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1、色谱法概论第1页，共59页，编辑于2022年，星期二课程内容课程内容一、色谱法概论一、色谱法概论二、经典液相色谱法（二、经典液相色谱法（LC）三、气相色谱法（三、气相色谱法（GC）四、高效液相色谱法（四、高效液相色谱法（HPLC）五、毛细管电泳（五、毛细管电泳（CE）邮箱：邮箱： 密码：密码：405405第2页，共59页，编辑于2022年，星期二定义定义：色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法。：色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法。是一种分离技术。是一种分离技术。特点特点：适宜分离多组分的试样，效率高、应用广。：适宜分离多组分的试样，效率高、应用广。原理原理：利用各物质（组分）在两相（固定
2、相、流：利用各物质（组分）在两相（固定相、流动相）中具有不同的分配系数，当两相作相对运动动相）中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。分离的目的。完成这种分离分析的仪器为色谱仪。完成这种分离分析的仪器为色谱仪。K=Cs/Cm色谱法概论色谱法概论第3页，共59页，编辑于2022年，星期二一、色谱法的起源和发展1906年，俄国植物学家茨维特首次提出色谱年，俄国植物学家茨维特首次提出色谱法。法。茨维特研究植物色素时使用的色谱原型装置，茨维特研究植物色素时使用的色谱原型装置，如右图。在一根玻璃管底部塞上棉
3、花，管内如右图。在一根玻璃管底部塞上棉花，管内填入碳酸钙粉末，石油醚萃取液倒在碳酸钙填入碳酸钙粉末，石油醚萃取液倒在碳酸钙上面，用石油醚冲洗。结果几种色素在管内上面，用石油醚冲洗。结果几种色素在管内展开形成展开形成5个色带。个色带。第一节第一节 色谱法的起源、历程及分类色谱法的起源、历程及分类第4页，共59页，编辑于2022年，星期二1931年库恩利用茨维特的色谱法分离了年库恩利用茨维特的色谱法分离了60多种胡萝卜素，；多种胡萝卜素，；并从蛋黄只能够分离出叶黄素，从此吸附色谱法才迅速为各国并从蛋黄只能够分离出叶黄素，从此吸附色谱法才迅速为各国所注意。所注意。1940年，年，Martin 和和
4、Synge（英）提出液液分配色谱法；（英）提出液液分配色谱法；1952年，年，James和和 Martin 发表了从理论到实践比较完整的气液发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法因而获得了色谱方法因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。1957年，年，Golay开创了毛细管柱气相色谱；开创了毛细管柱气相色谱；20世纪世纪60年代，高效液相色谱；年代，高效液相色谱；20世纪世纪80年代初，超临界流体色谱；年代初，超临界流体色谱；20世纪世纪80年代末，毛细管电泳年代末，毛细管电泳第5页，共59页，编辑于2022年，星期二 在分析化学领域，色谱法是一个相对年轻的分支学科。早期的色谱
5、技术只是一种分离技在分析化学领域，色谱法是一个相对年轻的分支学科。早期的色谱技术只是一种分离技术而已，与萃取、蒸馏等分离技术不同的是其分离效率高得多。当这种高效的分离技术与各术而已，与萃取、蒸馏等分离技术不同的是其分离效率高得多。当这种高效的分离技术与各种灵敏的检测技术结合在一起后，才使得色谱技术成为最重要的一种分析方法，几乎可以分种灵敏的检测技术结合在一起后，才使得色谱技术成为最重要的一种分析方法，几乎可以分析所有已知物质，在所有学科领域都得到了广泛的应用。析所有已知物质，在所有学科领域都得到了广泛的应用。色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代获奖学科获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学
