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1、柱层析原理详解课件CONFIDENTIAL第1页，共57页，编辑于2022年，星期六Column Chromatography CONFIDENTIAL第2页，共57页，编辑于2022年，星期六CONFIDENTIAL第3页，共57页，编辑于2022年，星期六柱层v原理v 吸附剂v 相互作用v 影响分离的参数v 装柱v 上样v 洗脱技术v 柱的监控CONFIDENTIAL第4页，共57页，编辑于2022年，星期六有机化学家能用的最现代化和尖端的方法全部包括某种类型的层析法有机化学家能用的最现代化和尖端的方法全部包括某种类型的层析法.层析法的层析法的定义是定义是,通过在两相之间的分配通过在两相之
2、间的分配,使一个由两种或多种不同化合物使一个由两种或多种不同化合物(有时是离子有时是离子)组成的混合物得到分离组成的混合物得到分离,这两相中一相是固定的这两相中一相是固定的,另一相则是移动的另一相则是移动的.根据所包根据所包括的两个相的性质括的两个相的性质,可有各种可能形式的层析法可有各种可能形式的层析法;供普通使用的有固供普通使用的有固-液液(柱柱,薄薄层和纸层和纸),液液-液和气液和气-液液(蒸气相蒸气相)层析法层析法.所有层析法所根据的工作原理都是凭借于欲待分离的几种物质在将它们进行分配的两相之间的所有层析法所根据的工作原理都是凭借于欲待分离的几种物质在将它们进行分配的两相之间的溶解度溶
3、解度(或吸附度或吸附度)上的差别上的差别.v原理原理CONFIDENTIAL第5页，共57页，编辑于2022年，星期六v吸附剂吸附剂 柱层析法是以吸附度和溶解度这两者为根据的一种技术柱层析法是以吸附度和溶解度这两者为根据的一种技术,它是一种固它是一种固-液相间进行分配的技术液相间进行分配的技术.其中的固体几乎可以是任何物料其中的固体几乎可以是任何物料,只要不溶解于附着的液相中即行只要不溶解于附着的液相中即行.但最常用的一些固体是硅但最常用的一些固体是硅胶胶(SiO2xH2O)也叫做硅酸也叫做硅酸,和氧化铝和氧化铝(Al2O3xH2O).这些化合物均用其粉状或磨细的形这些化合物均用其粉状或磨细的
4、形式式(通常为通常为200至至400目目)层析法中所用的极大多数氧化铝系从粗的铝矿石层析法中所用的极大多数氧化铝系从粗的铝矿石(Al2O3xH2O+Fe2O3)制得制得.将铝土矿石溶于热氢氧化钠溶液中将铝土矿石溶于热氢氧化钠溶液中,过滤除去不溶的氧化铁过滤除去不溶的氧化铁;矿石中的氧化铝则成矿石中的氧化铝则成为可溶性的两性氢氧化物为可溶性的两性氢氧化物Al(OH)4-.这个氢氧化物用这个氢氧化物用CO2(它能降低它能降低PH)使沉淀成为使沉淀成为Al(OH)3,在加热时在加热时,此此Al(OH)3失水成为纯的失水成为纯的Al2O3.CONFIDENTIAL第6页，共57页，编辑于2022年，星
5、期六吸附剂吸附剂按此方法制得的氧化铝称为按此方法制得的氧化铝称为碱性氧化铝碱性氧化铝.因为它仍旧含一些氢氧化物因为它仍旧含一些氢氧化物.碱性氧化铝不能用于碱性氧化铝不能用于对碱敏感的化合物的层析分离对碱敏感的化合物的层析分离.因此因此,要用酸加以洗涤以便将碱中和要用酸加以洗涤以便将碱中和,这样便得到这样便得到酸性氧化酸性氧化铝铝.这种物料仍然不能令人满意这种物料仍然不能令人满意,除非经过足够的水洗以除去所有的酸除非经过足够的水洗以除去所有的酸,才能获得最适才能获得最适用于柱层析的物料用于柱层析的物料,称为称为中性氧化铝中性氧化铝.如果化合物是酸敏感的如果化合物是酸敏感的,必须使用碱性或中性氧必
6、须使用碱性或中性氧化铝化铝,必须仔细的弄清你在层析法中所用的氧化铝属於哪一类型必须仔细的弄清你在层析法中所用的氧化铝属於哪一类型.硅胶除了以适用于层硅胶除了以适用于层析法的形式供应外别无任何其他类型析法的形式供应外别无任何其他类型.CONFIDENTIAL第7页，共57页，编辑于2022年，星期六v相互作用相互作用若将粉末状或磨细的氧化铝若将粉末状或磨细的氧化铝(或硅胶或硅胶)加入至含有一种有机化合物的溶液中时加入至含有一种有机化合物的溶液中时,一一部分有机物将会吸附或黏在氧化铝细粒上部分有机物将会吸附或黏在氧化铝细粒上,使有机分子和氧化铝结合的力有好几使有机分子和氧化铝结合的力有好几种种.这
