免疫组化课件.ppt

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1、中心实验室 李三华关于免疫组化现在学习的是第1页，共29页中心实验室 李三华 一一 免疫组织（细胞）化学的概念免疫组织（细胞）化学的概念 免疫组织化学（免疫组织化学（免疫组织化学（免疫组织化学（ImmunohistochemistryImmunohistochemistryImmunohistochemistryImmunohistochemistry，IHCIHCIHCIHC）又称免疫细胞化学（又称免疫细胞化学（immunocytochemistryimmunocytochemistryimmunocytochemistryimmunocytochemistry，ICCICCICCICC），

2、组），组），组），组织化学的分支。织化学的分支。织化学的分支。织化学的分支。利用利用利用利用抗原抗原抗原抗原与与与与抗体抗体抗体抗体特异性结合的原理，通过化学反应使连特异性结合的原理，通过化学反应使连特异性结合的原理，通过化学反应使连特异性结合的原理，通过化学反应使连接在抗体接在抗体接在抗体接在抗体/抗原上的抗原上的标记物标记物标记物标记物的的显色来确定组织细胞内抗显色来确定组织细胞内抗原原/抗体，对其进行定位、定性及定量的研究技术。抗体，对其进行定位、定性及定量的研究技术。现在学习的是第2页，共29页中心实验室 李三华 应用应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质凡是组织细胞内具有抗原性的物质（

3、肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素、（肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素、神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均可神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均可用免疫组织化学方法显示而进行用免疫组织化学方法显示而进行定性定性、定定位位分析或分析或定量定量研究，进而深入研究其功研究，进而深入研究其功能。能。解决三大问题：解决三大问题：有没有？有没有？在哪里？在哪里？多与少？多与少？现在学习的是第3页，共29页中心实验室 李三华 特点特点 优点优点 特异性强，定位准；特异性强，定位准；特异性强，定位准；特异性强，定位准；结果直观；结果直观；结果直观；结果直观；形态学改变与功能和代谢相结合；形态学改变与功能和代谢

4、相结合；形态学改变与功能和代谢相结合；形态学改变与功能和代谢相结合；组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。缺点缺点缺点缺点 步骤多，影响实验成败的因素多；步骤多，影响实验成败的因素多；以定位以定位、定性和半定量研究为主，绝对定量定性和半定量研究为主，绝对定量 分析尚需标准化。分析尚需标准化。现在学习的是第4页，共29页中心实验室 李三华 二二 免疫组化技术的基本步骤免疫组化技术的基本步骤1.1.制片制片 组织切片组织切片组织切片组织切片(石蜡切片、冰冻切片石蜡切片、冰冻切片石蜡切片、冰冻切

5、片石蜡切片、冰冻切片)细胞爬片细胞爬片细胞爬片细胞爬片 组织印片组织印片组织印片组织印片 血液涂片血液涂片血液涂片血液涂片2.2.抗原抗体反应标记物的显色（反应）抗原抗体反应标记物的显色（反应）3.3.指标检测分析指标检测分析 采集图像数据测量结果分析采集图像数据测量结果分析 现在学习的是第5页，共29页中心实验室 李三华石蜡切片细胞爬片现在学习的是第6页，共29页中心实验室 李三华 三三 免疫组化的分类免疫组化的分类（1 1）根据标记物的性质）根据标记物的性质 必要性：组织细胞内必要性：组织细胞内AgAbAgAb结合反结合反 应一般是不可见的，若在镜下检测，应一般是不可见的，若在镜下检测，则

6、必须具有颜色的标记物。则必须具有颜色的标记物。现在学习的是第7页，共29页中心实验室 李三华 酶酶 原理：基于酶与底物发生反应并产生原理：基于酶与底物发生反应并产生不溶性不溶性有色有色产物。产物。特点：不需要特殊的显微镜；特点：不需要特殊的显微镜；染色后的标本可长期保存；染色后的标本可长期保存；可以进行复染，使形态更明确；可以进行复染，使形态更明确；可根据酶和底物的不同而显示不同的颜可根据酶和底物的不同而显示不同的颜 色，易进行双重或多重染色。色，易进行双重或多重染色。现在学习的是第8页，共29页中心实验室 李三华 常用酶常用酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（Horseradise peroai