6、，维生素A和B1938化学类胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究第6页，共59页，编辑于2022年，星期二第7页，共59页，编辑于2022年，星期二第8页，共59页，编辑于2022年，星期二方 法项 目 数 量1985年
7、版1990年版1995年版2000年版2005年版2010版HPLC鉴别及含测7811916971327 2496TLC鉴别及含测未统计未统计未统计未统计1568 4075GC鉴别及含测未统计未统计未统计未统计 4785 色谱法在中国药典中的应用色谱法在中国药典中的应用 第9页，共59页，编辑于2022年，星期二高效液相色谱的样品高效液相色谱的样品芬达橙汁汽水芬达橙汁汽水水水甜味剂甜味剂人工香精人工香精(香橙香橙)人工色素人工色素(柠檬黄柠檬黄)第10页，共59页，编辑于2022年，星期二高效液相色谱高效液相色谱-组分分离组分分离芬达样品芬达样品色谱图色谱图水水甜味剂甜味剂人工香精人工香精(香
8、橙香橙)人工色素人工色素(柠檬黄柠檬黄)第11页，共59页，编辑于2022年，星期二高效液相系统高效液相系统液体传输液体传输液体样品液体样品高效液相系统高效液相系统高效液相色谱柱高效液相色谱柱数据处理数据处理检测器检测器第12页，共59页，编辑于2022年，星期二检测器检测器硅胶填料硅胶填料 液体医药样品液体医药样品结果结果高效液相色谱柱高效液相色谱柱可更换卡套可更换卡套色谱柱色谱柱Agilent 1100 高效液相系统高效液相系统溶剂溶剂以不同速率以不同速率流出的组分流出的组分色谱图色谱图高效液相系统和色谱柱高效液相系统和色谱柱第13页，共59页，编辑于2022年，星期二气相气相-质谱系统质
9、谱系统色谱柱色谱柱第14页，共59页，编辑于2022年，星期二气相色谱系统气相色谱系统检测器检测器进样器进样器色谱柱色谱柱GAS 气源气源柱温箱柱温箱数据处理数据处理第15页，共59页，编辑于2022年，星期二食品与香料食品与香料分析实例分析实例食品中的天然香精香料食品中的天然香精香料人工香精香料人工香精香料饮料中的醇类饮料中的醇类010203040Time(min.)奶酪奶酪胆固醇胆固醇pepperoni 多肽多肽蘑菇蘑菇醛醛酸消化物酸消化物样品样品:比萨比萨色谱分析领域色谱分析领域(1)第16页，共59页，编辑于2022年，星期二生命科学生命科学奥运会奥运会医药工业医药工业FBI法医，法检
10、法医，法检0123(minutes)气相色谱分析实例气相色谱分析实例体液和组织中的药品体液和组织中的药品血醇水平血醇水平药品纯度药品纯度色谱分析领域色谱分析领域(2)第17页，共59页，编辑于2022年，星期二石化石化DB-1,15 m x 0.25 mm I.D.0.25 m filmStegosaurus-o-gram 航天航天汽油汽油空气质量标准空气质量标准Pew!分析实例分析实例n燃料油定级燃料油定级n汽车排放的废气汽车排放的废气色谱分析领域色谱分析领域(3)第18页，共59页，编辑于2022年，星期二环境环境DB-502.2105m x 0.53mm I.D.,30 m气相分析实例气
11、相分析实例n水和土壤中的农残水和土壤中的农残n饮用水中的溶解物饮用水中的溶解物(MTBE甲基甲基叔丁基醚叔丁基醚)n工业污染物工业污染物n新型持久性有机污染物新型持久性有机污染物（PCBs多氯联苯多氯联苯,PFCs全全氟有机物氟有机物）色谱分析领域色谱分析领域(4)第19页，共59页，编辑于2022年，星期二Nam Laket in Tibat 纳木纳木错湖错湖PFCs第20页，共59页，编辑于2022年，星期二Liver 180680ng/gBlood 2652 ng/gPlasma 2580 ng/mlPFCs第21页，共59页，编辑于2022年，星期二二、色谱法的几个重要术语二、色谱法的
12、几个重要术语*1.色谱柱（色谱柱（column）在茨威特实验中在茨威特实验中,装有装有CaCO3的玻璃管的玻璃管,即是一根色谱柱即是一根色谱柱(是指包括是指包括CaCO3的管的管).2.固定相固定相(stationary phase)在柱内固定不动的一相称固定相在柱内固定不动的一相称固定相,如如CaCO3.3.流动相流动相(mobile phase)在柱内不断流动的一相在柱内不断流动的一相,称流动相称流动相,如石油醚如石油醚.4.被分离组分（样品）被分离组分（样品）如色素如色素第22页，共59页，编辑于2022年，星期二5.洗脱洗脱将流动相连续不断地加入色谱柱将流动相连续不断地加入色谱柱,使之