7、些力按其种类不同这些力按其种类不同,强度不一强度不一.非极性化合物只用非极性化合物只用范德华范德华(Vanderwaals)力力与氧化铝结合与氧化铝结合.这种力较弱这种力较弱,故非极性化合物不能结合得很牢除非它们的分子量非常大故非极性化合物不能结合得很牢除非它们的分子量非常大.极性有机化合物所用的相互作用力则较为重要极性有机化合物所用的相互作用力则较为重要,此中所用此中所用之力或为之力或为偶极偶极-偶极相互作用力偶极相互作用力,或为某种或为某种直接的相互作用力直接的相互作用力(配位作用配位作用,氢键氢键,或盐的或盐的形成等形成等).CONFIDENTIAL第8页，共57页，编辑于2022年，星
8、期六相互作用相互作用这些相互作用的强度变化次序大致是这些相互作用的强度变化次序大致是:盐的形成盐的形成配位作用配位作用氢键氢键偶极偶极-偶极相互作用力偶极相互作用力范德范德华华力力CONFIDENTIAL第9页，共57页，编辑于2022年，星期六相互作用相互作用对於溶解度来说对於溶解度来说,也有类似的法则也有类似的法则.极性溶剂对极性化合物的溶解比非极性溶剂更为极性溶剂对极性化合物的溶解比非极性溶剂更为有效有效;非极性化合物则最易被非极性溶剂所溶解非极性化合物则最易被非极性溶剂所溶解.因此任何一个给定溶剂洗下吸附因此任何一个给定溶剂洗下吸附在氧化铝或硅胶上的化合物的能力大小几乎直接决定于该溶剂
9、的相对极性在氧化铝或硅胶上的化合物的能力大小几乎直接决定于该溶剂的相对极性.对於每对於每一被吸附着的物料来说一被吸附着的物料来说,可以想象它们在吸附剂和溶剂之间都有一种分配平衡可以想象它们在吸附剂和溶剂之间都有一种分配平衡,即不断地从溶即不断地从溶液中吸附分子又不断地向溶液中解吸分子液中吸附分子又不断地向溶液中解吸分子.达到平衡时最终被吸附在颗粒上的分子的平均数达到平衡时最终被吸附在颗粒上的分子的平均数既取决于所涉及的特殊分子又取决于吸附剂必须与之竞争的溶剂的溶解效力既取决于所涉及的特殊分子又取决于吸附剂必须与之竞争的溶剂的溶解效力.CONFIDENTIAL第10页，共57页，编辑于2022年
10、，星期六v影影响分离的参数响分离的参数层析法是分离混合物的常用方法层析法是分离混合物的常用方法,许多可以改变的因素使层析法成为许多可以改变的因素使层析法成为一种多方面适用的方法一种多方面适用的方法.这些因素包括这些因素包括:1.选定的吸附剂选定的吸附剂2.选定的溶剂极性选定的溶剂极性3.相对于需待分离的物料量的柱子尺寸相对于需待分离的物料量的柱子尺寸(长度和直径长度和直径)4.洗脱洗脱(或流动或流动)的速率的速率CONFIDENTIAL第11页，共57页，编辑于2022年，星期六A.吸附剂吸附剂吸附剂的选择通常要根据需待分离的化合物的类型而定吸附剂的选择通常要根据需待分离的化合物的类型而定.主
11、要有主要有:纤维素纤维素,淀粉和糖类淀粉和糖类:用于对酸碱相互作用非常敏感的多官能团的动用于对酸碱相互作用非常敏感的多官能团的动,植物性化合物植物性化合物(天然天然产物产物)硅酸镁硅酸镁:分离乙酰分离乙酰化的糖类化的糖类,甾体化合物和香精油甾体化合物和香精油.硅胶和合成硅酸镁载体硅胶和合成硅酸镁载体(Florisil):对大多数化合物来说相对地比较温和对大多数化合物来说相对地比较温和,故可广泛适用于故可广泛适用于种种官能团种种官能团烃烃,醇醇,酮酮,酯酯,羧酸羧酸,偶氮化合物偶氮化合物,胺胺.CONFIDENTIAL第12页，共57页，编辑于2022年，星期六吸附剂吸附剂氧化铝氧化铝:分为酸性
