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1、关于免疫组化技术课件现在学习的是第1页，共45页组织化学的基本概念：组织化学的基本概念：组组织织化化学学：组组组组织织织织水水水水平平平平，对对对对组组组组织织织织内内内内存存存存在在在在的的的的各各各各种种种种物物物物质质质质进进进进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法 免疫组织化学：免疫组织化学：免疫组织化学：免疫组织化学：基于抗原抗体反应基于抗原抗体反应基于抗原抗体反应基于抗原抗体反应 酶组织化学酶组织化学酶组织化学酶组织化学现在学习的是第2
2、页，共45页疾疾病病的的病病理理学学研研究究概概括括起起来来主主要要在在基基因因和和蛋蛋蛋蛋白白白白水水水水平平平平上进行的研究。上进行的研究。上进行的研究。上进行的研究。免免疫疫组组织织化化学学方方方方法法法法主主主主要要要要用用用用于于于于基基基基因因因因蛋蛋白白质质水水水水平平平平表表表表达达达达的研究。的研究。的研究。的研究。蛋白表达蛋白表达蛋白表达蛋白表达=分布，定位，定量；分布，定位，定量；分布，定位，定量；分布，定位，定量；蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等现在学
3、习的是第3页，共45页材料：材料：材料：材料：抗体：抗体：多多多多克克克克隆隆隆隆抗抗抗抗体体体体：为为针针对对多多个个抗抗原原决决定定簇簇的的抗抗 体体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。单单单单克克克克隆隆隆隆抗抗抗抗体体体体：为为一一个个B B淋淋巴巴细细胞胞分分化化增增殖殖产产 生生的的抗抗体体，可可识识别别有有限限的的抗抗原原决决定定簇簇，特特异异 性性强。强。现在学习的是第4页，共45页显示物：显示物：酶标反应：酶标反应：碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,APAlkatine phasphotase
4、,APAlkatine phasphotase,APAlkatine phasphotase,AP）APAPAPAP与与与与不不不不同同同同的的的的底底底底物物物物（萘萘萘萘酚酚酚酚As-MxAs-MxAs-MxAs-Mx、快快快快蓝蓝蓝蓝、快快快快红红红红）作作作作用用用用，可可可可形形形形成成成成不不不不同同同同颜颜颜颜色色色色的的的的终终终终产产产产物物物物。用用用用新新新新品品品品红红红红（New New New New fuchsinefuchsinefuchsinefuchsine）显显显显色色色色，可可可可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色
5、。形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。辣根过氧化酶辣根过氧化酶辣根过氧化酶辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,)(Horseradise peroaidase,)(Horseradise peroaidase,)(Horseradise peroaidase,)HRPHRP：底底物物为为DABDAB四四盐盐酸酸二二氨氨基基联联苯苯胺胺，产产生生棕棕色色沉沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。淀，不溶于有机溶剂，不褪色。现在学习的是第5页，共45页HRPHRP现在学习的是第6页，共45页APAPHEHE现在学习的是第7页，共45页荧光标记：
6、荧光素标记抗体荧光标记：荧光素标记抗体荧光标记：荧光素标记抗体荧光标记：荧光素标记抗体异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素（Fluorescien Fluorescien isothioyarale,isothioyarale,FITCFITC）520520530nm530nm 四四四四 甲甲甲甲 基基基基 异异异异 硫硫硫硫 氰氰氰氰 酸酸酸酸 罗罗罗罗 达达达达 明明明明（Teramethyle Teramethyle Teramethyle Teramethyle rhodamine rhodamine rhodamine rhodamine isothiecyanata,TRITCisothi
7、ecyanata,TRITCisothiecyanata,TRITCisothiecyanata,TRITC）620nm620nm620nm620nm四四 乙乙 基基 罗罗 达达 明明（Teraethyle Teraethyle rhodamine rhodamine B200,B200,RB200RB200）590590600nm600nm现在学习的是第8页，共45页现在学习的是第9页，共45页胶体金：胶体金：胶体金：胶体金：指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，免疫电镜
8、观察免疫电镜观察 现在学习的是第10页，共45页主要方法：主要方法：直接法：直接法：直接法：直接法：间接法：间接法：经过了第二抗体放大效应经过了第二抗体放大效应PAPPAP法：法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，通过以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，通过以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，通过以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。现在学习的是第11页，共45页现在学
