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1、色谱法原理第1页，共36页，编辑于2022年，星期二1涡流扩散项涡流扩散项A Eddy diffusion term 在在填填充充色色谱谱柱柱中中，在在填填充充色色谱谱柱柱中中，当当组组分分随随流流动动相相向向柱柱出出当当组组分分随随流流动动相相向向柱柱出出口口迁迁移移时时，流流动动相相由由于于口口迁迁移移时时，流流动动相相由由于于受受到到固固定定相相颗颗粒粒障障碍碍，受受到到固固定定相相颗颗粒粒障障碍碍，不不断断改改变变流流动动方方向向，使使不不断断改改变变流流动动方方向向，使使组组分分分分子子在在前前进进中中形形成成组组分分分分子子在在前前进进中中形形成成紊紊乱乱的的类类似似紊紊乱乱的的类
2、类似似“涡涡流流涡涡流流”的的的的流流动动，故故称称涡涡流流扩扩散散，流流动动，故故称称涡涡流流扩扩散散，形形象象地地如如右右形形象象地地如如右右图图所所示示。第2页，共36页，编辑于2022年，星期二 A2dp d dp p：固定相的平均颗粒直径：固定相的平均颗粒直径：固定相的平均颗粒直径：固定相的平均颗粒直径;：固定相的填充不均匀因子：固定相的填充不均匀因子 上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。因此A0。第3页，共36页，
3、编辑于2022年，星期二2.分子扩散项B/u（纵向扩散项）Molecular diffusion or longitudinal diffusion termMolecular diffusion or longitudinal diffusion term 纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。如右图所示。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为第4页，共36页，编辑于2022年，星期二 B2Dg ：弯曲因子，填充柱色谱，弯曲因子，填充柱色谱，弯曲因子，填充柱色谱，弯曲因子，填充柱色谱，
4、11 D Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2 2ss-1）(1)(1)存在着浓度差，产生纵向扩散存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)(2)扩散导致色谱峰变宽，扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差，分离变差;(3)(3)分子扩散项与流速有关，流速分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，滞留时间，扩散，扩散;(4)(4)扩散系数：扩散系数：Dg (M载气载气)-1/2)-1/2 ；M载气载气，B B值值。第5页，共36页，编辑于2022年，星期二3传质阻力项传质阻力项Cu Mass transfer resistance term 由于气相色谱以气体为流动
5、相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论之 （l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数气相传质阻力系数(gasmass transfer resistance coefficient)Cg和液相传质阻力系数液相传质阻力系数(liquidmass transfer resistance coefficient)Cl两项，即 CCgCl第6页，共36页，编辑于2022年，星期二 气气气气相相相相传传传传质质质质过过过过程程程程是是是是指指指指试试试试样样样样组组组组分分分分从从从从气气气气相相相相移移移移动动动动到到到到固固固固定定定定相相相相表表表表面面面面的
6、的的的过过过过程程程程。这这这这一一一一过过过过程程程程中中中中试试试试样样样样组组组组分分分分将将将将在在在在两两两两相相相相间间间间进进进进行行行行质质质质量量量量交交交交换换换换，即即即即进进进进行行行行浓浓浓浓度度度度分分分分配配配配。有有有有的的的的分分分分子子子子还还还还来来来来不不不不及及及及进进进进入入入入两两两两相相相相界界界界面面面面，就就就就被被被被气气气气相相相相带带带带走走走走；有有有有的的的的则则则则进进进进人人人人两两两两相相相相界界界界面面面面又又又又来来来来不不不不及及及及返返返返回回回回气气气气相相相相。这这这这样样样样，使使使使得得得得试试试试样样样样在在