12、分为酸性(PH=4),中性中性,碱性碱性(PH=10).这种吸附剂特别适用于分离象羧酸和氨这种吸附剂特别适用于分离象羧酸和氨基酸之类的酸性物质基酸之类的酸性物质.碱性氧化铝的碱性氧化铝的PH约为约为10,故适用于分离胺故适用于分离胺.中性氧化铝可用于中性氧化铝可用于分离各种非酸性和非碱性物质分离各种非酸性和非碱性物质.CONFIDENTIAL第13页，共57页，编辑于2022年，星期六吸附剂吸附剂*应该特别注意的是应该特别注意的是,这个次序是近似的这个次序是近似的,可变的可变的.如氧化铝和硅胶的强度或分离能力在很大程如氧化铝和硅胶的强度或分离能力在很大程度上取决于其中所存在的水度上取决于其中所
13、存在的水.水能非常紧密地与这两种吸附剂结合水能非常紧密地与这两种吸附剂结合,占去颗粒上的一些部位占去颗粒上的一些部位,这些这些部位本来是可供平衡用的部位本来是可供平衡用的.因此如果将吸附剂里面加进水因此如果将吸附剂里面加进水,我们便称为失活我们便称为失活.无水氧化铝或硅无水氧化铝或硅胶则是高度活化的胶则是高度活化的,这种高活性是吸附剂需要避免的这种高活性是吸附剂需要避免的,因为这种高活性会使得吸附剂和待因为这种高活性会使得吸附剂和待分离的化合物发生某些形式的破坏作用和分解作用分离的化合物发生某些形式的破坏作用和分解作用,往往能引起某些类型的溶质化合物往往能引起某些类型的溶质化合物发生分子重排反
14、应发生分子重排反应.CONFIDENTIAL第14页，共57页，编辑于2022年，星期六B溶剂溶剂各类溶剂的极性次序如下表各类溶剂的极性次序如下表:CONFIDENTIAL第15页，共57页，编辑于2022年，星期六溶剂溶剂在层析分离过程中在层析分离过程中,若拟改变溶剂的极性若拟改变溶剂的极性,要采取一些预防措施要采取一些预防措施.务须避免迅速从一种溶务须避免迅速从一种溶剂换成另一种溶剂剂换成另一种溶剂(尤其是当使用硅胶或氧化铝时尤其是当使用硅胶或氧化铝时).通常通常,应将新溶剂以小百分比慢慢混入应将新溶剂以小百分比慢慢混入正在使用的溶剂中正在使用的溶剂中.如不这样做如不这样做,柱内填重料往往
15、会出现缝隙柱内填重料往往会出现缝隙.缝隙之所以发生是由於缝隙之所以发生是由於氧化铝或硅胶与溶剂混合时放热所致氧化铝或硅胶与溶剂混合时放热所致.溶剂将吸附剂溶剂化溶剂将吸附剂溶剂化,从而形成一种弱键而从而形成一种弱键而放出热量放出热量.溶剂溶剂+氧化铝氧化铝(氧化铝氧化铝溶溶剂剂)+热热往往能在局部地方生成足能使溶往往能在局部地方生成足能使溶剂剂蒸蒸发发的的热热量量.蒸气的蒸气的产产生造成了气泡生造成了气泡,气泡又把柱内气泡又把柱内填充料填充料挤挤开开,这这就是所就是所谓谓的的缝缝隙隙.CONFIDENTIAL第16页，共57页，编辑于2022年，星期六溶剂溶剂使用氧化铝或硅胶时使用氧化铝或硅胶
16、时,要避免使用某些溶剂要避免使用某些溶剂,特别是酸性的特别是酸性的,碱性的和高活性形式的溶碱性的和高活性形式的溶剂剂.举例来说举例来说,丙酮会与任何一个这样的吸附剂通过醇醛缩合作用二聚成乙酰丙酮丙酮会与任何一个这样的吸附剂通过醇醛缩合作用二聚成乙酰丙酮.当用乙酸乙酯或醇类作为洗脱液时当用乙酸乙酯或醇类作为洗脱液时,会使酯类的混合物发生酯交换作用会使酯类的混合物发生酯交换作用.最后最后,更更活泼的溶剂活泼的溶剂(吡啶吡啶,甲醇甲醇,水和乙酸水和乙酸)会溶解和洗脱一部分吸附剂本身会溶解和洗脱一部分吸附剂本身.CONFIDENTIAL第17页，共57页，编辑于2022年，星期六溶剂溶剂CONFIDE
17、NTIAL第18页，共57页，编辑于2022年，星期六溶剂溶剂一般来说一般来说,各类化合物被洗脱时各类化合物被洗脱时,非极性化合物最先洗脱非极性化合物最先洗脱,极性化合物最后洗脱极性化合物最后洗脱.可是可是,分分子量也是一个决定洗脱次序的因素子量也是一个决定洗脱次序的因素.高分子量的非极性化合物将比低分子量的非极高分子量的非极性化合物将比低分子量的非极性化合物洗脱得慢性化合物洗脱得慢,甚至可能被某些极性化合物所超过甚至可能被某些极性化合物所超过.具有下列极性基团的化合物具有下列极性基团的化合物,其其吸附能力按下列排列次序递增吸附能力按下列排列次序递增:CONFIDENTIAL第19页，共57页