13、通过固定相使之通过固定相,把被把被分离的物质冲洗出柱的过程分离的物质冲洗出柱的过程,叫洗脱。叫洗脱。洗脱是色谱过程中必要而又重要的步骤洗脱是色谱过程中必要而又重要的步骤选择适宜的流选择适宜的流动相、固定相实现分离。动相、固定相实现分离。6.洗脱剂洗脱剂 在洗脱过程中加入色谱柱的流动相即洗脱剂。在洗脱过程中加入色谱柱的流动相即洗脱剂。7.洗脱液洗脱液(流出液流出液)流出色谱柱的溶液流出色谱柱的溶液,即洗脱液。即洗脱液。第23页，共59页，编辑于2022年，星期二二、色谱法分类（一）按流动相和固定相所处状态分类：（一）按流动相和固定相所处状态分类：1.气相色谱（气相色谱（GC）：气体作为流动相）：
14、气体作为流动相2.液相色谱（液相色谱（LC）：液体作为流动相）：液体作为流动相3.超临界流体色谱（超临界流体色谱（SFC）：以超临界流体作为流动相）：以超临界流体作为流动相（二）按分离机制分类：（二）按分离机制分类：1.吸附色谱：以吸附剂作固定相，有机溶剂作为流动相，利吸附色谱：以吸附剂作固定相，有机溶剂作为流动相，利用样品中不同组分在吸附剂上吸附能力的差别，而进行分用样品中不同组分在吸附剂上吸附能力的差别，而进行分离的方法。离的方法。2.分配色谱：根据组分在固定液与流动相中溶解度不同而分分配色谱：根据组分在固定液与流动相中溶解度不同而分离。离。3.空间排阻色谱：利用大小不同的分子在固定相（凝
15、胶）与流空间排阻色谱：利用大小不同的分子在固定相（凝胶）与流动相中的选择渗透而达到分离的方法。动相中的选择渗透而达到分离的方法。4.离子交换色谱：利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力离子交换色谱：利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而进行分离的方法。大小不同而进行分离的方法。5.键合相色谱、毛细管电泳等键合相色谱、毛细管电泳等第24页，共59页，编辑于2022年，星期二（三）按操作形式分类：（三）按操作形式分类：1.柱色谱：将固定相装在金属或玻璃色谱柱内或涂渍在柱色谱：将固定相装在金属或玻璃色谱柱内或涂渍在柱内壁上而进行分离的方法。柱内壁上而进行分离的方法。2.平面色谱：平面色
16、谱：1）纸色谱：以滤纸为载体，以纸纤维吸附的水分为纸色谱：以滤纸为载体，以纸纤维吸附的水分为固定相，样品点在纸条一端，用流动相展开进行分离和固定相，样品点在纸条一端，用流动相展开进行分离和分析的色谱法。分析的色谱法。2）薄层色谱：将吸附剂均匀地铺在玻璃板上形成薄薄层色谱：将吸附剂均匀地铺在玻璃板上形成薄层，分离方法同纸色谱。层，分离方法同纸色谱。第25页，共59页，编辑于2022年，星期二(四四）按使用目的分类按使用目的分类分析用：实验室、便携式；分析样品量少分析用：实验室、便携式；分析样品量少制备用：实验室用、工业用；纯物质制备，如高纯试剂、制备用：实验室用、工业用；纯物质制备，如高纯试剂、
17、蛋白质、手性药物拆分和纯化蛋白质、手性药物拆分和纯化流程用：工业生产流程在线连续使用流程用：工业生产流程在线连续使用第26页，共59页，编辑于2022年，星期二第二节第二节 色谱过程与术语色谱过程与术语第27页，共59页，编辑于2022年，星期二分离任何物质都要依据它们性质的差异。分离任何物质都要依据它们性质的差异。例如蒸馏是利用沸点的差异，沉淀、结晶是利用溶解度不例如蒸馏是利用沸点的差异，沉淀、结晶是利用溶解度不同。同。在色谱当中，是利用物质在两相中溶解、亲和、吸附或其在色谱当中，是利用物质在两相中溶解、亲和、吸附或其它亲和作用力的不同，使混合物中各组分达到了分离。它亲和作用力的不同，使混合
18、物中各组分达到了分离。例如：分离含例如：分离含A、B两种组分的混合溶液。两种组分的混合溶液。一、色谱分离依据简介一、色谱分离依据简介第28页，共59页，编辑于2022年，星期二当组分进入柱后，由于组分与固定相间的亲合力，就要当组分进入柱后，由于组分与固定相间的亲合力，就要被固定相所滞留，即固定相对组分有滞留作用（保留作被固定相所滞留，即固定相对组分有滞留作用（保留作用），组分的性质不同，则用），组分的性质不同，则固定相对不同组分的滞留固定相对不同组分的滞留能力（保留能力）不同能力（保留能力）不同。组分与固定相之间的亲合力越大，则固定相对组分与固定相之间的亲合力越大，则固定相对该组分的滞留越强烈