7、在在两两两两相相相相界界界界面面面面上上上上不不不不能能能能瞬瞬瞬瞬间间间间达达达达到到到到分分分分配配配配平平平平衡衡衡衡，引引引引起起起起滞滞滞滞后后后后现现现现象象象象，从从从从而而而而使使使使色色色色谱谱谱谱峰峰峰峰变变变变宽宽宽宽。对对对对于于于于填填填填充充充充柱柱柱柱，气气气气相相相相传传传传质质质质阻力系数阻力系数阻力系数阻力系数C Cg g为为为为式中式中式中式中k为容量因子为容量因子为容量因子为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度的平方成。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度的平方成。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度的平方成。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒
8、度的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数见成反比。因此，采用粒度小的填正比、与组分在载气流中的扩散系数见成反比。因此，采用粒度小的填正比、与组分在载气流中的扩散系数见成反比。因此，采用粒度小的填正比、与组分在载气流中的扩散系数见成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使C Cg g减小，提高减小，提高减小，提高减小，提高柱效。柱效。柱效。柱效。第7页，共36页，编辑于2022年，星期二液相传质阻力系数C1为 liqu
9、idmass transfer resistance coefficient 由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数Dl大，则液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使Cl增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离。虽然提高柱温可增大Dl，但会使k值减小，为了保持适当的Cl值，应控制适宜的柱温。第8页，共36页，编辑于2022年，星期二将上面各式总结，即可得气液色谱速率板高方程将上面各式总结，即可得气液色谱速率板高方程:这一方程对选
10、择色谱分离条件具有实际指这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程填充的均匀程度度，填料颗粒的大小填料颗粒的大小，流动相的种类及流动相的种类及流速流速，固定相的液膜厚度固定相的液膜厚度等对柱效的影响。等对柱效的影响。第9页，共36页，编辑于2022年，星期二 （2 2）对于液液分配色谱，传质阻力系数（）对于液液分配色谱，传质阻力系数（）对于液液分配色谱，传质阻力系数（）对于液液分配色谱，传质阻力系数（C）包含）包含流流流流动相传质阻力系数动相传质阻力系数动相传质阻力系数动相传质阻力系数mobilephasemasstransferresista
11、ncecoefficient（C Cmm）和）和）和）和固定相传质系数固定相传质系数固定相传质系数固定相传质系数stationaryphasemasstransferresistancecoefficient（C Cs s），即），即），即），即 CCmCs 其其中中Cm又又包包含含流流动动的的流流动动相相中中的的传传质质阻阻力力和和滞滞留留的的流流动相中动相中的传质阻力，即的传质阻力，即第10页，共36页，编辑于2022年，星期二式中右边第一项为式中右边第一项为流动相中的传质阻力流动相中的传质阻力。当流动相流过色。当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流谱柱内的填充物
12、时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀.m是是是是由柱和填充物的性质决定的因子。由柱和填充物的性质决定的因子。由柱和填充物的性质决定的因子。由柱和填充物的性质决定的因子。sm是是一一常常数数，它它与与颗颗粒粒微微孔孔中中被被流流动动相相所所占占据据部部分分的的分分数及容量因子有关。数及容量因子有关。液液色谱中固定相传质阻力系数（液液色谱中固定相传质阻力系数（Cs）可用下式表示：）可用下式表示：第11页，共36页，编辑于2022年，星期二 该式与气液色谱速率方程的形式基该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要