18、，编辑于2022年，星期六C柱的尺寸和吸附剂量柱的尺寸和吸附剂量为了能使一定数量的样品达到良好分离为了能使一定数量的样品达到良好分离,还应正确地选定柱尺寸和吸附剂的量一条经还应正确地选定柱尺寸和吸附剂的量一条经验规律是验规律是,吸附剂的量应是需待分离的混合物重量的吸附剂的量应是需待分离的混合物重量的25至至30倍倍.另外另外,所用柱子的高度和直所用柱子的高度和直径之比应大约为径之比应大约为8:1.但要注意的一点是但要注意的一点是,柱的尺寸和长度及需用吸附剂的量还决定于分离的困难程度柱的尺寸和长度及需用吸附剂的量还决定于分离的困难程度.不易不易分离的化合物可能需要更长的柱子和更多的用量分离的化合
19、物可能需要更长的柱子和更多的用量.CONFIDENTIAL第20页，共57页，编辑于2022年，星期六柱的尺寸和吸附剂量柱的尺寸和吸附剂量某些典型样品量适用的柱尺寸和吸附剂数量某些典型样品量适用的柱尺寸和吸附剂数量样品量样品量吸附剂量吸附剂量柱直径柱直径柱高柱高0.01g0.3g3.5mm30mm0.1g3g7.5mm60mm1.00g30g16.0mm130mm10.00g300.0g35.0mm280mmCONFIDENTIAL第21页，共57页，编辑于2022年，星期六D流速流速溶剂流经柱子的速率对於决定一个分离能进行得多好也起着作用溶剂流经柱子的速率对於决定一个分离能进行得多好也起着作
20、用.一般来说一般来说,需待分离的化合物在柱上逗留愈久需待分离的化合物在柱上逗留愈久,其在固定相和移动相之间的平衡愈广泛其在固定相和移动相之间的平衡愈广泛.结果可以使结果可以使较为相似的化合物得到分离较为相似的化合物得到分离.然而如果流速过慢然而如果流速过慢,则混合物中各个物质到了溶剂中则混合物中各个物质到了溶剂中后其在溶剂中的扩散速率可能变得大於这些物质沿柱下行速率后其在溶剂中的扩散速率可能变得大於这些物质沿柱下行速率.在这种情况下在这种情况下谱带变宽谱带变宽,反而使分离效果变差反而使分离效果变差.事实上事实上,在溶剂极性相同的情况下在溶剂极性相同的情况下,溶剂的流速一溶剂的流速一般而言般而言
21、（HPLC，MPLC除外），流速均以越快越好，因为一般而言流动相流速与板除外），流速均以越快越好，因为一般而言流动相流速与板高成反比，而板高越小越好，所以流动相流速越快越好。所以快速高成反比，而板高越小越好，所以流动相流速越快越好。所以快速CONFIDENTIAL第22页，共57页，编辑于2022年，星期六流速流速（加压）柱层析的效果比一般重力柱层析好（加压）柱层析的效果比一般重力柱层析好。CONFIDENTIAL第23页，共57页，编辑于2022年，星期六v装柱装柱柱层析法中最关键性的操作是装柱柱层析法中最关键性的操作是装柱.柱子在用吸附剂填充时必须装得非常均匀柱子在用吸附剂填充时必须装得非
22、常均匀,如果装得如果装得不整齐不整齐,出现气泡出现气泡,缝隙等会明显影响分离效率缝隙等会明显影响分离效率.主要存在两种情况主要存在两种情况:一一:谱带的最前面的边缘或称前沿不水平谱带的最前面的边缘或称前沿不水平,如果两条谱带紧靠在一起而又无水平的谱带如果两条谱带紧靠在一起而又无水平的谱带前沿前沿,那么要想收集每一条谱带而把另外一条谱带完全排除在外是不可能的那么要想收集每一条谱带而把另外一条谱带完全排除在外是不可能的!造成这个问题的因素有两个造成这个问题的因素有两个:1.吸附剂填充料的顶面不呈水平吸附剂填充料的顶面不呈水平.2.柱子未被夹持在两个平面柱子未被夹持在两个平面中中(即前即前-后后,左
23、左-右两个平面右两个平面)完全垂直的位置完全垂直的位置.CONFIDENTIAL第24页，共57页，编辑于2022年，星期六装柱装柱二二:谱带前沿的一部分从谱带的主体部分中间向前伸出谱带前沿的一部分从谱带的主体部分中间向前伸出,此时发生的现象称为流动或此时发生的现象称为流动或称沟流称沟流.造成这种现象的原因主要是吸附剂表面不平整或在填料中有任何不平整性或气泡造成这种现象的原因主要是吸附剂表面不平整或在填料中有任何不平整性或气泡.CONFIDENTIAL第25页，共57页，编辑于2022年，星期六CONFIDENTIAL第26页，共57页，编辑于2022年，星期六CONFIDENTIAL第27页