19、。它随流动相移动的速度该组分的滞留越强烈。它随流动相移动的速度就较慢；反之，组分在柱内的移动速度快；就较慢；反之，组分在柱内的移动速度快；从而从而造成了造成了A、B在柱内的差速迁移，即移动速度不同在柱内的差速迁移，即移动速度不同。当经过一段距离后，速度的差异造成当经过一段距离后，速度的差异造成A、B组分先后出组分先后出柱，得到分离。这就是色谱过程的本质。柱，得到分离。这就是色谱过程的本质。第29页，共59页，编辑于2022年，星期二掌握的要点：掌握的要点：（1）组分在柱内随流动相不断移动（溶解于流动相）。）组分在柱内随流动相不断移动（溶解于流动相）。（2）固定相与组分有亲合能力，即对组分有滞留
20、能）固定相与组分有亲合能力，即对组分有滞留能力（保留能力），使组分的速度低于流动相速度。力（保留能力），使组分的速度低于流动相速度。（3）性质不同的组分与固定相亲合力不同，固定相对其滞）性质不同的组分与固定相亲合力不同，固定相对其滞留能力（保留能力）不同，造成迁移速度不同（差速迁移）。留能力（保留能力）不同，造成迁移速度不同（差速迁移）。（4）经过一定柱长后，各组分因速度差异而分开，即）经过一定柱长后，各组分因速度差异而分开，即需要一定的柱长。需要一定的柱长。第30页，共59页，编辑于2022年，星期二二、色谱流出曲线（色谱图）二、色谱流出曲线（色谱图）所谓色谱流出曲线，即流出液中的组分浓度随
21、洗脱体积或洗脱所谓色谱流出曲线，即流出液中的组分浓度随洗脱体积或洗脱时间的变化曲线，也称色谱图。时间的变化曲线，也称色谱图。第31页，共59页，编辑于2022年，星期二获得：获得：（1）间隔一定时间或一定）间隔一定时间或一定流出体积，测定流出液中组流出体积，测定流出液中组分的浓度，以浓度为纵坐标，分的浓度，以浓度为纵坐标，时间或体积为横坐标，描点时间或体积为横坐标，描点作图即得作图即得（2）在柱子出口处设置检测器，）在柱子出口处设置检测器，如测定流出液的吸光度，换算如测定流出液的吸光度，换算成浓度（信号值），连续记录成浓度（信号值），连续记录流出液的吸光度随时间的变化，流出液的吸光度随时间的变
22、化，即得色谱图（仪器化）。即得色谱图（仪器化）。流出曲线是柱内组分分离结果流出曲线是柱内组分分离结果的反映，是研究色谱分离过程的反映，是研究色谱分离过程机理的依据，也是定性、定量机理的依据，也是定性、定量的依据。的依据。第32页，共59页，编辑于2022年，星期二色谱流出曲线的意义：色谱流出曲线的意义：色谱峰数色谱峰数=样品中单组分的最少个数；样品中单组分的最少个数；色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据；色谱峰高或面积色谱峰高或面积定量依据；定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。
23、固定相或流动相选择是否合适的依据。第33页，共59页，编辑于2022年，星期二三、几个重要的色谱参数及概念三、几个重要的色谱参数及概念（1）基线：）基线：在实验条件下，当只有流动相通过（检测器）色谱柱时，得到的流出曲线，通在实验条件下，当只有流动相通过（检测器）色谱柱时，得到的流出曲线，通常为一水平直线称为基线。常为一水平直线称为基线。（2）峰高（）峰高（h）：）：从色谱峰到基线的垂直距离。从色谱峰到基线的垂直距离。（3）峰宽（）峰宽（Wb）：）：从色谱峰的捌点作切线，与基线两交点之间的距离，也称基线宽度。从色谱峰的捌点作切线，与基线两交点之间的距离，也称基线宽度。（4）半峰宽（）半峰宽（W1
24、/2）：）：色谱峰高一半处峰的宽度（不是峰宽的一半）色谱峰高一半处峰的宽度（不是峰宽的一半）（5）标准偏差（）标准偏差（）：）：色谱峰两侧两捌点之间色谱峰两侧两捌点之间的距离的一半，也即的距离的一半，也即0.607h处的峰宽的一半。处的峰宽的一半。第34页，共59页，编辑于2022年，星期二|W、W1/2色谱意义：色谱意义：它们反映被分离的组分分子在柱内迁移时的离散程它们反映被分离的组分分子在柱内迁移时的离散程度度,W、W1/2越小，表示分子相对集中；越小，表示分子相对集中；W、W1/2 越大越大,表示分子相对分散。表示分子相对分散。第35页，共59页，编辑于2022年，星期二（6）拖尾因子）