13、区别在液液色谱中纵向扩本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。是传质阻力项。综上所述，对液液色谱的综上所述，对液液色谱的VanDeemter方程式可表方程式可表达为：达为：第12页，共36页，编辑于2022年，星期二速率理论方程的修正速率理论方程的修正 Modificationofratetheoreticequation1.Giddings方程(1961年)2.Huber方程E称为峰展宽常数，这些方程各有优劣。称为峰展宽常数，这些方程各有优劣。第13页，共36页，编辑于2022年，星期二速率理论的要点速率理论的要点
14、Key points of rate theory (1)(1)组组分分分分子子在在柱柱内内运运行行的的多多路路径径与与涡涡流流扩扩散散、浓浓度度梯梯度度所所造造成成的的分分子子扩扩散散及及传传质质阻阻力力使使气气液液两两相相间间的的分分配配平平衡衡不不能能瞬瞬间间达达到到等等因因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。(2)通通过过选选择择适适当当的的固固定定相相粒粒度度、载载气气种种类类、液液膜膜厚厚度度及及载载气气流流速速可可提提高柱效。高柱效。(3)(3)速速率率理理论论为为色色谱谱分分离离和和操操作作条条件件选选择择提提供供了了理理论论指指导导
15、。阐阐明明了了流速和柱温对柱效及分离的影响。流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各各种种因因素素相相互互制制约约，如如载载气气流流速速增增大大，分分子子扩扩散散项项的的影影响响减减小小，使使柱柱效效提提高高，但但同同时时传传质质阻阻力力项项的的影影响响增增大大，又又使使柱柱效效下下降降；柱柱温温升升高高，有有利利于于传传质质，但但又又加加剧剧了了分分子子扩扩散散的的影影响响，选选择择最佳条件，才能使柱效达到最高。最佳条件，才能使柱效达到最高。第14页，共36页，编辑于2022年，星期二四四.载气流速与柱效载气流速与柱效最佳流速最佳流速 Optimal rate Flow rate of car
16、rier gas and column efficiency载气流速高时：载气流速高时：传传质质阻阻力力项项是是影影响响柱柱效效的的主主要因素，要因素，流速流速，柱效，柱效。载气流速低时：载气流速低时：分分子子扩扩散散项项成成为为影影响响柱柱效效的的主主要因素，要因素，流速流速,柱效柱效 H-u曲线与最佳流速：曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。小值。以塔板高度以塔板高度
17、H对应载气流速对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为作图，曲线最低点的流速即为最佳最佳流速流速。第15页，共36页，编辑于2022年，星期二五流动相线速度对板高的影响五流动相线速度对板高的影响 Effect of line velocity of mobile phase on plate height (1)LC1)LC和和和和GCGC的的Hu u图表明图表明(下图下图下图下图)：一定长度的柱子，柱效越高，理论塔板数越大，板一定长度的柱子，柱效越高，理论塔板数越大，板一定长度的柱子，柱效越高，理论塔板数越大，板一定长度的柱子，柱效越高，理论塔板数越大，板高越小。但究竟控制怎样的线速度，才能
18、达到最小板高高越小。但究竟控制怎样的线速度，才能达到最小板高高越小。但究竟控制怎样的线速度，才能达到最小板高高越小。但究竟控制怎样的线速度，才能达到最小板高呢？呢？呢？呢？由图由图由图由图a a和和b看出：看出：看出：看出：LCLC和和和和GCGC的的的的HHu图十分相似，图十分相似，图十分相似，图十分相似，对应对应某一流速都有一个板高的极小值某一流速都有一个板高的极小值(柱效最高点柱效最高点柱效最高点柱效最高点)；LCLC板板板板高极小值比高极小值比高极小值比高极小值比GCGC的极小值小一个数量级以上，说明的极小值小一个数量级以上，说明的极小值小一个数量级以上，说明的极小值小一个数量级以上，
19、说明LC的的的的柱效比柱效比柱效比柱效比GCGC高得多高得多,LC的的的的柱效最高点柱效最高点柱效最高点柱效最高点相应流速相比相应流速相比GCGC的流速亦小一个数量级，说明对于的流速亦小一个数量级，说明对于的流速亦小一个数量级，说明对于的流速亦小一个数量级，说明对于LCLC，为了取得良好的，为了取得良好的，为了取得良好的，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。柱效，流速不一定要很高。柱效，流速不一定要很高。柱效，流速不一定要很高。第16页，共36页，编辑于2022年，星期二（2）分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献（见）分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献（见图）图）第17页，共36页，编辑于20