7、daseHorseradise peroaidaseHorseradise peroaidaseHorseradise peroaidase，HRP)HRP)HRP)HRP)底物：底物：DAB(DAB(四盐酸二氨基联苯胺四盐酸二氨基联苯胺四盐酸二氨基联苯胺四盐酸二氨基联苯胺)，产物为，产物为，产物为，产物为棕褐色棕褐色。碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,APAlkatine phasphotase,AP）底物：底物：NBTNBT（四氮唑蓝），产物为（四氮唑蓝），产物为紫蓝色紫蓝色。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GODglucoseoxdas

8、e,GOD）底物：葡萄糖，产物为底物：葡萄糖，产物为蓝色蓝色。注意：注意：DABDAB有潜在的致突变作用有潜在的致突变作用有潜在的致突变作用有潜在的致突变作用现在学习的是第9页，共29页中心实验室 李三华 荧光素荧光素 原理：吸收特定范围波长的光而激发其原理：吸收特定范围波长的光而激发其自身发出另一范围波长（颜色）的光。自身发出另一范围波长（颜色）的光。特点：需要荧光显微镜观察结果；特点：需要荧光显微镜观察结果；标本不能长期保存；标本不能长期保存；敏感性高，背景低；敏感性高，背景低；标本可以用多种荧光素标记。标本可以用多种荧光素标记。现在学习的是第10页，共29页中心实验室 李三华 常用荧光素

9、常用荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 (fluoresceinisothiocyanate,FITC)(fluoresceinisothiocyanate,FITC)(fluoresceinisothiocyanate,FITC)(fluoresceinisothiocyanate,FITC)，最大吸收光波长为，最大吸收光波长为，最大吸收光波长为，最大吸收光波长为490490490490495nm495nm495nm495nm，最大发射光波长为，最大发射光波长为520520530nm530nm530nm530nm，呈明亮的，呈明亮的，呈明亮的，呈明亮的黄绿色黄绿色。四乙基罗丹明四乙基罗丹明四

10、乙基罗丹明四乙基罗丹明 (rhodamine,RB200(rhodamine,RB200），最大吸收光波长为），最大吸收光波长为），最大吸收光波长为），最大吸收光波长为 570nm570nm570nm570nm，最大发射光波长为，最大发射光波长为，最大发射光波长为，最大发射光波长为595595600nm600nm，呈，呈，呈，呈橘红色橘红色橘红色橘红色。藻红蛋白（藻红蛋白（P-phycoerythrinP-phycoerythrin，PEPE），），最大吸收最大吸收最大吸收最大吸收波长约波长约波长约波长约490nm490nm490nm490nm，最大发射约为，最大发射约为，最大发射约为，最大发

11、射约为677nm677nm677nm677nm，呈，呈红色红色红色红色。现在学习的是第11页，共29页中心实验室 李三华(2)(2)按抗体、抗原与标记物的作用方式按抗体、抗原与标记物的作用方式 直接法：直接法：特异性抗体（一抗）与抗原结合；特异性抗体（一抗）与抗原结合；标记物直接连接在一抗上。标记物直接连接在一抗上。组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体标记物标记物现在学习的是第12页，共29页中心实验室 李三华特点：特点：方法简单、省时，专一性强；方法简单、省时，专一性强；非特异染色轻；非特异染色轻；敏感性差；敏感性差；一种标记抗体只能检测一种抗一种标记抗体只能检测一种抗 原。原。现在学习的是第1

12、3页，共29页中心实验室 李三华间接法间接法 一抗与待检测的抗原结合；一抗与待检测的抗原结合；二抗与一抗结合（一抗作为二抗的抗原）二抗与一抗结合（一抗作为二抗的抗原）；标记物连接在二抗上。标记物连接在二抗上。组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体标记物标记物现在学习的是第14页，共29页中心实验室 李三华特点：特点：敏感性高；敏感性高；一种标记抗体（二抗）能用于同一中一种标记抗体（二抗）能用于同一中物种中多种抗原的检测；物种中多种抗原的检测；样本样本样本样本1 1 1 1：兔（：兔（：兔（：兔（VEGFVEGFVEGFVEGF）样本样本样本样本2 2 2 2：人（：人（：人（：人（P