25、拖尾因子T:0.951.05，色谱峰为对称，色谱峰为对称峰峰第36页，共59页，编辑于2022年，星期二（7）保留时间）保留时间(tR)（Retention time）流动相携带组分通过柱子所需要的时间，即从进样洗脱到流出液中组分流动相携带组分通过柱子所需要的时间，即从进样洗脱到流出液中组分的浓度出现极大值点所需要的时间。的浓度出现极大值点所需要的时间。（8）死时间）死时间(t0)不被固定相所滞留的组分通过色谱柱所用的时间，即不被固定相所滞留不被固定相所滞留的组分通过色谱柱所用的时间，即不被固定相所滞留的组分的保留时间，即死时间。的组分的保留时间，即死时间。在时间上，它等于流动相分子通过色谱柱
26、所需的时间，当某组分不被固在时间上，它等于流动相分子通过色谱柱所需的时间，当某组分不被固定相所滞留时，即完全随流动相移动，其移动速度完全等于流动相的速定相所滞留时，即完全随流动相移动，其移动速度完全等于流动相的速度，所以度，所以t0=tm。第37页，共59页，编辑于2022年，星期二（9）调整保留时间）调整保留时间(tR)：扣除死时间后的组分实际被固定相所保留扣除死时间后的组分实际被固定相所保留的时间的时间,即即tR=tR-t0=tR-tm意义：意义：|组分随流动相移动的时间都是相同的，都是死时间。它与固定相、组组分随流动相移动的时间都是相同的，都是死时间。它与固定相、组分的性质均无关，只与流
27、动相的流动速度有关，对分离不起作用。分的性质均无关，只与流动相的流动速度有关，对分离不起作用。|tR即为组分在固定相中出现的（保留的）时间，即组分被固定相所滞即为组分在固定相中出现的（保留的）时间，即组分被固定相所滞留的时间，与组分和固定相之间的作用力有关。留的时间，与组分和固定相之间的作用力有关。|tR是与组分和固定相性质有关的，更能从本质上反映出不同组分的差是与组分和固定相性质有关的，更能从本质上反映出不同组分的差异，反映色谱过程的实质。异，反映色谱过程的实质。第38页，共59页，编辑于2022年，星期二（10）保留体积）保留体积（VR）从进样开始到组分洗脱出柱所用的洗脱剂的体积（与流速无
28、关）。从进样开始到组分洗脱出柱所用的洗脱剂的体积（与流速无关）。（11）死体积）死体积（V0、Vm）不被固定相滞留的组分的保留体积不被固定相滞留的组分的保留体积(或不被固定相滞留的组分流出或不被固定相滞留的组分流出色谱柱所需要的洗脱剂的体积色谱柱所需要的洗脱剂的体积)。这个体积应等于柱内流动相的体积，即流动相的量，也即固定相这个体积应等于柱内流动相的体积，即流动相的量，也即固定相之间的空隙。之间的空隙。（12）调整保留体积）调整保留体积（VR）VR=VR-V0=VR-VM第39页，共59页，编辑于2022年，星期二（13）相对保留值（）相对保留值（2,1，2,1）以一已知物的调整保留值为基准，
29、其它各组分的调整保留值与之比以一已知物的调整保留值为基准，其它各组分的调整保留值与之比值即为值即为2,1，2,1。2,1=tR 2/tR 1=VR 2/VR 1=2,1须注意：须注意：|规定对于规定对于2,1须有须有tR 2tR1 VR 2VR 1 即即2,11。|对于对于2,1,“1”表示基准物质表示基准物质,“2”表示待测物质表示待测物质,用于定性分析。用于定性分析。|相对保留值只与固定相、组分及流动相的性质有关相对保留值只与固定相、组分及流动相的性质有关,与柱长、流速与柱长、流速等无关。等无关。|若两组分能分离若两组分能分离,则则2,11|2,1又称为选择性因子又称为选择性因子第40页，
30、共59页，编辑于2022年，星期二（14）柱长）柱长(L)柱中填充固定相部分的长度。柱中填充固定相部分的长度。第41页，共59页，编辑于2022年，星期二要点：要点：需掌握需掌握tR、VR、t0(tm)、tR、VR的色的色谱学意义及定义。谱学意义及定义。这些参数之间的关系，它们能说明什这些参数之间的关系，它们能说明什么问题么问题?第42页，共59页，编辑于2022年，星期二思考题：思考题：若一组分的分子通过色谱柱需若一组分的分子通过色谱柱需tR时间，流时间，流动相分子通过色谱柱需用动相分子通过色谱柱需用t0时间，问：该时间，问：该组分分子在色谱柱内有多少时间停留在固组分分子在色谱柱内有多少时间