20、22年，星期二 六.固定相粒度大小对板高的影响 Effect of particles granularity of stationary phase on plate height第18页，共36页，编辑于2022年，星期二 图图中中固固定定相相粒粒度度对对板板高高的的影影响响是是至至关关重重要要的的。实实验验表表明明不不同同粒粒度度，Hu曲曲线线也也不不同同（见见图图）：粒粒度度越越细细，板板高高越越小小，并并且且受受线线速速度度影影响响亦亦小小。这这就就是是为为什什么么在在HPLC中中采采用用细细颗颗粒粒作作固固定定相相的的根根据据。当当然然，固固定定相相颗颗粒粒愈愈细细，柱柱流流速速愈
21、愈慢慢。只只有有采采取取高高压压技技术术，流流动动相相流流速速才才能符合实验要求。能符合实验要求。第19页，共36页，编辑于2022年，星期二4 4 分离度分离度 Separationdegree 右右图图说说明明了了柱柱效效和和选选择择性性对对分分离离的的影影响响。图图中中（a）两两色色谱谱峰峰距距离离近近并并且且峰峰形形宽宽。两两峰峰严严重重相相叠叠，这这表表示示选选择择性性和和柱柱效效都都很很差差。图图中中（b）虽虽然然两两峰峰距距离离拉拉开开了了，但但峰峰形形仍仍很很宽宽，说说明明选选择择性性好好，但但柱柱效效低低。图图中中（c）分分离离最最理理想想，说说明明选选择择性性好好，柱柱效也
22、高。效也高。第20页，共36页，编辑于2022年，星期二 由此可见，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引人一个综合性指标分分分分离离离离度度度度R R。分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分分分分离离离离度度度度又又又又叫叫叫叫分分分分辨辨辨辨率率率率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即R R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R1时，时，两峰有部分重叠；当两峰有部分重叠；当R1时，分离程度可达时，分离程度可达98；当；当R15时，分离程度可达时，分离程度可达9
23、97。通常用。通常用R=1.5作为相邻两作为相邻两组分已完全分离的标志。组分已完全分离的标志。第21页，共36页，编辑于2022年，星期二下图表示了不同分离度时色谱峰分离的程度。第22页，共36页，编辑于2022年，星期二5 5 基本色谱分离方程式基本色谱分离方程式 Basic chromatographic separation equations 分离度受柱效(n)、选择因子()和容量因子(k)三个参数的控制。对于难分离物质对，由于它们的分配系数差别小，可合理地假设k1k2=k,W1W2W。由上式，得后式即为基本色谱分离方程式后式即为基本色谱分离方程式 第23页，共36页，编辑于2022年
24、，星期二在实际应用中，往往用在实际应用中，往往用neff代替代替n,处理上式可得处理上式可得 可以看出，后者为基本色谱分离方程式可以看出，后者为基本色谱分离方程式又一表达式。又一表达式。第24页，共36页，编辑于2022年，星期二(1).分离度与柱效的关系分离度与柱效的关系 Relation between R and column efficiency 由分离方程式看出，具有一定相对保留值的物质对，分离度直接和有效塔板数有关，说明有效塔板数能正确地代表柱效能。而分离方程式表明分离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响。当固定相确定，被分离物质对的确定后，分离度将取决于n。这时，对于一定理论
25、板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即第25页，共36页，编辑于2022年，星期二 虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。通过降低板高，以提高分离度。通过降低板高，以提高分离度。通过降低板高，以提高分离度。(2).分
26、离度与选择因子的关系分离度与选择因子的关系 RelationbetweenRand 由基本色谱方程式判断，当=1时，R=0，这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，大，选择性好。研究证明，的微小变化，就能引起分离度的显著变化。一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大值。第26页，共36页，编辑于2022年，星期二(3).分离度与容量因子的关系分离度与容量因子的关系 RelationbetweenRand k如果令：则分离方程式写成 第27页，共36页，编辑于2022年，星期二 由R/Qk的曲线图看出：当k10时，随容量因子增大，分离度的增长是微乎其微的。一般取k为3