24、，共57页，编辑于2022年，星期六装柱装柱A湿法湿法(浆液法浆液法)即吸附剂以浆液状态被装入管内即吸附剂以浆液状态被装入管内.浆液是一种溶剂和一种不溶解的固体的混合物浆液是一种溶剂和一种不溶解的固体的混合物.操作方法是将固体吸附剂慢慢加入盛有大量溶剂的容器中操作方法是将固体吸附剂慢慢加入盛有大量溶剂的容器中.注意要严格遵守这种加料次序注意要严格遵守这种加料次序(加加吸附剂至溶剂吸附剂至溶剂),因为吸附剂在加入到溶剂中时会因溶剂化效应而放热因为吸附剂在加入到溶剂中时会因溶剂化效应而放热.若向吸附剂内加若向吸附剂内加溶剂溶剂,由於发热会使溶剂几乎与加入速率一样快地气化逸出由於发热会使溶剂几乎与加
25、入速率一样快地气化逸出,使最终的混合物不均匀或结块使最终的混合物不均匀或结块.因此通常的做法是将吸附剂加入溶剂中因此通常的做法是将吸附剂加入溶剂中,边加边旋摇边加边旋摇,使其形成一种稠厚但能流动的浆使其形成一种稠厚但能流动的浆液液.浆液应不断旋摇直至已呈均匀状态且相对地不再含有空气泡为宜浆液应不断旋摇直至已呈均匀状态且相对地不再含有空气泡为宜.CONFIDENTIAL第28页，共57页，编辑于2022年，星期六装柱装柱 装柱时装柱时,先向柱内充入溶剂至约半满先向柱内充入溶剂至约半满,然后开启活塞让溶剂慢慢流下然后开启活塞让溶剂慢慢流下,借助旋摇动作使借助旋摇动作使浆液混合浆液混合,然后慢慢倾入
26、正在流出溶剂的柱子的顶部然后慢慢倾入正在流出溶剂的柱子的顶部.同时要不断轻轻地敲击柱壁同时要不断轻轻地敲击柱壁,促进均匀促进均匀沉降和混合沉降和混合,避免空气泡的形成避免空气泡的形成.同时在所有物料沉降好之前要持续轻敲柱壁同时在所有物料沉降好之前要持续轻敲柱壁,这样可以使这样可以使柱顶形成一个非常合格的水平面柱顶形成一个非常合格的水平面.另外如果浆液有时因变得太厚而无法倾倒另外如果浆液有时因变得太厚而无法倾倒,可将收集在烧杯中的溶剂重新加至浆液内可将收集在烧杯中的溶剂重新加至浆液内.然后然后将收集到的溶剂在柱内反复循环几次以保证沉降完全及柱子的紧实将收集到的溶剂在柱内反复循环几次以保证沉降完全
27、及柱子的紧实.CONFIDENTIAL第29页，共57页，编辑于2022年，星期六B 干法干法方法一方法一:用溶剂将柱子充满并让它缓缓流出用溶剂将柱子充满并让它缓缓流出.在按上述方法不停地轻敲柱子的同时在按上述方法不停地轻敲柱子的同时,每每次少量地把干的吸附剂加入柱中次少量地把干的吸附剂加入柱中.此法也可得到装得很均匀的柱此法也可得到装得很均匀的柱.同上法一样同上法一样,每次使用前应将溶每次使用前应将溶剂反复循环通过几次剂反复循环通过几次.方法二方法二:先将干的吸附剂装入柱中先将干的吸附剂装入柱中,硅胶面压实顶部水平后将溶剂缓慢渗沥穿过柱子硅胶面压实顶部水平后将溶剂缓慢渗沥穿过柱子,直至柱子全
28、被浸润直至柱子全被浸润.但此法容易造成柱子不匀但此法容易造成柱子不匀,空气泡和缝隙空气泡和缝隙,尤其是使用在溶剂化过程尤其是使用在溶剂化过程中有高度放热的溶剂时中有高度放热的溶剂时,这些问题尤为突出这些问题尤为突出.CONFIDENTIAL第30页，共57页，编辑于2022年，星期六v上样上样分为以下几个步骤分为以下几个步骤:A.将固体样品溶于极少量适宜的极性溶剂中将固体样品溶于极少量适宜的极性溶剂中,溶剂的极性应比样品的极性小一些溶剂的极性应比样品的极性小一些,否否则样品不易被吸附则样品不易被吸附.溶剂对样品的溶解度也不宜过大溶剂对样品的溶解度也不宜过大.B.通过排液通过排液,使溶剂的水平面
29、刚好低于吸附剂的顶部使溶剂的水平面刚好低于吸附剂的顶部.C.将待分离的溶液用移液管将待分离的溶液用移液管(或长滴管或长滴管)加入柱顶加入柱顶.注意要接触柱的内壁慢慢沿柱壁散布注意要接触柱的内壁慢慢沿柱壁散布放样使其慢慢下降放样使其慢慢下降.从而使整个吸附剂表面都被其均匀地盖住从而使整个吸附剂表面都被其均匀地盖住.同时要注意尽量使移液管同时要注意尽量使移液管贴近吸附剂表面贴近吸附剂表面.CONFIDENTIAL第31页，共57页，编辑于2022年，星期六上样上样D让这一薄层液体进入柱内让这一薄层液体进入柱内,直至柱顶表面恰好开始沥干为止直至柱顶表面恰好开始沥干为止.E:小心用移液管加入一薄层层析
