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1、色谱法分离原理1第1页，共163页，编辑于2022年，星期二 色谱法早在色谱法早在19031903年由俄国植物学家年由俄国植物学家茨维特茨维特分离植物色素时采用。分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为这种方法因此得名为色谱法色谱法。以后此法逐渐。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，应用于无色物质的分
2、离，“色谱色谱”二字虽二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。第2页，共163页，编辑于2022年，星期二ts第3页，共163页，编辑于2022年，星期二1941 Martin和Synge提出液-液色谱理论；1952 James和Martin发展了气相色谱；1956 Van Deemter提出速率理论；1967 Kirkland等研制高效液相色谱法；80年代以后年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱分析方法。色谱等一系列新的色谱分析方法。第4页，共163页，编辑于2022年，星期二 n在色谱法中，将填入玻璃管或
3、不锈钢管在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相固定相 ；n自上而下运动的一相（一般是气体或自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为液体）称为流动相流动相 ；n装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为称为色谱柱色谱柱 。第5页，共163页，编辑于2022年，星期二n当流动相中样品混合物经过固定相时，当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，
4、用的类型、强弱也有差异，因此在同一因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。序从固定相中流出。第6页，共163页，编辑于2022年，星期二从不同角度，可将色谱法分类如下：从不同角度，可将色谱法分类如下：1.按两相状态分类按两相状态分类n气气体体为为流流动动相相的的色色谱谱称称为为气气相相色色谱谱（GC）根根据据固固定定相相是是固固体体吸吸附附剂剂还还是是固固定定液液（附附着着在在惰惰性性载载体体上上的的一一薄薄层层有有机机化化合合物物液液体体），又可分为又可分为气固色谱（气
5、固色谱（GSCGSC）和气液色谱（）和气液色谱（GLCGLC）。第7页，共163页，编辑于2022年，星期二液体为流动相的色谱称液体为流动相的色谱称液相色谱（液相色谱（LCLC）同理液相色谱亦可分为同理液相色谱亦可分为液固色谱（液固色谱（LSCLSC）和）和液液色谱（液液色谱（LLCLLC）。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色超临界流体色谱（谱（SFCSFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称色谱又称化学键合相色谱（化学键合相色谱（CBP
6、CCBPC）。第8页，共163页，编辑于2022年，星期二2.2.按分离机理分类按分离机理分类n利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法吸附色谱法。n利用组分在固定液（固定相）中溶解度利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为不同而达到分离的方法称为分配色谱法分配色谱法。n利用组分在离子交换剂（固定相）上的利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称亲和力大小不同而达到分离的方法，称为为离子交换色谱法离子交换色谱法。第9页，共163页，编辑于2022
7、年，星期二利用大小不同的分子在多孔固定相中的选利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为和力进行分离的技术称为亲和色谱法亲和色谱法，常，常用于蛋白质的分离。用于蛋白质的分离。第10页，共163页，编辑于2022年，星期二3.3.按固定相的外型分类按固定相的外型分类n固定相装于柱内的色谱法，称为固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱
8、柱色谱。n固固定定相相呈呈平平板板状状的的色色谱谱，称称为为平平板板色色谱谱，它又可分为它又可分为薄层色谱和纸色谱薄层色谱和纸色谱。第11页，共163页，编辑于2022年，星期二4.4.按照展开程序分类按照展开程序分类 按按照照展展开开程程序序的的不不同同，可可将将色色谱谱法法分分为为洗洗脱法脱法、顶替法顶替法、和迎头法和迎头法。n 洗脱法也称冲洗法洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同
9、，各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图分彼此分离。流出曲线下图第12页，共163页，编辑于2022年，星期二AB 这种方法能使样品的各组分获得良好的这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中色谱法中最常用最常用的一种方法。的一种方法。第13页，共163页，编辑于2022年，星期二顶替法是将样品加到色谱柱头后顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流
10、动，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图下图第14页，共163页，编辑于2022年，星期二 此法适于制备纯物质或浓缩分离某此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分