13、53P53P53P53）一抗：小鼠抗兔（一抗：小鼠抗兔（一抗：小鼠抗兔（一抗：小鼠抗兔（IgGIgGIgGIgG）一抗：小鼠抗人（一抗：小鼠抗人（一抗：小鼠抗人（一抗：小鼠抗人（IgG)IgG)IgG)IgG)二抗：二抗：二抗：二抗：HRPHRPHRPHRP标记标记标记标记山羊山羊山羊山羊*抗抗抗抗*小鼠小鼠小鼠小鼠IgG IgG IgG IgG 费时，非特异染色稍重。费时，非特异染色稍重。现在学习的是第15页，共29页中心实验室 李三华 四四 抗体的选择及保存和反应条件抗体的选择及保存和反应条件（1 1）抗体的种属来源（宿主）抗体的种属来源（宿主）样本，一抗，二抗来自于不同种属样本，一抗，二

14、抗来自于不同种属 样本：大鼠样本：大鼠 样本：人样本：人 一抗：兔一抗：兔 一抗：小鼠一抗：小鼠 二抗：山羊二抗：山羊 二抗：兔二抗：兔（2 2）反应特异性）反应特异性 该抗体适合检测哪些种属动物体内的抗该抗体适合检测哪些种属动物体内的抗 原，不同种属间可能存在反应差异。原，不同种属间可能存在反应差异。现在学习的是第16页，共29页中心实验室 李三华（3 3）类型）类型 单克隆抗体单克隆抗体(小鼠来源小鼠来源),),多克隆抗体。多克隆抗体。（4 4）应用范围）应用范围 IHC,WB,FC,ELISA,IPIHC,WB,FC,ELISA,IP；石蜡切片石蜡切片(IHCIHCIHCIHCP),P)

15、,P),P),冰冻切片冰冻切片冰冻切片冰冻切片(IHC(IHC(IHC(IHCFr),Fr),Fr),Fr),甲醛固定冰冻切片（甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFrIHC-FoFrIHC-FoFrIHC-FoFr）。）。）。）。(5)(5)与抗原结合的部位与抗原结合的部位 亚型，亚型，C-C-或或N-N-，胞外区域或胞内区域。，胞外区域或胞内区域。（6 6）公司，价格。）公司，价格。现在学习的是第17页，共29页中心实验室 李三华国外主要抗体试剂公司国外主要抗体试剂公司 现在学习的是第18页，共29页中心实验室 李三华（7 7）抗体的保存与孵育条件）抗体的保存与孵育条件 保存的条件保存的条件 一

16、抗：用前分装，一抗：用前分装，2020；使用后，使用后，4 4。标记二抗标记二抗:用前放于用前放于4 4 ；长期不用，长期不用，2020；解冻后，解冻后，4 4。避免反复冻融。避免反复冻融。现在学习的是第19页，共29页中心实验室 李三华孵育的温度与时间孵育的温度与时间 一抗：一抗：44过夜（过夜（室温室温 30min30min1h1h）37 37，1-2h1-2h。二抗二抗:室温或室温或3737，30min30min1h 1h。浓度浓度 每次使用新抗体前应当对其工作浓度每次使用新抗体前应当对其工作浓度 进行稀释测试，使阳性染色强而无背进行稀释测试，使阳性染色强而无背 景染色。景染色。现在学习

17、的是第20页，共29页中心实验室 李三华抗体稀释度的棋盘稀释测定法抗体稀释度的棋盘稀释测定法注：括号内为背景染色注：括号内为背景染色注：括号内为背景染色注：括号内为背景染色现在学习的是第21页，共29页中心实验室 李三华 五五 封闭血清的选择封闭血清的选择（1 1）原因：样本里高电荷成分非特异性吸收抗）原因：样本里高电荷成分非特异性吸收抗 体；样本里可能含体；样本里可能含FcFc受体而与抗体恒定区受体而与抗体恒定区 结合。结合。（2 2）来源：）来源：与二抗同一来源的正常动物血清与二抗同一来源的正常动物血清,非一抗来源的动物非一抗来源的动物(牛，马牛，马)的血清的血清,2%2%牛血清白蛋白（牛