30、分离溶剂小心用移液管加入一薄层层析分离溶剂,小心不要搅动表面小心不要搅动表面,让这一薄层溶剂排入柱中直至这让这一薄层溶剂排入柱中直至这段柱正好沥干段柱正好沥干,目的是洗涤柱壁上附着的样品目的是洗涤柱壁上附着的样品.如样品有色如样品有色,则可从新鲜溶剂层上有没有则可从新鲜溶剂层上有没有这种样品的颜色来判断样品有没有被完全吸附这种样品的颜色来判断样品有没有被完全吸附.F:向柱顶加入石英砂并注入溶剂向柱顶加入石英砂并注入溶剂.CONFIDENTIAL第32页，共57页，编辑于2022年，星期六上样上样*在开始洗脱之前让样品在柱中停留一段短时间往往可以得到较好的分离在开始洗脱之前让样品在柱中停留一段短
31、时间往往可以得到较好的分离,这样做可以建立起一个真这样做可以建立起一个真正的平衡正的平衡.然而然而,必须指出必须指出,在一个经过长时期放置的柱中在一个经过长时期放置的柱中,吸附剂往往会变得紧密甚至溶胀吸附剂往往会变得紧密甚至溶胀,而流速也可能变得令人讨厌地慢而流速也可能变得令人讨厌地慢.如果柱子放置时间过长如果柱子放置时间过长,也会出现样品扩散而使谱带变也会出现样品扩散而使谱带变宽的问题宽的问题.CONFIDENTIAL第33页，共57页，编辑于2022年，星期六v洗脱洗脱洗脱溶剂的选择是柱色谱分离的重要环节洗脱溶剂的选择是柱色谱分离的重要环节.通常先用非极性溶剂洗脱出极性小的部分通常先用非极
32、性溶剂洗脱出极性小的部分,再慢慢加再慢慢加大极性进行洗脱大极性进行洗脱.常用溶剂和混合溶剂的洗脱力按递增次序排列如下常用溶剂和混合溶剂的洗脱力按递增次序排列如下:己烷和石油醚己烷和石油醚环己烷环己烷四氯化碳四氯化碳三氯乙烯三氯乙烯二硫化碳二硫化碳甲苯甲苯苯苯二氯甲烷二氯甲烷-乙醚乙醚(80:20)二氯甲烷二氯甲烷-乙醚乙醚(60:40)环己烷环己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯(20:80)乙醚乙醚乙醚乙醚-甲醇甲醇(99:1)乙酸乙酯乙酸乙酯四氢呋喃四氢呋喃丙酮丙酮正丙醇正丙醇乙醇乙醇甲醇甲醇水水吡啶吡啶乙酸乙酸甲酸甲酸CONFIDENTIAL第34页，共57页，编辑于2022年，星期六v柱的监控柱的监
33、控一:通过薄层层析板进行监控通过薄层层析板进行监控二二:通过加入无机荧光体通过加入无机荧光体.当用紫外光照射时当用紫外光照射时,经过此处理的吸附剂会发荧光经过此处理的吸附剂会发荧光.但也有一些溶质有使但也有一些溶质有使这种荧光体指示剂的荧光淬灭的能力这种荧光体指示剂的荧光淬灭的能力,因此在有这些溶质存在的区域因此在有这些溶质存在的区域,吸附剂将不发荧光吸附剂将不发荧光,从而从而可以看到一条暗谱带可以看到一条暗谱带.CONFIDENTIAL第35页，共57页，编辑于2022年，星期六拖尾会干扰第二个组份的分离拖尾会干扰第二个组份的分离,避免的一个办法是在洗脱时不断地提高溶剂的极性避免的一个办法是
34、在洗脱时不断地提高溶剂的极性.用这种方法用这种方法时时,由於在峰的尾部处极性正在增大由於在峰的尾部处极性正在增大,化合物就会比其前缘处移动得快化合物就会比其前缘处移动得快,从而使尾部紧从而使尾部紧缩缩,形成一个更近乎理想的谱带形成一个更近乎理想的谱带v拖尾拖尾CONFIDENTIAL第36页，共57页，编辑于2022年，星期六v几点注意几点注意1.1.层析样品的层析样品的RF值（值（Retenitionfraction）是指样品中心区与流动相前端距起始点的距离是指样品中心区与流动相前端距起始点的距离的比值的比值CONFIDENTIAL第37页，共57页，编辑于2022年，星期六几点注意几点注意