11、；其一组分；其缺点是经一次使用后，柱子缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。用。AB第15页，共163页，编辑于2022年，星期二迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图流出曲线如下图 该法在分离多组分混
12、合物时，除第一组分外，其该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分中切割出一个高纯组分（组分A A），），而不适用于对混合而不适用于对混合物进行分离。物进行分离。第16页，共163页，编辑于2022年，星期二分类分类按流动相分按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱第17页，共163页，编辑于2022年，星期二按固定相在支持按固定相在支持体中的形状分体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率分
13、按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱第18页，共163页，编辑于2022年，星期二第二节第二节 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语（一）色谱流出曲线和色谱峰（一）色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的信号强度对时间作图，由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。峰是对称的。第19
14、页，共163页，编辑于2022年，星期二第20页，共163页，编辑于2022年，星期二（二）基线（二）基线 在实验操作条件下，在实验操作条件下，色谱柱后没有样色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线品组分流出时的流出曲线称为基线，稳，稳定的基线应该是一条水平直线。定的基线应该是一条水平直线。（三）峰高（三）峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（以（h h）表示。）表示。第21页，共163页，编辑于2022年，星期二 n色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线和色谱峰n基线（基线（a）n峰高（峰高（h）信信号号进样空气峰ha色谱流出曲线色谱流出曲线色谱峰色谱峰第2
15、2页，共163页，编辑于2022年，星期二（四）保留值（四）保留值 1.1.死时间死时间t tM M 不不被被固固定定相相吸吸附附或或溶溶解解的的物物质质进进入入色色谱谱柱柱时时，从从进进样样到到出出现现峰峰极极大大值值所所需需的的时时间间称称为为死死时时间间，它它正正比比于于色色谱谱柱柱的的空空隙体积，如下图。隙体积，如下图。信号进样tM第23页，共163页，编辑于2022年，星期二因为这种物质不被固定相吸附或溶解，因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故故其流动速度将与流动相流动速度相近。其流动速度将与流动相流动速度相近。测测定流动相平均线速定流动相平均线速 时，可用柱长时，可用柱长L L与与
16、t tM M的比的比值计算，即值计算，即=L/tM第24页，共163页，编辑于2022年，星期二2.保留时间保留时间tR试样从进样到柱后出现峰极大点时所试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。经过的时间，称为保留时间，如下图。信信号号进样进样tR第25页，共163页，编辑于2022年，星期二3.3.调整保留时间调整保留时间t tR R 某组分的保留时间扣除死时间后，称某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的为该组分的调整保留时间调整保留时间，即即 tR=tR tM 由由于于组组分分在在色色谱谱柱柱中中的的保保留留时时间间t tR R包包含含了了组组分分随随流流动动相
17、相通通过过柱柱子子所所需需的的时时间间和和组组分分在在固固定定相相中中滞滞留留所所须须的的时时间间，所所以以t tR R实实际际上是组分在固定相中保留的总时间。上是组分在固定相中保留的总时间。第26页，共163页，编辑于2022年，星期二保保留留时时间间是是色色谱谱法法定定性性的的基基本本依依据据，但但同同一一组组分分的的保保留留时时间间常常受受到到流流动动相相流流速速的的影影响响，因因此此色色谱谱工工作作者者有有时时用用保保留留体积来表示保留值。体积来表示保留值。第27页，共163页，编辑于2022年，星期二4.4.死体积死体积V V0 0 指色谱柱在填充后，柱管内固定相指色谱柱在填充后，柱
18、管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，和。当后两项很小可忽略不计时，死体死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速积可由死时间与色谱柱出口的载气流速F Fcoco（cmcm3 3minmin-1-1）计算）计算。第28页，共163页，编辑于2022年，星期二V0=tMFco式中式中Fco为扣除饱和水蒸气压并为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。经温度校正的流速。仅适用于气相色仅适用于气相色谱谱，不适用于液相色谱，不适用于液相色谱。第29页，共163页，编辑于20
