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1、实验五实验五 食品中大肠食品中大肠菌群的计数菌群的计数参考参考 GB4789 GB47893-20103-20101、了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。群测定在食品卫生检验中的意义。2、练习并掌握大肠菌群的检验方法、练习并掌握大肠菌群的检验方法。一、一、目的目的2广东科贸职业学院广东科贸职业学院二、原理二、原理1 1、大肠菌群、大肠菌群大肠菌群系指一群在大肠菌群系指一群在3737、2424小时能发酵乳小时能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌无芽孢杆菌。3广东科贸职业学院广东科贸
2、职业学院主要由肠杆菌科中主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属的的亚属细菌亚属细菌组成。组成。典型大肠杆菌的典型大肠杆菌的IMViCIMViC与硫化氢试验结果与硫化氢试验结果为为+-+-。4广东科贸职业学院广东科贸职业学院该菌主要来源于该菌主要来源于人畜粪便人畜粪便，故以此作为粪便污，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能
3、性。品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每食品中大肠菌群数系以每1 1g（或（或mL）检样内大肠）检样内大肠菌群最可能数菌群最可能数MPNMPN（themostprobablenumber-简简称称MPN）表示）表示2 2、测定的意义、测定的意义5广东科贸职业学院广东科贸职业学院三三、材料材料1 1、食品样品、食品样品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。或其他食品。2 2、阳性对照菌、阳性对照菌大肠杆菌大肠杆菌6广东科贸职业学院广东科贸职业学院除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备
4、和材料如下：其他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、恒温培养箱、恒温水浴箱、均质器、振荡均质器、振荡器、器、无菌吸管无菌吸管或微量移液器及吸头、或微量移液器及吸头、无菌锥无菌锥形瓶形瓶、无菌培养皿无菌培养皿、菌落计数器菌落计数器等。等。3、仪器设备仪器设备7广东科贸职业学院广东科贸职业学院月桂基硫酸盐胰蛋白胨（月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST LST）肉汤）肉汤、煌绿乳煌绿乳糖胆盐（糖胆盐（BGLB BGLB）肉汤）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)VRBA)、无菌生理盐水无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、或磷酸盐缓冲液、1mol/L1mol/L氢氧化钠氢氧化钠（NaOH)N
5、aOH)、1mol/L 1mol/L 盐酸（盐酸（HCI HCI)。4 4、培养基和试剂培养基和试剂8广东科贸职业学院广东科贸职业学院第一法第一法 大肠菌群大肠菌群MPNMPN计数法。计数法。第二法第二法 大肠菌群平板计数法。大肠菌群平板计数法。四、四、检验方法检验方法9广东科贸职业学院广东科贸职业学院试验流程试验流程10广东科贸职业学院广东科贸职业学院1 1、样品的稀释、样品的稀释（1 1）固体和半固体样品固体和半固体样品u称取称取25g25g 样品，放入盛有样品，放入盛有225ml225ml磷酸盐缓冲液或生理磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，盐水的无菌均质杯内，8 000r/min-1
6、0000r/min 8 000r/min-10000r/min 均均质质1 min-2 min 1 min-2 min，或放入盛有，或放入盛有225ml225ml磷酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 1 min-2 min min-2 min，制成，制成1:101:10 的样品匀液。的样品匀液。第一法第一法 大肠菌群大肠菌群MPNMPN计数法计数法11广东科贸职业学院广东科贸职业学院（2 2）液体样品液体样品以无菌吸管吸取以无菌吸管吸取25m25mL L样品，置盛有样品，置盛有225m225mL L磷酸盐缓冲液磷酸盐
7、缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:101:10 的样品匀液。的样品匀液。（3 3）样品匀液的样品匀液的pH pH 值应在值应在 之间，必要时分别之间，必要时分别用用1mol/L 1mol/L 氢氧化钠（氢氧化钠（NaOH NaOH）或）或1 mol/L 1 mol/L 盐酸盐酸（HCI HCI）调节。）调节。12广东科贸职业学院广东科贸职业学院13广东科贸职业学院广东科贸职业学院（4 4）用用1m1mL L无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:101:10 样品