35、2.任何化合物若以任何化合物若以TLC检验其纯度，其所显示的检验其纯度，其所显示的Rf值超过值超过0.7或低于或低于0.1时，均无法确认时，均无法确认其是否为单一点，因为在此种其是否为单一点，因为在此种Rf值时，许多值时，许多Rf值较接近的点均有可能重合。所以我们选值较接近的点均有可能重合。所以我们选择观察物最适合的择观察物最适合的Rf值为值为0.30.5。3.过柱子时所选用的溶剂系统应配合选用硅胶的用量及样品的量来选择其极性组过柱子时所选用的溶剂系统应配合选用硅胶的用量及样品的量来选择其极性组合，一般而言欲分离的主样品合，一般而言欲分离的主样品Rf值以值以0.150.25为宜。为宜。CONF
36、IDENTIAL第38页，共57页，编辑于2022年，星期六几点注意几点注意4.一般最常用的溶剂系统依其极性大小依次为正己烷（或石油醚）一般最常用的溶剂系统依其极性大小依次为正己烷（或石油醚）乙酸乙酯乙酸乙酯甲醇的组合为最甲醇的组合为最通用，其他如乙醚也常为中极性的溶剂，对含氯有机溶剂如通用，其他如乙醚也常为中极性的溶剂，对含氯有机溶剂如DCM，CHCl3常有特殊的效果，而常有特殊的效果，而笨对含芳香性的化合物也会有出人意料的好效果。笨对含芳香性的化合物也会有出人意料的好效果。5.5.过柱子所用的溶剂在配好后，应以过柱子所用的溶剂在配好后，应以TLC再作检查试一次，以确定是否为恰当的溶剂再作检
37、查试一次，以确定是否为恰当的溶剂体系。体系。CONFIDENTIAL第39页，共57页，编辑于2022年，星期六几点注意几点注意6.在填装层析柱时若不慎有气泡（如溶剂部分流干引起）可补满溶剂后以木棒轻敲管在填装层析柱时若不慎有气泡（如溶剂部分流干引起）可补满溶剂后以木棒轻敲管壁，使气泡浮出。因为气泡中没有填充物，分离物流经此处时移动速度会较其他处为壁，使气泡浮出。因为气泡中没有填充物，分离物流经此处时移动速度会较其他处为快，而造成此处分离物与其他无气泡处的分离无排列次序混乱，影响分离效果。快，而造成此处分离物与其他无气泡处的分离无排列次序混乱，影响分离效果。7.在过柱子时所收集的馏分体积通常为
38、硅胶克数的在过柱子时所收集的馏分体积通常为硅胶克数的1/4以下。实际情况可引用下列公式求出以下。实际情况可引用下列公式求出粗略值，如欲分离成分粗略值，如欲分离成分A与与B，而而A的的Rf值为值为0.3，B的的Rf值为值为0.2，则最合适的分离体积为：，则最合适的分离体积为：设硅胶量为设硅胶量为50gV2xWx(RfA-RfB)=2x50 x(0.3-0.2)=10mlCONFIDENTIAL第40页，共57页，编辑于2022年，星期六 PTLCCONFIDENTIAL第41页，共57页，编辑于2022年，星期六 分分离时间短，效率高离时间短，效率高 操作简便操作简便 分离样品少分离样品少特点特
39、点CONFIDENTIAL第42页，共57页，编辑于2022年，星期六原理原理各组分对吸附剂吸附能力不同各组分对吸附剂吸附能力不同 吸附能力弱（即极性较弱的）随流动相移动吸附能力弱（即极性较弱的）随流动相移动 吸附能力强（即极性较强的）随流动相移动慢吸附能力强（即极性较强的）随流动相移动慢CONFIDENTIAL第43页，共57页，编辑于2022年，星期六PTLC 板板 吸附剂吸附剂 最常用的吸附剂是硅胶最常用的吸附剂是硅胶 硅胶是无定型多孔物质，略具酸性硅胶是无定型多孔物质，略具酸性 适用于中性或酸性物质的分离。适用于中性或酸性物质的分离。制备和活化制备和活化负载量负载量1.0mm，5mg/
40、cm2e.g.2020cm,10100mgCONFIDENTIAL第44页，共57页，编辑于2022年，星期六确定展开剂确定展开剂 上板上板 展板展板 显色显色 刮板与洗脱刮板与洗脱PTLC过程过程CONFIDENTIAL第45页，共57页，编辑于2022年，星期六确定展开剂确定展开剂 溶解样品时应选用溶解度大，沸点低、易挥发的溶剂溶解样品时应选用溶解度大，沸点低、易挥发的溶剂 溶剂量控制在溶剂量控制在1.52ml/块板块板产物的产物的Rf值调至值调至0.40.6P-TLC可直接用可直接用TLC条件条件CONFIDENTIAL第46页，共57页，编辑于2022年，星期六上板上板 准备硅胶板准备
