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1、实验四食品中大肠菌群的测定第1页，本讲稿共16页一、实验目的掌握大肠菌群的原理及其检验方法，以判掌握大肠菌群的原理及其检验方法，以判别食品的卫生质量别食品的卫生质量了解了解MPN测定法在食品卫生检验中的意义测定法在食品卫生检验中的意义第2页，本讲稿共16页二、实验原理大肠菌群大肠菌群是指一群在一定培养条件下可发酵乳是指一群在一定培养条件下可发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。芽孢杆菌。该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标评该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标评该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标评该菌主要来源自人畜粪便，作
2、为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。的可能。的可能。的可能。第3页，本讲稿共16页 最近似数测定法（最近似数测定法（最近似数测定法（最近似数测定法（MPNMPN）是指对未知样品做连续的是指对未知样品做连续的是指对未知样品做连续的是指对未知样品做连续的1010倍稀释，选择倍稀释，选择倍稀释，选择倍稀释，选择3 3个连续的个连续的个连续的个连续的1010倍稀释液，每种稀释液接种倍稀释液，每种稀释液接种倍稀释液，每种稀释液接种倍稀释液，每种稀释液
3、接种3 3管装有培养基的试管中培养，根据管装有培养基的试管中培养，根据管装有培养基的试管中培养，根据管装有培养基的试管中培养，根据LSTLST初发酵试验以及初发酵试验以及初发酵试验以及初发酵试验以及BGLBBGLB发酵证实实验，证实大肠菌群的阳性管数，查发酵证实实验，证实大肠菌群的阳性管数，查发酵证实实验，证实大肠菌群的阳性管数，查发酵证实实验，证实大肠菌群的阳性管数，查MPNMPN检索表，报告每检索表，报告每检索表，报告每检索表，报告每g g（mLmL）样品中大肠菌群的最可能）样品中大肠菌群的最可能）样品中大肠菌群的最可能）样品中大肠菌群的最可能数。数。数。数。食品中大肠菌群数以每食品中大肠
4、菌群数以每食品中大肠菌群数以每食品中大肠菌群数以每g g（mLmL）样品中大肠菌群的）样品中大肠菌群的）样品中大肠菌群的）样品中大肠菌群的最可能数来表示，即为大肠菌群最可能数来表示，即为大肠菌群最可能数来表示，即为大肠菌群最可能数来表示，即为大肠菌群MPNMPN值。值。值。值。第4页，本讲稿共16页三、实验器材（一）培养基（一）培养基（一）培养基（一）培养基 月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LSTLST）培养基）培养基）培养基）培养基 煌绿乳糖胆盐肉汤（煌绿乳糖胆盐肉汤（煌绿乳糖胆盐肉汤（煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLBBGLB）培养基
5、）培养基）培养基）培养基（二）实验材料（二）实验材料（二）实验材料（二）实验材料 市售饮料市售饮料市售饮料市售饮料（三）其他（三）其他（三）其他（三）其他 三角瓶，试管，培养皿，移液管三角瓶，试管，培养皿，移液管三角瓶，试管，培养皿，移液管三角瓶，试管，培养皿，移液管（四）仪器（四）仪器（四）仪器（四）仪器 超净工作台，电子天平，高压蒸汽灭菌锅超净工作台，电子天平，高压蒸汽灭菌锅超净工作台，电子天平，高压蒸汽灭菌锅超净工作台，电子天平，高压蒸汽灭菌锅第5页，本讲稿共16页四、实验准备（一）配制培养基和试剂（一）配制培养基和试剂（一）配制培养基和试剂（一）配制培养基和试剂（以中央台为单位）以中央
6、台为单位）以中央台为单位）以中央台为单位）1 1、配制生理盐水：、配制生理盐水：、配制生理盐水：、配制生理盐水：1000m1000mL L NaCl 8.5g NaCl 8.5g 水水水水 1000m 1000mL L 分装：分装：分装：分装：3 3个三角瓶（个三角瓶（个三角瓶（个三角瓶（含玻珠含玻珠含玻珠含玻珠）中，）中，）中，）中，225m225mL L/个个个个9 9支试管，支试管，支试管，支试管，3 3支支支支/组，组，组，组，9m9mL L/支支支支 灭菌：灭菌：灭菌：灭菌：121126 121126灭菌灭菌灭菌灭菌20min20min第6页，本讲稿共16页2、月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤
7、（、月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）培养基：）培养基：300mL分装到分装到27个已装有个已装有杜氏小管杜氏小管试管中，试管中，10mL/个个包扎包扎（3支一捆），支一捆），112115灭菌灭菌30min 胰蛋白胨胰蛋白胨 6g NaCl 1.5g 乳糖乳糖 1.5g K2HPO4 0.825g KH2PO4 0.825g 十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 0.03g 水水 300mL pH 6.8第7页，本讲稿共16页3、煌绿乳糖胆盐肉汤（、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）培养基：）培养基：150mL分装到分装到12个已装有个已装有杜氏小管杜氏小管杜氏小管杜氏小管试管中，试管中，10mL/个个包扎，
8、包扎，112115灭菌灭菌30min 蛋白胨蛋白胨 1.5g 乳糖乳糖 1.5g 牛胆粉溶液牛胆粉溶液 30mL 0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液 2mL 水水 150mL pH 7.2 牛胆粉溶液制法：牛胆粉溶液制法：牛胆粉溶液制法：牛胆粉溶液制法：将将3g牛胆粉溶于牛胆粉溶于30mL水中，调水中，调pH至至7.07.5 BGLBBGLB制法：制法：制法：制法：先将蛋白胨、乳糖溶于约先将蛋白胨、乳糖溶于约100ml水中，加入牛胆粉溶液水中，加入牛胆粉溶液30mL，调节，调节pH，再加入，再加入0.1%煌绿水溶液，最后用水补足到煌绿水溶液，最后用水补足到150ml，用纱布过滤后，再分装到试管中。用
9、纱布过滤后，再分装到试管中。第8页，本讲稿共16页（二）其它器具（二）其它器具（每个组准备）每个组准备）移液管移液管 10mL 1支支/组组 1mL 10支支/组组第9页，本讲稿共16页五、实验步骤1、样品处理：、样品处理：以无菌操作，先用酒精棉球擦拭样品表面，以无菌操作，先用酒精棉球擦拭样品表面，用无菌剪刀将包装剪破，量取检样用无菌剪刀将包装剪破，量取检样25mL放放入入225mL灭菌生理盐水当中，充分振荡，混灭菌生理盐水当中，充分振荡，混合均匀，制成合均匀，制成10-1稀释度样品稀释度样品2、梯度稀释法依次稀释样品到、梯度稀释法依次稀释样品到10-4第10页，本讲稿共16页3、选择、选择1
10、0-2、10-3、10-4三个稀释度的样品均液，用无三个稀释度的样品均液，用无菌移液管分别吸取菌移液管分别吸取1mL到到LST发酵液试管中，每个发酵液试管中，每个稀释度做稀释度做3个平行（共个平行（共9管）管）。4、37培养培养48h5、观察、观察LST管中小倒管里管中小倒管里是否有气泡是否有气泡。如有气泡，则。如有气泡，则继续按照下述要求实验；如无气泡，则是大肠阴继续按照下述要求实验；如无气泡，则是大肠阴性管（性管（-）第11页，本讲稿共16页6、如、如LST小倒管中有气泡，则按照无菌操作要求，小倒管中有气泡，则按照无菌操作要求，用接种环将产气用接种环将产气LST发酵液接种到发酵液接种到BG
11、LB试管中，试管中，一只产气一只产气LST发酵液对应一只发酵液对应一只BGLB试管。试管。7、37培养培养48h8、观察、观察BGLB小倒管中是否有气泡，如有气泡，则记小倒管中是否有气泡，如有气泡，则记为大肠阳性管（为大肠阳性管（+）；如无气泡，则记为大肠阴性管）；如无气泡，则记为大肠阴性管（-）。）。第12页，本讲稿共16页大肠菌群计数检验流程大肠菌群计数检验流程0将产气的试管内样品将产气的试管内样品接种到接种到BGLB肉汤肉汤LST不产气（不产气（-）小导管里无气泡小导管里无气泡LST产气（产气（+）第13页，本讲稿共16页9 9、根据经确证后的对应浓度阳性管数查、根据经确证后的对应浓度阳
12、性管数查、根据经确证后的对应浓度阳性管数查、根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPNMPN表，报表，报表，报表，报告样品中大肠菌群告样品中大肠菌群告样品中大肠菌群告样品中大肠菌群MPNMPN值。值。值。值。阳性管数阳性管数阳性管数阳性管数MPNMPN95%95%可信限可信限可信限可信限0.100.100.010.010.0010.001下限下限下限下限上限上限上限上限0 00 00 03.011001100420420-第14页，本讲稿共16页五、实验结果与分析经查经查经查经查MPNMPN表，样品中大肠菌群数为表，样品中大肠菌群数为表，样品中大肠菌群数为表，样品中大肠菌群数为 MPN/gMPN/
13、g（mLmL）阳性管数阳性管数阳性管数阳性管数0.010.010.0010.0010.00010.0001LSTLST发酵管发酵管发酵管发酵管BGLBBGLB证实管证实管证实管证实管分析分析分析分析第15页，本讲稿共16页六、思考题1 1、MPNMPN是什么意思？是什么意思？是什么意思？是什么意思？MPNMPN法的定义是什么？法的定义是什么？法的定义是什么？法的定义是什么？2 2、大肠菌群的概念是什么、大肠菌群的概念是什么、大肠菌群的概念是什么、大肠菌群的概念是什么?它与它与它与它与E.coliE.coli是什么关系？是什么关系？是什么关系？是什么关系？3 3、大肠菌群的食品卫生学意义是什么？、大肠菌群的食品卫生学意义是什么？、大肠菌群的食品卫生学意义是什么？、大肠菌群的食品卫生学意义是什么？4 4、我国食品微生物检验指标有哪些？、我国食品微生物检验指标有哪些？、我国食品微生物检验指标有哪些？、我国食品微生物检验指标有哪些？第16页，本讲稿共16页