8、匀液样品匀液1m1mL L，沿管壁缓缓注入，沿管壁缓缓注入9m9mL L磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 1 支支1m1mL L无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:1001:100 的样品匀液。的样品匀液。14广东科贸职业学院广东科贸职业学院（5 5）、）、根据对样品污染状况的估计，按上述根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成操作，依次制成1010倍递增系列倍递增系列稀释样品匀液。每稀释样品匀液。每递增
9、稀释递增稀释1 1 次，换用次，换用1 1 支支1m1mL L无菌吸管或吸头。无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过过15 min15 min 。15广东科贸职业学院广东科贸职业学院每个样品，选择每个样品，选择3 3 个个适宜的适宜的连续稀释度连续稀释度的样品匀的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 3 管管月桂基硫酸盐胰蛋白胨月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LSTLST）肉汤）肉汤，每管接种，每管接种1m1mL L（如接种量超过（如接种量超过1m1mL L，则用双料，则用双料LSTL
10、ST肉汤）肉汤）,361 361 培养培养24h24h2 2h h，观察倒管内是否有气，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至泡产生，如未产气则继续培养至48h2h 48h2h。2 2、初发酵试验初发酵试验16广东科贸职业学院广东科贸职业学院记录在记录在24h 24h 和和48h 48h 内产气的内产气的LST LST 肉汤管数。肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复产气者则进行复发酵试验发酵试验。17广东科贸职业学院广东科贸职业学院用接种环从所有用接种环从所有48h2h 48h2h 内内发酵产气的发酵产气的LST LST 肉汤肉汤管中分别取培养物管中分
11、别取培养物l l环，移种于煌绿乳糖胆盐环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLBBGLB）肉汤管中，肉汤管中，361 361 培养培养48h2h48h2h ，观，观察产气情况。察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管产气者，计为大肠菌群阳性管。3 3、复发酵试验复发酵试验18广东科贸职业学院广东科贸职业学院根据大肠菌群阳性管数，检索根据大肠菌群阳性管数，检索MPN MPN 表（见附录表（见附录B B)，报告，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN MPN 值值。注意：注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加
12、。的数也应相应减少或增加。4 4、大肠菌群最可能数（大肠菌群最可能数（MPN MPN）的报告）的报告19广东科贸职业学院广东科贸职业学院20广东科贸职业学院广东科贸职业学院大肠杆菌大肠杆菌0157显色显色培养基上培养基上的菌落的菌落21广东科贸职业学院广东科贸职业学院在伊红美兰乳糖在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上）上22广东科贸职业学院广东科贸职业学院大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征典型菌落为红典型菌落为红色色,菌落周围菌落周围有红色的胆盐有红色的胆盐沉淀环。菌落沉淀环。菌落直径为直径为 2-3mm 或更大。或更大。23广东科贸职业学院广东科贸职业学院大肠
13、菌群在结晶紫中性红琼脂大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上典型特征上典型特征典型菌落为紫典型菌落为紫红色红色,菌落周菌落周围有红色的胆围有红色的胆盐沉淀环。菌盐沉淀环。菌落直径为落直径为 0.5mm 或更或更大。大。24广东科贸职业学院广东科贸职业学院大肠杆菌在大肠杆菌在MFC琼脂上的典型特征琼脂上的典型特征25广东科贸职业学院广东科贸职业学院26广东科贸职业学院广东科贸职业学院试验流程试验流程27广东科贸职业学院广东科贸职业学院1 1、样品的稀释样品的稀释按第一法中的稀释方法进行。按第一法中的稀释方法进行。28广东科贸职业学院广东科贸职业学院（1 1）选取选取2 2个个3 3个适宜的连续
14、稀释度个适宜的连续稀释度，每个稀释，每个稀释度接种度接种两个无菌平皿两个无菌平皿，每皿每皿1m1mL L。同时分别取。同时分别取1m1mL L生生理盐水加入两个无菌平皿理盐水加入两个无菌平皿作空白对照作空白对照。（2 2）及时将及时将15 mL-20m15 mL-20mL L冷至冷至46 46 的的结晶紫中性结晶紫中性红胆盐琼脂（红胆盐琼脂（VRBA VRBA）约倾注于每个平皿中。小心约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，后，再加再加3 mL-4m3 mL-4mL LVRBAVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，覆盖平板