9、习的是第12页，共45页ABCABC法：法：生物素生物素（BiotinBiotin）和）和卵白素卵白素卵白素卵白素（AvidinAvidin）为具有高度）为具有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4 4个生物素。个生物素。当生物素标上特定的标记物质后当生物素标上特定的标记物质后oror与抗体结合后仍与抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，后与卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，而以适当方式显示。而以适当方式显示。现在学习的是第13页，共45页S-
10、PS-P法（法（LSABLSAB）：）：采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋白连接采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋白连接采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋白连接采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织中的抗原。中的抗原。中的抗原。中的抗原。现在学习的是第14页，共45页EnvisionEnvision法（二步法）：法（二步法）：原理：第二抗体上标记有多聚物酶（原理：第二抗体
11、上标记有多聚物酶（HRP or HRP or APAP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多的合许多的HRPHRP分子，使信号有显著提高，敏感性较分子，使信号有显著提高，敏感性较PAPPAP法，法，ABCABC法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多聚物酶人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方法更省时，分子结合的第二抗体孵育时间短，该方法更省时，简便。简便。现在学习的是第15页，共45页以以LSABLSAB法为例简单介绍染色步骤：法为例简
12、单介绍染色步骤：石蜡切片脱蜡水；石蜡切片脱蜡水；石蜡切片脱蜡水；石蜡切片脱蜡水；3%H3%H3%H3%H2 20 0 0 02 2 2 2抑制内源性过氧化物酶抑制内源性过氧化物酶15min15min；每张切片加每张切片加每张切片加每张切片加10-20ul10-20ul10-20ul10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育非免疫性动物血清，室温孵育非免疫性动物血清，室温孵育非免疫性动物血清，室温孵育5min5min5min5min；加特异性一抗，加特异性一抗，37370 0C C C C孵育孵育孵育孵育3030303060min60min60min60min，or 4or 4or 4or 40
13、0C C C C过夜；过夜；过夜；过夜；加加加加20ul20ul20ul20ul生物素标记的第二抗体，生物素标记的第二抗体，生物素标记的第二抗体，生物素标记的第二抗体，370C370C370C370C，30min30min；现在学习的是第16页，共45页加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素，加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素，37370 0C C，30min30min；以上每步后均用以上每步后均用PBSPBS液洗液洗33min33min；用用过过氧氧化化物物酶酶基基质质液液（DABDAB基基质质液液）显显色色5 515min15min。在在光光镜下观察。镜下观察。自自来来水水冲冲洗洗，苏苏木木素素浅
14、浅染染，自自来来水水冲冲洗洗还还蓝蓝，梯梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。现在学习的是第17页，共45页免疫组化常见问题的处理：免疫组化常见问题的处理：组织材料的处理：组织材料的处理：固定液为：固定液为：10%10%中性福尔马林液；中性福尔马林液；4%4%多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4PH7.4）；）；固定时间：固定时间：固定时间：固定时间：8-24hr8-24hr8-24hr8-24hr 组织大小：组织大小：2*1.5*0.3cm 2*1.5*0.3cm 现在学习的是第18页，共45页防脱片处理：防脱片处理：防脱片处
15、理：防脱片处理：多聚多聚-L-L-赖氨酸；赖氨酸；硫酸铬钾明胶液。硫酸铬钾明胶液。现在学习的是第19页，共45页增强特异性染色的措施和方法：增强特异性染色的措施和方法：增强特异性染色的措施和方法：增强特异性染色的措施和方法：1 1）蛋白酶消化：）蛋白酶消化：a a a a、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%0.05-0.1%）；）；b b、胃蛋白酶消化（、胃蛋白酶消化（0.4%0.4%）。）。2 2）热诱导的抗原修复：）热诱导的抗原修复：方法：微波方法：微波方法：微波方法：微波969696960 0C,10minC,10minC,10minC,10mi