31、停留在固定相上，有多少时间流动相中？定相上，有多少时间流动相中？第43页，共59页，编辑于2022年，星期二色谱法基本原理色谱法基本原理 p218色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰
32、的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。第44页，共59页，编辑于2022年，星期二一、色谱法分离过程的动力学观点一、色谱法分离过程的动力学观点所谓动力学观点是以分子的运动速度来所谓动力学观点是以分子的运动速度来考虑问题，研究的是状态随时间的变化考虑问题，研究的是状态随时间的变化率。率。第45页，共59页，编辑于2022年，星期二1 1、组分在色谱柱内的移动速度（绝对速度
33、）、组分在色谱柱内的移动速度（绝对速度）被分离的组分以一定的速度随流动相迁移。当考虑一个分子时，它的迁被分离的组分以一定的速度随流动相迁移。当考虑一个分子时，它的迁移速度受两个因素影响：移速度受两个因素影响：|（1）被固定相滞留在固定相表面，分子停止前进，这时速度）被固定相滞留在固定相表面，分子停止前进，这时速度u组组分分=0。|（2）溶解于流动相中，随流动相同速前进，这时）溶解于流动相中，随流动相同速前进，这时u组分组分=um。|所以组分分子在柱内的移动速度总是所以组分分子在柱内的移动速度总是流动相在柱内的速度，流动相在柱内的速度，即即um 是极限速度。是极限速度。组分移动速度的大小，决定于
34、固定相对组分的保留能力，即固定相与组组分移动速度的大小，决定于固定相对组分的保留能力，即固定相与组分间作用力的大小。分间作用力的大小。不同的组分，固定相对它的保留能力不同，其移动速度不同。不同的组分，固定相对它的保留能力不同，其移动速度不同。设组分的移动速度为设组分的移动速度为u组分组分（u组分组分=L/tR），），即绝对速度，此速度受到即绝对速度，此速度受到流动相流速的影响，人们将两个组分的速度都与流动相相比较，流动相流速的影响，人们将两个组分的速度都与流动相相比较，就得保留速度就得保留速度第46页，共59页，编辑于2022年，星期二2 2、保留因子（保留比，、保留因子（保留比，retent
35、ion factorretention factor、相对速、相对速度）度）用用RR表示，即：表示，即：R=u组分组分/um 1不同的组分的迁移速度不同，不同的组分的迁移速度不同，R不同，即固定相的保留能力不不同，即固定相的保留能力不同（也称滞留因子）；同（也称滞留因子）；R越小，则固定相对组分的保留能越小，则固定相对组分的保留能力越强。力越强。将保留因子用色谱参数表示：将保留因子用色谱参数表示：R=u组分组分/um =(L/tR)/(L/tm)=tm/tR =tm/（tm+tR）第47页，共59页，编辑于2022年，星期二意义：意义：组分在色谱柱内有组分在色谱柱内有tm时间随流动相移动时间随
36、流动相移动（u组分组分=um），有，有tR时间停在固定相上时间停在固定相上（u组分组分=0），所以在色谱柱内的时，所以在色谱柱内的时间为间为tR+tm=tR。由此可见，组分在色谱柱内的移动速度取决于由此可见，组分在色谱柱内的移动速度取决于tR，它直接反，它直接反映出固定相对组分的保留能力，映出固定相对组分的保留能力，tR不同，则不同，则u组分组分不同，即不同，即差速迁移，产生分离。差速迁移，产生分离。但是，从动力学观点，不能看出影响或决定不同组分迁移但是，从动力学观点，不能看出影响或决定不同组分迁移速度的因素，即固定相对分子的保留能力无法定量地描述速度的因素，即固定相对分子的保留能力无法定量地
