，组，9ml/9ml/支支抑菌剂的选择抑菌剂的选择l大大肠肠菌菌群群检检验验中中常常用用的的抑抑菌菌剂剂有有胆胆盐盐、十十二二烷烷基基硫酸钠硫酸钠、洗衣粉、洗衣粉、煌绿煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。、龙胆紫、孔雀绿等。l抑抑菌菌剂剂的的主主要要作作用用是是抑抑制制其其它它杂杂菌菌，特特别别是是革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌的的生生长长。国国家家标标准准中中LSTLST肉肉汤汤利利
15、用用十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠作作为为抑抑菌菌剂剂，BGLBBGLB肉肉汤汤利利用用煌煌绿绿和和胆胆盐盐作为抑菌剂作为抑菌剂。l抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。些菌株有时也产生一些抑制作用。实验步骤及操作要点：1）无菌取样并制作梯度稀释液；梯度稀释法依次稀释样品无菌取样并制作梯度稀释液；梯度稀释法依次稀释样品到到10-42）样品匀液的）样品匀液的pH 值应在值应在6.57.5 之间，必要时分别用之间，必要时分别用1 mol/L
16、NaOH 或或1 mol/L HCl 调节。调节。3）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。10-210-310-40将产气的试管内将产气的试管内样品接种到样品接种到BGLB肉汤肉汤LST不产气（不产气（-）小导管里无气泡小导管里无气泡LST产气（产气（+）l4）初发酵试验）初发酵试验 选择选择1010-2-2、1010-3-3、1010-4-4三个稀释度的样品均液三个稀释度的样品均液 （液体样品可以选择原液），（液体样品可以选择原液），用无菌移液管分别用无菌移液管分别吸取吸取1mL1mL到到LSTLST发酵液试管中，发酵液试管
17、中，每管接种每管接种1mL，每每个稀释度做个稀释度做3 3个平行（共个平行（共9 9管）管）,361 培养培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。菌群阴性。LST结果判断结果判断l大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖
18、发酵如有疑问时，可以果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。用手轻轻打动试管。5）复发酵试验）复发酵试验 用接种环从产气的用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培肉汤管中分别取培养物养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，）管中，36 1培养培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。管。6）大肠菌群最可能数（）大肠菌群最可能数（MPN）的报告）的报告 按按5）确证的大肠菌群）确证的大肠菌群LST阳性管数，检阳性管数，检索索MPN表（见附录表（见附录B），报告），报告每每g（mL）样品中大肠菌群的样品中大肠菌群的MPN值。值。阳性管数0.100.010.001LST发酵管BGLB证实管表表B.1 大大肠肠菌菌群群最最可可能能数数（MPN）检检索索表表思考题思考题1大大肠肠菌菌群群的的检检验验分分哪哪几几个个步步骤骤？各各有有何何作作用？用？2在在糖糖发发酵酵试试验验中中，若若发发现现发发酵酵倒倒管管内内存存在在极极微微小小的的气气泡泡，这这种种情情况况可可否否算算作作产产气气阳阳性？性？3造成本实验误差的主要原因有哪些？造成本实验误差的主要原因有哪些？