16、n；直接加温方法直接加温方法直接加温方法直接加温方法 100 100 100 1000 0 0 0C,10minC,10min；高压锅高压锅高压锅高压锅 120 120 120 1200 0 0 0C,10minC,10minC,10minC,10min；热处理液：热处理液：0.01mol/L PH6.0 0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 现在学习的是第20页，共45页合适的抗体稀释度：合适的抗体稀释度：过高，过低均会导致阴性结果。过高，过低均会导致阴性结果。即用型抗体；即用型抗体；浓缩型。浓缩型。现在学习的是第21页，共45页减少或消除非特异性染色的方法：减少或消除非
17、特异性染色的方法：减少或消除非特异性染色的方法：减少或消除非特异性染色的方法：非特异性染色：非特异性染色：原因：原因：方法：方法：现在学习的是第22页，共45页现在学习的是第23页，共45页对照：对照：阳阳性性对对照照：用用一一直直抗抗原原阳阳性性的的切切片片与与待待测测标标本本同同时时进进行行免免疫疫细细胞胞化化学学染染色色，阳阳性性对对照照应应呈呈阳阳性性结结果，即为阳性对照。果，即为阳性对照。阴阴性性对对照照：用用不不含含一一直直抗抗原原的的标标本本作作对对照照，实实验验结结果果为为阴阴性性，即即为为阴阴性性对对照照。阴阴性性对对照照中中还还包包括括空空白白对对照照、替替代代对对照照、吸
18、吸收收和和抑抑制制对对照照等，用以排除假阳性结果。等，用以排除假阳性结果。现在学习的是第24页，共45页染色染色特异性染色特异性染色非特异性染色非特异性染色显色部位显色部位特定细胞或间质特定细胞或间质细胞和间质均匀染色或更强细胞和间质均匀染色或更强显色定位显色定位特定，具有结构性特定，具有结构性无特定部位，无结构性无特定部位，无结构性显色程度显色程度同一部位呈不同程度显同一部位呈不同程度显色色无分布规律，某一片均匀着无分布规律，某一片均匀着色色 免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面染色分布有三种
19、类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可显著区别。及一片细胞，两者可显著区别。现在学习的是第25页，共45页阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色分布有三种：阳性细胞的染色分布有三种：胞浆；细胞核；细胞膜表面胞浆；细胞核；细胞膜表面胞浆；细
20、胞核；细胞膜表面胞浆；细胞核；细胞膜表面 阳性细胞分布：阳性细胞分布：阳性细胞分布：阳性细胞分布：灶性；弥漫性灶性；弥漫性 染色强度不一染色强度不一 切片边缘，刀痕切片边缘，刀痕切片边缘，刀痕切片边缘，刀痕orororor组织折叠，坏死，挤压区，胶原组织折叠，坏死，挤压区，胶原组织折叠，坏死，挤压区，胶原组织折叠，坏死，挤压区，胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。对于阳性结果的定量判断：对于阳性结果的定量判断：对于阳性结果的定量判断：对于阳性结果的定量判断：-，+，+，+等分
21、级和计数统计等分级和计数统计 现在学习的是第26页，共45页垂体腺瘤垂体腺瘤 ACTH ACTH现在学习的是第27页，共45页乳腺癌乳腺癌 c-erbB-2 c-erbB-2现在学习的是第28页，共45页免疫组化A细胞B细胞D细胞现在学习的是第29页，共45页上皮性肿瘤标记上皮性肿瘤标记上皮性肿瘤标记上皮性肿瘤标记 上皮膜抗原（上皮膜抗原（上皮膜抗原（上皮膜抗原（EMAEMAEMAEMA）：）：）：）：广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。癌胚抗原（癌胚抗原（癌胚抗原（癌胚抗原（C
22、EACEACEACEA）：）：）：）：主要存在于胎儿消化道上皮，主要存在于胎儿消化道上皮，主要存在于胎儿消化道上皮，主要存在于胎儿消化道上皮，胰腺以及绝大部分内脏癌。胰腺以及绝大部分内脏癌。胰腺以及绝大部分内脏癌。胰腺以及绝大部分内脏癌。前列腺特异性抗原（前列腺特异性抗原（前列腺特异性抗原（前列腺特异性抗原（PSAPSAPSAPSA）：）：）：）：甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFPAFPAFP）：）：）：）：甲状腺球蛋白（甲状腺球蛋白（甲状腺球蛋白（甲状腺球蛋白（TgTgTgTg）：）：）：）：现在学习的是第30页，共45页软组织标记软组织标记 软组织：全身各处的纤维结缔组织
23、，脂肪组织，软组织：全身各处的纤维结缔组织，脂肪组织，肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。肌动蛋白（肌动蛋白（ActinActin）：分布于所有的肌型细胞中）：分布于所有的肌型细胞中 肌红蛋白（肌红蛋白（MyoglobinMyoglobin）：是骨骼肌肌浆中的一种）：是骨骼肌肌浆中的一种 可溶性蛋白，具有较高组织特异性。可溶性蛋白，具有较高组织特异性。现在学习的是第31页，共45页内皮细胞标记内皮细胞标记CD34CD34：主要标记内皮细胞；：主要标记内皮细胞；亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。第八因子相关抗原（第八因子相