37、描述出来，于是人们提出了平衡的观点。出来，于是人们提出了平衡的观点。第48页，共59页，编辑于2022年，星期二二、色谱分离过程的平衡观点二、色谱分离过程的平衡观点 平衡的观点不是以单一分子的个别运动状态来平衡的观点不是以单一分子的个别运动状态来考虑问题，而是以某一时间内和空间内的整体，即考虑问题，而是以某一时间内和空间内的整体，即某一区带的所有分子的行为来考察之某一区带的所有分子的行为来考察之。第49页，共59页，编辑于2022年，星期二 在色谱柱内很小的一段体积内（在色谱柱内很小的一段体积内（V），组分要在两相之间），组分要在两相之间进行分配，且迅速达到平衡，即从流动相进入固定相的分子数等
38、进行分配，且迅速达到平衡，即从流动相进入固定相的分子数等于从固定相回到流动相的分子数（单位体积内），这时，（在一于从固定相回到流动相的分子数（单位体积内），这时，（在一定温度下），组分在两相之间的浓度之比为一常数，我们称之为定温度下），组分在两相之间的浓度之比为一常数，我们称之为分配系数分配系数K。第50页，共59页，编辑于2022年，星期二1、分配系数分配系数K 是是指指在在一一定定温温度度和和压压力力下下，组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相之之间间分分配配达达平平衡衡时的浓度之比值，即时的浓度之比值，即 分分配配系系数数是是由由组组分分、固固定定相相、流流动动相相的的热热力力学学性性
39、质质决决定定的的，它它是是每每一一个个溶溶质质的的特特征征值值，它它与与固固定定相相、流流动动相相的的性性质质和和温温度度有有关关。与与两两相相体体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。第51页，共59页，编辑于2022年，星期二2、分配比、分配比（容量因子（容量因子k k）又称容量因子，是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平又称容量因子，是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 其中其中=Vm/Vs (相比相比)k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因
40、此又值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。第52页，共59页，编辑于2022年，星期二注意三点：注意三点：分配比是组分在两相中的总量之比，而不是浓度之比，分配比是组分在两相中的总量之比，而不是浓度之比，此量可以是重量数，也可以是摩尔数等。此量可
41、以是重量数，也可以是摩尔数等。VS 系指真正参与组分在两相之间分配的那一部分有效体系指真正参与组分在两相之间分配的那一部分有效体积，在不同的色谱体系中含义不同积，在不同的色谱体系中含义不同:分配色谱分配色谱指固定液的体积指固定液的体积 吸附色谱吸附色谱吸附剂表面积吸附剂表面积 离子交换色谱离子交换色谱交换剂的交换容量交换剂的交换容量 凝胶色谱凝胶色谱多孔固定相的孔容多孔固定相的孔容 分配系数与分配比的区别分配系数与分配比的区别 分配系数只决定于组分和两相的性质，与两相体积无关，分配系数只决定于组分和两相的性质，与两相体积无关，而分配比不仅决定于其性质，且与两相体积有关，所有的组而分配比不仅决定
42、于其性质，且与两相体积有关，所有的组分的分配比均随固定相的量而变化。分的分配比均随固定相的量而变化。第53页，共59页，编辑于2022年，星期二3、K、k与组分迁移速度的关系与组分迁移速度的关系 定性讨论定性讨论：若组分的若组分的K大，则组分在固定相中分配的量多，即固定相对大，则组分在固定相中分配的量多，即固定相对其保留能力强，移动速度应该慢；反之，保留能力弱。其保留能力强，移动速度应该慢；反之，保留能力弱。定量讨论定量讨论：K与保留时间的关系与保留时间的关系 因为因为 R=tm/tR=Nm/N总总 Nm：流动相中组分的分子数；：流动相中组分的分子数；Ns：固定相中组分的分子数：固定相中组分的
43、分子数；N总总：组分的分子总数：组分的分子总数 tm 占占tR 的比例越大，则分子花在流动相中的时间比例越大，移动的比例越大，则分子花在流动相中的时间比例越大，移动越快；即分子在流动相中停留的时间越多，则移动越快。越快；即分子在流动相中停留的时间越多，则移动越快。从分子总数来讨论：从分子总数来讨论：R=Nm/N总总 组分在流动相中分子数占总分子数的比例越大，则组分移动越快，即组分组分在流动相中分子数占总分子数的比例越大，则组分移动越快，即组分在流动相中分子数越多，分子停留在流动相中的时间就越多。在流动相中分子数越多，分子停留在流动相中的时间就越多。第54页，共59页，编辑于2022年，星期二所