18、血清白蛋白（BSABSA）。）。加一抗前，室温或加一抗前，室温或3737，10-30min10-30min。处理完后直接加一抗，不洗涤。处理完后直接加一抗，不洗涤。现在学习的是第22页，共29页中心实验室 李三华 六六 内源性酶灭活的问题内源性酶灭活的问题（1 1）原因：）原因：在以酶做标记物时，内源性酶和生物素在以酶做标记物时，内源性酶和生物素易与底物竞争结合而引起非特异性染色。易与底物竞争结合而引起非特异性染色。（2 2）方法：）方法：a:a:去除一般性酶去除一般性酶 3%H3%H2 2O O2 2,10min,10min；0 0.3%H3%H2 2O O2 2-甲醇甲醇，101030mi

19、n30min。现用现配，避光现用现配，避光,干燥处保存。干燥处保存。现在学习的是第23页，共29页中心实验室 李三华 b:b:去除内源性生物素去除内源性生物素 0.010.01卵白素，卵白素，20min20min。c:c:去除碱性磷酸酶去除碱性磷酸酶 加入加入24mg/mL24mg/mL的左旋咪唑于底物液中，的左旋咪唑于底物液中，pHpH维持在维持在7.6-8.27.6-8.2。d:d:去除酸性磷酸酶去除酸性磷酸酶 加入加入50mmol/L50mmol/L的酒石酸于底物液中。的酒石酸于底物液中。现在学习的是第24页，共29页中心实验室 李三华 七七 对照染色设计对照染色设计(1)(1)阳性对照

20、阳性对照:用已证实含靶抗原的标本与待用已证实含靶抗原的标本与待 检标本同时做同样染色处理。检标本同时做同样染色处理。(2)(2)阴性对照：用证实不含靶抗原或缺少免阴性对照：用证实不含靶抗原或缺少免 疫试剂的同步处理和标记染色的对照。疫试剂的同步处理和标记染色的对照。a.a.阴性阴性组织组织对照对照 以确知不含靶抗原的组织（细胞）标以确知不含靶抗原的组织（细胞）标 本片与待检标本片同时染色。本片与待检标本片同时染色。现在学习的是第25页，共29页中心实验室 李三华b.b.阴性阴性试剂试剂对照对照 空白对照：用不加一抗的缓冲液（如空白对照：用不加一抗的缓冲液（如 PBSPBS）替代一抗。）替代一抗

21、。替代对照：以第一抗体同源动物未免替代对照：以第一抗体同源动物未免疫的正常血清或与本实验无关的抗体代疫的正常血清或与本实验无关的抗体代替一抗。替一抗。吸收试验：第一抗体被过量的经纯化吸收试验：第一抗体被过量的经纯化的抗原中和吸收，使其结合点全部被外的抗原中和吸收，使其结合点全部被外源性抗原封闭。源性抗原封闭。抑制试验：待检标本先与未标记的特抑制试验：待检标本先与未标记的特异性抗体反应，再与标记的特异性抗体异性抗体反应，再与标记的特异性抗体结合，使染色结果明显减弱或转阴。结合，使染色结果明显减弱或转阴。现在学习的是第26页，共29页中心实验室 李三华 （3 3）自身对照：）自身对照：同一标本片上，靶抗原的阳性反应与同一标本片上，靶抗原的阳性反应与其他无关结构其他无关结构/成分的阴性结果可形成鲜成分的阴性结果可形成鲜明对比。明对比。国际文章要求：各种对照国际文章要求：各种对照Western blotWestern blot现在学习的是第27页，共29页中心实验室 李三华实验组与对照组染色结果分析表实验组与对照组染色结果分析表现在学习的是第28页，共29页中心实验室 李三华感感谢谢大大家家观观看看9/26/2022现在学习的是第29页，共29页