41、硅胶板自制的一次性滴管自制的一次性滴管上板次数上板次数4次次左右约左右约1cm处不上样处不上样写上化合物编号写上化合物编号CONFIDENTIAL第47页，共57页，编辑于2022年，星期六CONFIDENTIAL第48页，共57页，编辑于2022年，星期六用滴管吸取样品溶剂，缓慢并且匀速地在板上划一条直线用滴管吸取样品溶剂，缓慢并且匀速地在板上划一条直线 如果点样太宽，可用大极性溶剂将其展开至如果点样太宽，可用大极性溶剂将其展开至24cm，再吹干再吹干不要污染板不要污染板线条尽可能细线条尽可能细如果可能，点样后先在如果可能，点样后先在UV下检查下检查 小心小心:UV 光线直接照射进眼里是有害
42、的光线直接照射进眼里是有害的,最好带上眼镜，并用镊子夹住板最好带上眼镜，并用镊子夹住板样品不能太多，否则会过载样品不能太多，否则会过载由于边缘厚度不均匀及边缘效应由于边缘厚度不均匀及边缘效应,应留应留58mm.CONFIDENTIAL第49页，共57页，编辑于2022年，星期六CONFIDENTIAL第50页，共57页，编辑于2022年，星期六展开缸展开缸展开剂量为展开剂量为15-20ml/块板块板吹板吹板在前沿距在前沿距P-TLC板上端约板上端约1cm时取出时取出展开剂展开剂展板展板CONFIDENTIAL第51页，共57页，编辑于2022年，星期六 正己烷（石油醚）正己烷（石油醚）/乙酸乙
43、酯乙酸乙酯 氯仿氯仿/甲醇甲醇 正己烷（石油醚）正己烷（石油醚）/丙酮丙酮几个常用的溶剂体系几个常用的溶剂体系CONFIDENTIAL第52页，共57页，编辑于2022年，星期六选择溶剂系统，必须经过多次的尝试，不断改变溶剂极性，根据板层情况，选择溶剂系统，必须经过多次的尝试，不断改变溶剂极性，根据板层情况，选择最佳的溶剂体系选择最佳的溶剂体系一般来讲，提高溶剂极性，化合物爬的越高一般来讲，提高溶剂极性，化合物爬的越高（反之则相反（反之则相反).溶剂溶剂（展开剂）（展开剂）烷烃烷烃(己烷己烷,石油醚石油醚)甲苯甲苯二氯甲烷二氯甲烷,氯仿氯仿乙醚乙醚乙酸乙酯乙酸乙酯丙酮丙酮醇醇醋酸醋酸极性极性C
44、ONFIDENTIAL第53页，共57页，编辑于2022年，星期六显色显色 化合物有紫外，在紫外灯下用铅笔将产物色带划出。化合物有紫外，在紫外灯下用铅笔将产物色带划出。化合物无紫外，柱层析或用玻璃刀将对照点划下，用相化合物无紫外，柱层析或用玻璃刀将对照点划下，用相应的显色方法测出产物带后，根据应的显色方法测出产物带后，根据Rf值确定产物带。值确定产物带。CONFIDENTIAL第54页，共57页，编辑于2022年，星期六刮板与洗脱刮板与洗脱 用刮刀将产物色带刮下后，研细。用刮刀将产物色带刮下后，研细。洗脱剂一般不用甲醇、四氢呋喃、洗脱剂一般不用甲醇、四氢呋喃、DMF和和DMSO等等极性大或沸点
45、高的溶剂洗脱。极性大或沸点高的溶剂洗脱。玻璃漏斗洗脱或柱层析洗脱玻璃漏斗洗脱或柱层析洗脱CONFIDENTIAL第55页，共57页，编辑于2022年，星期六 板上的化合物是一片板上的化合物是一片 样品过载样品过载 或者是由于你的样品十分不纯或者是由于你的样品十分不纯 板上的化合物拖尾板上的化合物拖尾 样品有酸性或碱性基团样品有酸性或碱性基团(胺或羧酸胺或羧酸)有时在有时在PTLC板会板会有严重的拖尾。加入几滴氨水或有严重的拖尾。加入几滴氨水或TEA(胺胺)或醋酸或醋酸(羧酸羧酸)PTLC中的问题中的问题CONFIDENTIAL第56页，共57页，编辑于2022年，星期六 尽快处理你的化合物尽快处理你的化合物,长时间与吸附剂接触会增加你的长时间与吸附剂接触会增加你的样品变坏的可能性样品变坏的可能性 小心选择溶剂小心选择溶剂,甲醇可能会溶剂硅胶板里的融解黏合剂及甲醇可能会溶剂硅胶板里的融解黏合剂及荧光物质荧光物质,选择氯仿，丙酮和乙醇会好一些选择氯仿，丙酮和乙醇会好一些;如果可能的话，如果可能的话，尽量选择低极性的溶剂尽量选择低极性的溶剂 1g吸附剂需用大约吸附剂需用大约5ml溶剂溶剂 柱层析有助于除去黏合剂和荧光物质柱层析有助于除去黏合剂和荧光物质操作过程请注意操作过程请注意CONFIDENTIAL第57页，共57页，编辑于2022年，星期六