44、以所以 R=tm/tR =Nm/N总总=Nm/(Nm+Ns）=tm/(tm+tR)=CmVm/（CmVm+CsVs）=1 /（1+CsVs/CmVm）=1 /（1+KVs/Vm）=1 /（1+k）所以所以 tR=tm（1+KVs/Vm）=tm（1+k）保留方程保留方程所以所以 k=t R/tm若将若将 tR=tm（1+k）=tm（1+KVs/Vm）两边统乘以流量（两边统乘以流量（ml/min）（体积流量）（体积流量）则则 VR=Vm（1+k）=Vm+KVs 基本保留方程基本保留方程第55页，共59页，编辑于2022年，星期二4、保留方程讨论、保留方程讨论（1）K、k越大，越大，tR 越大，组分
45、移动速度越慢，越大，组分移动速度越慢，所以组分的迁移速度由组分的分配系数所以组分的迁移速度由组分的分配系数(比比)决定。决定。（2）K、k=0时，组分不被固定相所滞留，此时时，组分不被固定相所滞留，此时 tR=tm，即为非滞留组分；，即为非滞留组分；K、k时，时，tR，组分强烈滞留，无法洗脱；组分强烈滞留，无法洗脱；所以所以 K 一般在一般在 110 之间为宜之间为宜。（3）两组分要得以分离，则）两组分要得以分离，则tR1 tR2，即，即K1K2，kk，即它即它们的分配系数、分配比必须有差异。们的分配系数、分配比必须有差异。第56页，共59页，编辑于2022年，星期二（4）tR=tm+tmk
46、即即tR=tmk 所以组分在固定相上的停留时间取决于分配比。所以组分在固定相上的停留时间取决于分配比。保留方程的色谱意义：保留方程的色谱意义：|一个组分出柱所需要的时间由两部分组成：一个组分出柱所需要的时间由两部分组成：tm、tmk，|tm表示组分必须随流动相一起移动同样的时间才能出柱，即表示组分必须随流动相一起移动同样的时间才能出柱，即死时间。死时间。|tmk表示组分从两相界面进入固定相进行分配，然后再返回两相界表示组分从两相界面进入固定相进行分配，然后再返回两相界面所用的时间，即组分保留在固定相中的时间，它决定于组分的面所用的时间，即组分保留在固定相中的时间，它决定于组分的分配比。分配比。
47、|这说明，这说明，tm、Vm不反映组分在两相之间的分配行为，它对任何组不反映组分在两相之间的分配行为，它对任何组分都是相同的，真正反是映分配行为的是分都是相同的，真正反是映分配行为的是tR、VR。第57页，共59页，编辑于2022年，星期二（5）因为）因为 tR=tmk VR=Vmk 所以所以 2,1=tR2/tR1 =k2/k1 =K2/K1 即即2,1只与温度、两相的性质有关，与柱长、柱径、流只与温度、两相的性质有关，与柱长、柱径、流速、填充情况无关。速、填充情况无关。（6）保留值（）保留值（tR、VR、2,1）是一种定性指标，可用于）是一种定性指标，可用于定性分析，因为定性分析，因为K、
48、k与组分性质有关，相同组分在同一与组分性质有关，相同组分在同一色谱条件下，其色谱条件下，其K、k应相同，即（应相同，即（tR、VR、2,1）应相同。）应相同。第58页，共59页，编辑于2022年，星期二例题：组分例题：组分A在柱内的移动速度只有流动相速度的在柱内的移动速度只有流动相速度的1/10，柱内，柱内流动相体积为流动相体积为2.0 ml，固定相有效体积为，固定相有效体积为0.5 ml，求流动相流量，求流动相流量为为10 ml/mim时，组分时，组分A停留在固定相的时间和它的分配系数。停留在固定相的时间和它的分配系数。解：解：R=uA/um=tm/tR=1/10=1/(1+K)K=9 K=k=K（Vm/Vs）=9*（2/0.5）=36 tR=tmk=(Vm/um)*k=9*（2.0/10）=1.8 min 或或 uA=R um=(1/10)*10=1 ml/min tm=Vm/um=2/10=0.2 min tR=10tm=2 min 所以所以 tR=tR-tm=2-0.2=1.8 min K=tR/tm 1=2/0.2 1=9第59页，共59页，编辑于2022年，星期二