24、关抗原（Factor-related antigen,F-RAgFactor-related antigen,F-RAg）：）：血管瘤阳性表达程度强于血管肉瘤。血管瘤阳性表达程度强于血管肉瘤。CD34 CD34优于优于F-RAgF-RAg。溶菌酶（溶菌酶（LysozymeLysozyme）：为组织细胞及其肿瘤的标记物。）：为组织细胞及其肿瘤的标记物。抗胰糜蛋白酶（抗胰糜蛋白酶（AAcTAAcT）：主要用于恶纤组的诊断。）：主要用于恶纤组的诊断。现在学习的是第32页，共45页淋巴细胞标记物淋巴细胞标记物：白细胞共同抗原（白细胞共同抗原（LCA,CD45LCA,CD45）：主要分布于）：主要分布于
25、T,BT,B细胞，细胞，单核细胞，粒细胞表面。单核细胞，粒细胞表面。CD20CD20：B B细胞标记物。细胞标记物。CD45ROCD45RO、CD3CD3：T T细胞标记物。细胞标记物。CD57CD57：为自然杀伤细胞的标记物。：为自然杀伤细胞的标记物。CD38CD38：为浆细胞的标记物。：为浆细胞的标记物。CD68CD68：主要标记各种组织中的巨噬细胞。：主要标记各种组织中的巨噬细胞。现在学习的是第33页，共45页神经内分泌标记物：神经内分泌标记物：嗜铬素嗜铬素A A（Chromogranin,CgAChromogranin,CgA）：）：存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。存在于神经元
26、，神经内分泌细胞及其肿瘤中。突触素（突触素（Synaptophysin,SySynaptophysin,Sy）：）：存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞，存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞，神经内分泌细胞中。神经内分泌细胞中。髓磷脂硷性蛋白（髓磷脂硷性蛋白（Myelin basic protein,MBPMyelin basic protein,MBP）：）：现在学习的是第34页，共45页激素及激素受体类标记：激素及激素受体类标记：雄激素受体（雄激素受体（Androgen receptor,ARAndrogen receptor,AR）：）：雌激素受体（雌激素受体（Estroge
27、n receptor,EREstrogen receptor,ER）孕激素受体（孕激素受体（Progesterone receptor,PRProgesterone receptor,PR）：）：垂体激素：垂体激素：ACTH,GH,PRL,LH,TSH ACTH,GH,PRL,LH,TSH 主要用于垂体腺瘤的功能分类。主要用于垂体腺瘤的功能分类。降钙素（降钙素（Calcitotin,CTCalcitotin,CT）：）：甲状腺旁细胞（甲状腺旁细胞（C C细胞）分泌。细胞）分泌。现在学习的是第35页，共45页以上抗体及标记物主要用于疾病的病理诊断和鉴别诊断以上抗体及标记物主要用于疾病的病理诊断和
28、鉴别诊断 其联合应用的作用和意义：其联合应用的作用和意义：Keratin Vimentin 上皮性肿瘤 Keratin 滑膜肿瘤 Vimentin 间皮肿瘤 上皮样肉瘤 癌肉瘤 现在学习的是第36页，共45页 Desor Actin 肌源性肿瘤肌源性肿瘤 CD34or F 血管性肿瘤血管性肿瘤 Keratin S-100or MBP 神经鞘膜瘤神经鞘膜瘤Vimentin LCA 淋巴细胞淋巴细胞 AACT 骨肿瘤、纤维组织细胞肿瘤骨肿瘤、纤维组织细胞肿瘤 GFAP 胶质细胞肿瘤胶质细胞肿瘤 Keratin NSEor Sy Vimentin NF 节细胞神经母细胞瘤节细胞神经母细胞瘤现在学习的
29、是第37页，共45页免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则：免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则：免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HEHE染色的染色的 形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把 免疫组化染色作为诊断的免疫组化染色作为诊断的“金标准金标准”。免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学为准。免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形
30、态学为准。现在学习的是第38页，共45页涂片涂片现在学习的是第39页，共45页磨片磨片骨骨bone现在学习的是第40页，共45页电子显微镜技术：透射电镜电子显微镜技术：透射电镜现在学习的是第41页，共45页透射电镜透射电镜扫描电镜扫描电镜电子显微镜技术电子显微镜技术现在学习的是第42页，共45页透射电镜透射电镜扫描电镜扫描电镜现在学习的是第43页，共45页固定：固定：为了尽量保存样本的原样使用戊二醛为了尽量保存样本的原样使用戊二醛来硬化样本和使用锇酸来染色。来硬化样本和使用锇酸来染色。冷固定：将样本放在液态的乙烷中速冻，这冷固定：将样本放在液态的乙烷中速冻，这样水不会结晶，而形成非晶体的样水不会结晶，而形成非晶体的脱干：脱干：使用乙醇和丙酮来取代水。使用乙醇和丙酮来取代水。包埋：包埋：树脂树脂超薄切片：超薄切片：将样本使用金刚石刃切成薄片。将样本使用金刚石刃切成薄片。染色：染色：重的原子如铅或铀比轻的原子散射电重的原子如铅或铀比轻的原子散射电子的能力高，因此可被用来提高对比度。子的能力高，因此可被用来提高对比度。现在学习的是第44页，共45页感感谢谢大大家家观观看看26.09.2022现在学习的是第45页，共45页