15、表层。翻转平板，置于置于36l 36l 培养培养18h-24h 18h-24h。2 2、平板计数平板计数29广东科贸职业学院广东科贸职业学院（3 3）平板菌落数的选择平板菌落数的选择选取菌落数在选取菌落数在1515-150-150 之间的平板，分别计数之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典典型菌落型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为淀环，菌落直径为0.5 mm 0.5 mm 或更大。或更大。2、平板计数平板计数30广东科贸职业学院广东科贸职业学院（4 4）、）、证实试验证实试验 从从VRB
16、A VRBA 平板上挑取平板上挑取10 10 个个不同类型的不同类型的典型和典型和可疑菌落可疑菌落，分别移种于，分别移种于BGLBBGLB 肉汤管内，肉汤管内，361 361 培养培养24h-48h24h-48h ，观察产气情况。凡，观察产气情况。凡BGLB BGLB 肉汤管肉汤管产气产气，即可报告为，即可报告为大肠菌群阳性大肠菌群阳性。2、平板计数平板计数31广东科贸职业学院广东科贸职业学院（5 5）大肠菌群平板计数的报告）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3 3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，）中计数的平板菌落数，再
17、乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。2、平板计数平板计数32广东科贸职业学院广东科贸职业学院例：例：10-4样样品稀品稀释释液液1 mL，在，在VRBA平板上平板上有有100个典型和可疑菌落，挑取个典型和可疑菌落，挑取 其中其中10个接种个接种BGLB肉肉汤汤管，管，证实证实有有6个阳个阳性管，性管，则该样则该样品的大品的大肠肠菌群数菌群数为为：1006/10104/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。）。33广东科贸职业学院广东科贸职业学院国标国标4789.3的的08版与版与03版主要不同版主要不同1 1、名称更改、名称更改 以以大
18、肠菌群计数大肠菌群计数代替原来的代替原来的大肠菌群测定。大肠菌群测定。2 2、增加增加了大肠菌群的了大肠菌群的平板计数法和纸片检测法。平板计数法和纸片检测法。3 3、大肠菌群的、大肠菌群的MPNMPN法以法以乳糖为主乳糖为主改为以改为以月桂基硫月桂基硫酸盐胰蛋白胨（酸盐胰蛋白胨（LSTLST）肉汤为主）肉汤为主的要培养基的的要培养基的MPNMPN法。法。4 4、大肠菌群的、大肠菌群的MPNMPN法中原法中原“报告每报告每100 ml 100 ml（或（或g g）大肠菌群的大肠菌群的MPNMPN值值”改为改为“报告每报告每1 ml 1 ml（或（或1g1g）大肠菌群的大肠菌群的MPNMPN值值”
19、。34广东科贸职业学院广东科贸职业学院比较区别比较区别GB/T4789.38-2008大肠杆菌的计数大肠杆菌的计数35广东科贸职业学院广东科贸职业学院03版版流程流程36广东科贸职业学院广东科贸职业学院37广东科贸职业学院广东科贸职业学院一、一、步骤步骤取样及稀释方法与菌落总数检验方法取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同相同，做成做成1:10的均匀稀释液为检样。的均匀稀释液为检样。38广东科贸职业学院广东科贸职业学院同一稀释度在做菌落总数测定的同时接同一稀释度在做菌落总数测定的同时接种乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏种乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照菌、产气肠杆菌混
20、合菌种作对照。39广东科贸职业学院广东科贸职业学院1、乳糖发酵试验乳糖发酵试验根据食品卫生要求或对检样污染程根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择度的估计，选择三个稀释度三个稀释度，每个稀释，每个稀释度接种度接种三管乳糖胆盐发酵管三管乳糖胆盐发酵管。40广东科贸职业学院广东科贸职业学院 接种量在接种量在1ml以上者以上者，用用双料乳糖胆盐双料乳糖胆盐发酵管发酵管，1ml及及1ml以下者以下者，用用单料乳糖胆盐单料乳糖胆盐发酵管发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵支作单料乳糖胆盐发酵管对照。管对照。
21、41广东科贸职业学院广东科贸职业学院置置361温箱培养温箱培养242小时小时，如所有发如所有发酵管都酵管都不产气不产气，则可报告为则可报告为大肠菌群阴大肠菌群阴性性，如如有产气者有产气者，则与对照的混合菌种则与对照的混合菌种一起一起按下列程序进行按下列程序进行。42广东科贸职业学院广东科贸职业学院2、分离培养分离培养将产气的发酵管分别在将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置琼脂）平板上划线分离。然后置361温箱内，培养温箱内，培养1824小时小时后取出后取出，观察观察菌落形态菌落形态，并作并作革兰氏染色革兰氏染色和和证实试证实试验验。43广东科贸职业学
