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1、组织化学技术组织化学技术 江苏大学江苏大学江苏大学江苏大学 基础医学与医学技术学院基础医学与医学技术学院基础医学与医学技术学院基础医学与医学技术学院卢小东卢小东卢小东卢小东组织化学的基本概念：组织化学的基本概念：组织化学的基本概念：组织化学的基本概念：组组织织化化学学：组组组组织织织织水水水水平平平平，对对对对组组组组织织织织内内内内存存存存在在在在的的的的各各各各种种种种物物物物质质质质进进进进行行行行定定定定性性性性、定定定定量量量量以以以以及及及及其其其其局局局局部部部部的的的的和和和和移移移移动动动动的的的的部部部部位位位位分析的方法分析的方法分析的方法分析的方法 免疫组织化学：免疫组
2、织化学：免疫组织化学：免疫组织化学：基于抗原抗体反应基于抗原抗体反应基于抗原抗体反应基于抗原抗体反应 酶组织化学酶组织化学酶组织化学酶组织化学疾疾疾疾病病病病的的的的病病病病理理理理学学学学研研研研究究究究概概概概括括括括起起起起来来来来主主主主要要要要在在在在基基基基因因因因和和和和蛋蛋蛋蛋白白白白水平上进行的研究。水平上进行的研究。水平上进行的研究。水平上进行的研究。免免免免疫疫疫疫组组组组织织织织化化化化学学学学方方方方法法法法主主主主要要要要用用用用于于于于基基基基因因因因蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质水水水水平平平平表达的研究。表达的研究。表达的研究。表达的研究。蛋白表达蛋白表达蛋白表达蛋
3、白表达=分布，定位，定量；分布，定位，定量；分布，定位，定量；分布，定位，定量；蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等材料：材料：材料：材料：抗体：抗体：抗体：抗体：多多多多克克克克隆隆隆隆抗抗抗抗体体体体：为为为为针针针针对对对对多多多多个个个个抗抗抗抗原原原原决决决决定定定定簇簇簇簇的的的的抗抗抗抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。单单单单克克克克隆隆隆隆抗抗
4、抗抗体体体体：为为为为一一一一个个个个B B B B淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞分分分分化化化化增增增增殖殖殖殖产产产产 生生生生的的的的抗抗抗抗体体体体，可可可可识识识识别别别别有有有有限限限限的的的的抗抗抗抗原原原原决决决决定定定定簇簇簇簇，特特特特异异异异 性强。性强。性强。性强。显示物：显示物：显示物：显示物：酶标反应：酶标反应：酶标反应：酶标反应：碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AlkatineAlkatineAlkatineAlkatine phasphotase,APphasphotase,APphasphotase,APphasphotase,AP）APAPAPA
5、P与与与与不不不不同同同同的的的的底底底底物物物物（萘萘萘萘酚酚酚酚As-As-As-As-MxMxMxMx、快快快快蓝蓝蓝蓝、快快快快红红红红）作作作作用用用用，可可可可 形形形形 成成成成 不不不不 同同同同 颜颜颜颜 色色色色 的的的的 终终终终 产产产产 物物物物。用用用用 新新新新 品品品品 红红红红（New New New New fuchsinefuchsinefuchsinefuchsine）显显显显色色色色，可可可可形形形形成成成成不不不不溶溶溶溶于于于于有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂的的的的红红红红色色色色沉沉沉沉淀淀淀淀，不褪色。，不褪色。，不褪色。，不褪色。辣根过氧化
6、酶辣根过氧化酶辣根过氧化酶辣根过氧化酶(HorseradiseHorseradiseHorseradiseHorseradise peroaidaseperoaidaseperoaidaseperoaidase,),),),)HRPHRPHRPHRP：底底底底物物物物为为为为DABDABDABDAB四四四四盐盐盐盐酸酸酸酸二二二二氨氨氨氨基基基基联联联联苯苯苯苯胺胺胺胺，产产产产生生生生棕棕棕棕色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。荧光标记：荧光素标记抗体荧光标记：荧光素标记抗体荧光标记：荧光素标记抗体荧
7、光标记：荧光素标记抗体异异异异硫硫硫硫氰氰氰氰酸酸酸酸荧荧荧荧光光光光素素素素（FluorescienFluorescienFluorescienFluorescien isothioyaraleisothioyaraleisothioyaraleisothioyarale,FITCFITCFITCFITC）520520520520530nm530nm530nm530nm四四四四甲甲甲甲基基基基异异异异硫硫硫硫氰氰氰氰酸酸酸酸罗罗罗罗达达达达明明明明（TeramethyleTeramethyleTeramethyleTeramethyle rhodaminerhodaminerhodamine