27、10最宜。对于GC，通过提高温度，可选择合适的k值，以改进分离度。而对于LC，只要改变流动相的组成，就能有效地控制k值。它对LC的分离能起到立竿见影的效果（见图）。第28页，共36页，编辑于2022年，星期二(4).分离度与分析时间的关系分离度与分析时间的关系RelationbetweenRandtr下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系。下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系。下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系。下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系。从上式，设则可得：第29页，共36页，编辑于2022年，星期二 由由图图中中RQ或或trQ对对k的的曲曲线线可可见见，当当
28、k在在25时时，可可在在较较短短的的分分析析时时间间，取取得得良良好好的的分分离离度。度。第30页，共36页，编辑于2022年，星期二(5).基本色谱分离方程式基本色谱分离方程式 Basic chromatographic separation equationsBasic chromatographic separation equations R=0.8：两峰的分离程度可达：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度：分离程度98%；R=1.5：达：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。（相邻两峰完全分离的标准）。第31页，共36页，编辑于2022年，星期二Example1 在在一一定定
29、条条件件下下，两两个个组组分分的的调调整整保保留留时时间间分分别别为为85秒秒和和100秒秒，要要达达到到完完全全分分离离，即即R=1.5。计计算算需需要要多多少少块块有有效效塔塔板板。若若填填充充柱柱的塔板高度为的塔板高度为0.1cm，柱长是多少？，柱长是多少？解：解：21=100/85=1.18(?)neff=16R2 21/(211)2=161.52(1.18/0.18)2=1547（块）（块）Leff=neffHeff=15470.1=155cm即柱长为即柱长为1.55米时，米时，两组分可以得到完全分离。两组分可以得到完全分离。第32页，共36页，编辑于2022年，星期二Example
30、2在在一一定定条条件件下下，1m长长的的柱柱子子，如如果果n=3600，两两个个组组分分的的保保留留时时间间分分别别为为12.2s和和12.8s，计计算算分分离离度度。要要达达到到完完全全分分离离，即即R=1.5，所所需需要要的柱长是多少？的柱长是多少？解：解：分离度分离度：塔板数增加一倍，分离度增加多少？塔板数增加一倍，分离度增加多少？第33页，共36页，编辑于2022年，星期二 1.有有一一根根lm长长的的柱柱子子，分分离离组组分分1和和2得得到到如如下下的的色色谱谱图图。图图中中横横坐坐标标l为为记记录录笔笔走走纸纸距距离离。若若欲欲得得到到R=1.2的的分分离离度度，有有效效塔塔板板数
31、数应应为为多多少？色谱柱要加到多长？少？色谱柱要加到多长？Exercises第34页，共36页，编辑于2022年，星期二 2.已知某色谱柱的理论塔板数为已知某色谱柱的理论塔板数为3600,组分组分A和和B在该柱上的保留时间为在该柱上的保留时间为27mm和和30mm,求两峰的峰半求两峰的峰半宽和分离度宽和分离度.3.已已 知知 一一 色色 谱谱 柱柱 在在 某某 温温 度度 下下 的的 速速 率率 方方 程程 的的A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求求最最佳佳线线速速度度u和最小塔板高和最小塔板高H.第35页，共36页，编辑于2022年，星期二 4.已知物质已知物质A和和B在一个在一个30.0cm柱上的保留时柱上的保留时间分别为间分别为16.40和和17.63分钟分钟.不被保留组分通过该不被保留组分通过该柱的时间为柱的时间为1.30分钟分钟.峰宽为峰宽为1.11和和1.21mm,计算计算:(1)柱分辨本领柱分辨本领;(2)柱的平均塔板数目柱的平均塔板数目;(3)塔板高度塔板高度;(4)达到达到1.5分离度所需的柱长度分离度所需的柱长度;(5)在较长柱上把物质在较长柱上把物质B洗脱所需要的时间洗脱所需要的时间.第36页，共36页，编辑于2022年，星期二