22、院广东科贸职业学院可疑菌落特点：可疑菌落特点：具有金属光泽的深紫黑色菌落；具有金属光泽的深紫黑色菌落；不带或略带金属光泽的菌落；不带或略带金属光泽的菌落；中心色较深的淡紫黑色菌落。中心色较深的淡紫黑色菌落。44广东科贸职业学院广东科贸职业学院3、证实试验证实试验在上述平板上挑取可疑大肠菌落在上述平板上挑取可疑大肠菌落12个进行个进行革兰氏染色革兰氏染色，同时接种同时接种乳糖发酵乳糖发酵管管，置置361温箱培养温箱培养242小时小时,观察观察产气情况产气情况，凡凡乳糖管产气、革兰氏染色乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为即可报告为大肠大肠菌群阳性菌群阳性。45广
23、东科贸职业学院广东科贸职业学院 4、报告报告根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每表，报告每100ml（g）大肠菌群的）大肠菌群的MPN值。值。46广东科贸职业学院广东科贸职业学院二、结果二、结果根据证实大肠菌群的阳性管数根据证实大肠菌群的阳性管数，查查MPN检索表检索表(见附录见附录)报告每报告每100ml(克克)大肠菌群的最可能数大肠菌群的最可能数。47广东科贸职业学院广东科贸职业学院三、注意事项三、注意事项1、第一步乳糖胆盐发酵试验是样品的、第一步乳糖胆盐发酵试验是样品的发酵结果，发酵结果，不是纯菌的发酵试验不是纯菌的发酵试验，初发，初发酵阳性管
24、，经过后两步，有可能成为阴酵阳性管，经过后两步，有可能成为阴性。只做一步，会有相当多的合格样品性。只做一步，会有相当多的合格样品作为不合格处理，应注意。作为不合格处理，应注意。48广东科贸职业学院广东科贸职业学院 2、胆盐胆盐可抑制可抑制革兰氏革兰氏阳性菌的生长，阳性菌的生长，有利于大肠杆菌的生长繁殖。有利于大肠杆菌的生长繁殖。49广东科贸职业学院广东科贸职业学院 3 3、接种量在、接种量在1ml以上者以上者，用用双料双料乳糖胆乳糖胆盐发酵管盐发酵管，1ml及及1ml以下者以下者，用用单料单料乳糖胆乳糖胆盐发酵管。盐发酵管。50广东科贸职业学院广东科贸职业学院 4、大肠菌群菌落在、大肠菌群菌落
25、在EMB琼脂上琼脂上大多呈大多呈紫紫黑色有金属光泽或无金属光泽黑色有金属光泽或无金属光泽。应。应取典型菌落，取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。一般平板上有较多的大肠杆菌典型菌落，一般平板上有较多的大肠杆菌典型菌落，且且革兰氏染色革兰氏染色为阴性，可做出判定。为阴性，可做出判定。51广东科贸职业学院广东科贸职业学院 5、对初发酵时未产气的发酵管、对初发酵时未产气的发酵管有疑问时，可用手轻轻敲动或摇动试管，有疑问时，可用手轻轻敲动或摇动试管，如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产生，做进一步试验。生，做进一步试验。52
26、广东科贸职业学院广东科贸职业学院 6、MPN检索表是采用三个稀释检索表是采用三个稀释度九管法，较理想的结果是度九管法，较理想的结果是最低最低3管为阳性管为阳性，最高最高3管为阴性管为阴性。如无法估测样品中的菌数。如无法估测样品中的菌数时，应做一定范围的稀释度。时，应做一定范围的稀释度。53广东科贸职业学院广东科贸职业学院 7、MPN检索表只提供了检索表只提供了3个稀释个稀释度，若改用其它浓度时，表内数字应相应度，若改用其它浓度时，表内数字应相应增加或减少。增加或减少。54广东科贸职业学院广东科贸职业学院酱油（酱油（GB/T2717-2003）细菌菌落总数：细菌菌落总数：30000cfu/ml大
27、肠菌群：大肠菌群：30MPN/100ml肠道致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出55广东科贸职业学院广东科贸职业学院全脂奶粉、脱脂奶粉（全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）特级特级 一级一级 二级二级细菌菌落总数：细菌菌落总数：20000 30000 50000（cfu/ml）大肠菌群大肠菌群 40 90 90（MPN/100g）肠道致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出 不得检出不得检出 不得检出不得检出56广东科贸职业学院广东科贸职业学院巴氏杀菌乳（巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：细菌菌落总数：30000cfu/ml大肠菌群：大肠菌群：90MPN/100ml肠道
28、致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出57广东科贸职业学院广东科贸职业学院生活饮用水卫生标准（生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数菌落总数cfu/ml：100总大肠菌群总大肠菌群cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出耐热大肠菌群耐热大肠菌群cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出58广东科贸职业学院广东科贸职业学院瓶瓶(桶桶)装饮用纯净水卫生标准装饮用纯净水卫生标准(GB 17324-2003)细菌菌落总数细菌菌落总数cfu/ml：20大肠菌群大肠菌群MPN/100ml：3致病菌致病菌(肠道致病菌和致病性球菌肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出：不得检出霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出不得检出59广东科贸职业学院广东科贸职业学院60广东科贸职业学院广东科贸职业学院