8、rhodamine isothiecyanataisothiecyanataisothiecyanataisothiecyanata,TRITC,TRITC,TRITC,TRITC）620nm620nm620nm620nm四四四四乙乙乙乙基基基基罗罗罗罗达达达达明明明明（TeraethyleTeraethyleTeraethyleTeraethyle rhodaminerhodaminerhodaminerhodamine B200,B200,B200,B200,RB200RB200RB200RB200）590590590590600nm600nm600nm600nm胶体金：胶体金：胶体金：胶
9、体金：指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，免疫电镜观察免疫电镜观察免疫电镜观察免疫电镜观察 主要方法：主要方法：主要方法：主要方法：直接法：直接法：直接法：直接法：间接法：间接法：间接法：间接法：经过了第二抗体放大效应经过了第二抗体放大效应经过了第二抗体放大效应经过了第二抗体放大效应PAP法法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合
10、，然后以物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。酶底物反应检出。酶底物反应检出。酶底物反应检出。ABCABCABCABC法：法：法：法：生物素生物素生物素生物素（BiotinBiotinBiotinBiotin）和和和和卵白素卵白素卵白素卵白素（AvidinAvidinAvidinAvidin）为具有高为具有高为具有高为具有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4 4 4 4个生物
11、个生物个生物个生物素。当生物素标上特定的标记物质后素。当生物素标上特定的标记物质后素。当生物素标上特定的标记物质后素。当生物素标上特定的标记物质后orororor与抗体结与抗体结与抗体结与抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，而以适当方式显示。的结合反应，而以适当方式显示。的结合反应
12、，而以适当方式显示。的结合反应，而以适当方式显示。S-PS-PS-PS-P法（法（法（法（LSABLSABLSABLSAB）：）：）：）：采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织中的抗原。定细胞和组织中的抗原。定细胞和组织中的抗原。定细胞和组织中的抗原。EnvisionEnvisionEnv
13、isionEnvision：原理：第二抗体上标记有多聚物酶（原理：第二抗体上标记有多聚物酶（原理：第二抗体上标记有多聚物酶（原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or APHRP or APHRP or APHRP or AP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多的的的的HRPHRPHRPHRP分子，使信号有显著提高，敏感性较分子，使信号有显著提高，敏感性较分子，使信号有显著提高，敏感性较分子，使信号有显著提高，敏感性较PAPPAPPAPPAP法
14、，法，法，法，ABCABCABCABC法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方法更省时，简便。体孵育时间短，该方法更省时，简便。体孵育时间短，该方法更省时，简便。体孵育时间短，该方法更省时，简便。以以以以LSABLSABLSABLSAB法为例简单
15、介绍染色步骤：法为例简单介绍染色步骤：法为例简单介绍染色步骤：法为例简单介绍染色步骤：石蜡切片脱蜡水；石蜡切片脱蜡水；石蜡切片脱蜡水；石蜡切片脱蜡水；3%H3%H3%H3%H2 2 2 20 0 0 02 2 2 2抑制内源性过氧化物酶抑制内源性过氧化物酶抑制内源性过氧化物酶抑制内源性过氧化物酶15min15min15min15min；每张切片加每张切片加每张切片加每张切片加10-20ul10-20ul10-20ul10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育非免疫性动物血清，室温孵育非免疫性动物血清，室温孵育非免疫性动物血清，室温孵育5min5min5min5min；加特异性一抗，加特异性一抗，
16、加特异性一抗，加特异性一抗，373737370 0 0 0C C C C孵育孵育孵育孵育3030303060min60min60min60min，or 4or 4or 4or 40 0 0 0C C C C过夜；过夜；过夜；过夜；加加加加20ul20ul20ul20ul生物素标记的第二抗体，生物素标记的第二抗体，生物素标记的第二抗体，生物素标记的第二抗体，370C370C370C370C，30min30min30min30min；加加过过氧氧化化物物酶酶标标定定的的链链菌菌素素亲亲生生物物素素，37370 0C C，30min30min；以上每步后均用以上每步后均用PBSPBS液洗液洗33mi
17、n33min；用用过过氧氧化化物物酶酶基基质质液液（DABDAB基基质质液液）显显色色5 515min15min。在光镜下观察。在光镜下观察。自自来来水水冲冲洗洗，苏苏木木素素浅浅染染，自自来来水水冲冲洗洗还还蓝蓝，梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。免疫组化常见问题的处理：免疫组化常见问题的处理：免疫组化常见问题的处理：免疫组化常见问题的处理：组织材料的处理：组织材料的处理：组织材料的处理：组织材料的处理：固定液为：固定液为：固定液为：固定液为：10%10%10%10%中性福尔马林液；中性福尔马林液；中性福尔马林液；中性福尔马林液；4%
18、4%4%4%多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4PH7.4PH7.4PH7.4）；）；）；）；固定时间：固定时间：固定时间：固定时间：8-24hr8-24hr8-24hr8-24hr 组织大小：组织大小：组织大小：组织大小：2*1.5*0.3cm 2*1.5*0.3cm 2*1.5*0.3cm 2*1.5*0.3cm 防脱片处理：防脱片处理：防脱片处理：防脱片处理：多聚多聚-L-L-赖氨酸；赖氨酸；硫酸铬钾明胶液。硫酸铬钾明胶液。增强特异性染色的措施和方法：增强特异性染色的措施和方法：增强特异性染色的措施和方法：增强特异性染色的措施和方法：
19、1 1 1 1）蛋白酶消化：）蛋白酶消化：）蛋白酶消化：）蛋白酶消化：a a a a、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%0.05-0.1%0.05-0.1%0.05-0.1%）；）；）；）；b b b b、胃蛋白酶消化（、胃蛋白酶消化（、胃蛋白酶消化（、胃蛋白酶消化（0.4%0.4%0.4%0.4%）。）。）。）。2 2 2 2）热诱导的抗原修复：）热诱导的抗原修复：）热诱导的抗原修复：）热诱导的抗原修复：方法：微波方法：微波方法：微波方法：微波969696960 0 0 0C,10minC,10minC,10minC,10min；直接加温方法直接加温
20、方法直接加温方法直接加温方法 1001001001000 0 0 0C,10minC,10minC,10minC,10min；高压锅高压锅高压锅高压锅 1201201201200 0 0 0C,10minC,10minC,10minC,10min；热处理液：热处理液：热处理液：热处理液：0.01mol/L PH6.0 0.01mol/L PH6.0 0.01mol/L PH6.0 0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 合适的抗体稀释度：合适的抗体稀释度：合适的抗体稀释度：合适的抗体稀释度：过高，过低均会导致阴性结果。过高，过低均会导致阴性结果。即用型
21、抗体；即用型抗体；浓缩型。浓缩型。减少或消除非特异性染色的方法：减少或消除非特异性染色的方法：减少或消除非特异性染色的方法：减少或消除非特异性染色的方法：非特异性染色：非特异性染色：原因：原因：方法：方法：对照：对照：阳阳性性对对照照：用用一一直直抗抗原原阳阳性性的的切切片片与与待待测测标标本本同同时时进进行行免免疫疫细细胞胞化化学学染染色色，阳阳性性对对照应呈阳性结果，即为阳性对照。照应呈阳性结果，即为阳性对照。阴阴性性对对照照：用用不不含含一一直直抗抗原原的的标标本本作作对对照照，实实验验结结果果为为阴阴性性，即即为为阴阴性性对对照照。阴阴性性对对照照中中还还包包括括空空白白对对照照、替替
22、代代对对照照、吸吸收收和和抑抑制对照等，用以排除假阳性结果。制对照等，用以排除假阳性结果。免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并表面型。阳性细胞显色
23、深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。以此作为定性、定量和定位的依据。以此作为定性、定量和定位的依据。以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可显著区别。是累及一片细胞，两者可显著区别。是累及一片细胞，两者可显著区别
24、。是累及一片细胞，两者可显著区别。阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色分布有三种：阳性细胞的染色分布有三种：阳性细胞的染色分布有三种：阳性细胞的染色分布有三种：胞浆；细胞核；细胞膜表面胞浆；细胞核；细胞膜表面胞浆；细胞核；细胞膜表面胞浆；细胞核；细胞膜表面 阳性细胞分布：阳性细胞分布：阳性细胞分布：阳性细胞分布：灶性；弥漫性灶性；弥漫性灶性；弥漫性灶性；弥漫性 染色强度不一染色强度不一染色强度不一染色强度不一 切片边缘，刀痕切片边缘，刀痕切片边缘，刀痕切片边缘，刀痕orororor组织折叠，坏死，挤压区，组织折叠，坏死，挤压区，组织折叠
25、，坏死，挤压区，组织折叠，坏死，挤压区，胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。对于阳性结果的定量判断：对于阳性结果的定量判断：对于阳性结果的定量判断：对于阳性结果的定量判断：-，+，+，+等分级和计数统计等分级和计数统计等分级和计数统计等分级和计数统计 淋巴细胞标记物淋巴细胞标记物：白细胞共同抗原（白细胞共同抗原（LCA,CD45LCA,CD45）：主要分布于）：主要分布于T,BT,B细胞，细胞，单核细胞，粒细胞表面。单核细胞，粒细胞表面。CD20CD20：B B细
26、胞标记物。细胞标记物。CD45ROCD45RO、CD3CD3：T T细胞标记物。细胞标记物。CD57CD57：为自然杀伤细胞的标记物。：为自然杀伤细胞的标记物。CD38CD38：为浆细胞的标记物。：为浆细胞的标记物。CD68CD68：主要标记各种组织中的巨噬细胞。：主要标记各种组织中的巨噬细胞。神经内分泌标记物：神经内分泌标记物：嗜铬素嗜铬素A A（Chromogranin,CgAChromogranin,CgA）：）：存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。突触素（突触素（Synaptophysin,SySynaptophysin,Sy）：）：存在于神
27、经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞，存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞，神经内分泌细胞中。神经内分泌细胞中。髓磷脂硷性蛋白（髓磷脂硷性蛋白（Myelin basic protein,MBPMyelin basic protein,MBP）：）：激素及激素受体类标记：激素及激素受体类标记：雄激素受体（雄激素受体（Androgen receptor,ARAndrogen receptor,AR）：）：雌激素受体（雌激素受体（Estrogen receptor,EREstrogen receptor,ER）孕激素受体（孕激素受体（Progesterone receptor,PRProgest
28、erone receptor,PR）：）：垂体激素：垂体激素：ACTH,GH,PRL,LH,TSH ACTH,GH,PRL,LH,TSH 主要用于垂体腺瘤的功能分类。主要用于垂体腺瘤的功能分类。降钙素（降钙素（Calcitotin,CTCalcitotin,CT）：）：甲状腺旁细胞（甲状腺旁细胞（C C细胞）分泌。细胞）分泌。以上抗体及标记物主要用于疾病的病理诊断和鉴别诊断以上抗体及标记物主要用于疾病的病理诊断和鉴别诊断 其联合应用的作用和意义：其联合应用的作用和意义：Keratin Vimentin 上皮性肿瘤 Keratin 滑膜肿瘤 Vimentin 间皮肿瘤 上皮样肉瘤 癌肉瘤 Des
29、or Actin 肌源性肿瘤肌源性肿瘤 CD34or F 血管性肿瘤血管性肿瘤 Keratin S-100or MBP 神经鞘膜瘤神经鞘膜瘤Vimentin LCA 淋巴细胞淋巴细胞 AACT 骨肿瘤、纤维组织细胞肿瘤骨肿瘤、纤维组织细胞肿瘤 GFAP 胶质细胞肿瘤胶质细胞肿瘤 Keratin NSEor Sy Vimentin NF 节细胞神经母细胞瘤节细胞神经母细胞瘤免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则：免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则：免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HEHE染色的染色的 形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把形态学为基
30、础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把 免疫组化染色作为诊断的免疫组化染色作为诊断的“金标准金标准”。免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学为准。为准。电子显微镜技术：透射电镜电子显微镜技术：透射电镜透射电镜透射电镜扫描电镜扫描电镜电子显微镜技术电子显微镜技术透射电镜透射电镜扫描电镜扫描电镜 固定：固定：为了尽量保存样本的原样使用戊二醛为了尽量保存样本的原样使用戊二醛来硬化样本和使用锇
31、酸来染色。来硬化样本和使用锇酸来染色。冷固定：将样本放在液态的乙烷中速冻，这冷固定：将样本放在液态的乙烷中速冻，这样水不会结晶，而形成非晶体的样水不会结晶，而形成非晶体的 脱干：脱干：使用乙醇和丙酮来取代水。使用乙醇和丙酮来取代水。包埋：包埋：树脂树脂 超薄切片：超薄切片：将样本使用金刚石刃切成薄片。将样本使用金刚石刃切成薄片。染色：染色：重的原子如铅或铀比轻的原子散射电重的原子如铅或铀比轻的原子散射电子的能力高，因此可被用来提高对比度。子的能力高，因此可被用来提高对比度。名词解释：分辨率 免疫组织化学技术 HE染色问答题：1.石蜡切片主要经过哪些步骤？2.列举观察组织器官细微结构的染色方法，并说明其优缺点