19、22年，星期二5.5.保留体积保留体积V VR R 指从进样开始到被测组分在指从进样开始到被测组分在柱后出柱后出现浓度极大点现浓度极大点时所通过的流动相的体积。时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：保留时间与保留体积关系：VR=tR Fco 第30页，共163页，编辑于2022年，星期二6.6.调整保留体积调整保留体积V VR R 某组分的保留体积扣除死体积后，称为该某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。组分的调整保留体积。VR=VR V0=tR Fco第31页，共163页，编辑于2022年，星期二7.7.相对保留值相对保留值r r2,12,1 某组分某组分2 2的
20、调整保留值与组分的调整保留值与组分1 1的调整的调整保留值之比，称为相对保留值。保留值之比，称为相对保留值。r2,1=tR2/tR1=VR2/VR1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据用作定性的依据。第32页，共163页，编辑于2022年，星期二 在定性分析中，通常固定一个色谱峰在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（作为标准（s s），然后再求其它峰（），然
21、后再求其它峰（i i）对）对这个峰的相对保留值，此时可用符号这个峰的相对保留值，此时可用符号 表表示，即示，即 =tR(i)/tR(s)相对保留值往往可作为衡量固定相选相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。择性的指标，又称选择因子。第33页，共163页，编辑于2022年，星期二(五五)区域宽度区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有域宽度通常有三种方法三种方法。第34页，共163页，编辑
22、于2022年，星期二1.1.标准偏差标准偏差-即即0.6070.607倍峰高处色谱峰倍峰高处色谱峰宽的一半。宽的一半。2.2.半半峰峰宽宽Y Y1/21/2-即即峰峰高高一一半半处处对对应应的的峰峰宽宽。它与标准偏差的关系为它与标准偏差的关系为 Y Y1/21/2=2.354=2.354 3.3.峰峰底底宽宽度度Y Y-即即色色谱谱峰峰两两侧侧拐拐点点上上的的切切线线在在基基线线上上截截距距间间的的距距离离。它它与与标标准准偏偏差差 的关系是的关系是 Y=4 Y=4 第35页，共163页，编辑于2022年，星期二第36页，共163页，编辑于2022年，星期二从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：
23、从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)(i)根根据据色色谱谱峰峰的的个个数数，可可以以判判断断样样品品中中所所含含 组分的最少个数；组分的最少个数；(ii)(ii)根根据据色色谱谱峰峰的的保保留留值值，可可以以进进行行定定性性分分析；析；(iii)(iii)根根据据色色谱谱峰峰的的面面积积或或峰峰高高，可可以以进进行行定定量分析；量分析；(iv)(iv)色色谱谱峰峰的的保保留留值值及及其其区区域域宽宽度度，是是评评价价色谱柱分离效能的依据；色谱柱分离效能的依据；(v)(v)色色谱谱峰峰两两峰峰间间的的距距离离，是是评评价价固固定定相相（或或流动相）选择是否合适的依据。流动相）选择是否合适的
24、依据。第37页，共163页，编辑于2022年，星期二 色谱分析的色谱分析的目的目的是将样品中是将样品中各组分彼此分离各组分彼此分离，组分要，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过组分
25、在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。方面来研究色谱行为。第38页，共163页，编辑于2022年，星期二（一）分配系数（一）分配系数K K和分配比和分配比k k1.1.分配系数分配系数K K 分分配配色色谱谱的的分分离离是是基基于于样样品品组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相之之间间反反复复多多次次的的分分配配过过程程，而而吸吸附附色色谱谱的的分分离离是是基基于于反反复复多多次次的的吸吸附附-脱脱附附过过程。程。这这种种分分离离过过程程经经常常用用样样品品分分子子在在两两相相
26、间间的的分分配配来来描描述述，而而描描述述这这种种分分配配的的参参数数称称为为分配系数分配系数K K。第39页，共163页，编辑于2022年，星期二 它它（K K）是是指指在在一一定定温温度度和和压压力力下下，组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相之之间间分分配配达达平平衡衡时时的的浓浓度度之之比值，即比值，即 K=K=溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度 =Cs/Cm 第40页，共163页，编辑于2022年，星期二 分配系数是由组分和固定相的热力分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征学性质决定的，它是每一个溶质的特征值
27、，它仅与两个变量有关：值，它仅与两个变量有关：固定相和温固定相和温度度。与两相体积、柱管的特性以及所使。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。用的仪器无关。第41页，共163页，编辑于2022年，星期二2.2.分配比分配比 k k 分配比又称分配比又称容量因子容量因子，它是指在一定温度，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的物质的量比。即配在固定相和流动相中的物质的量比。即 k=组分在固定相中的物质的量组分在固定相中的物质的量/组分在流动相中的物质的量组分在流动相中的物质的量=ns/nm第42页，共163页，编辑
28、于2022年，星期二 k k值值越越大大，说说明明组组分分在在固固定定相相中中的的量量越越多多，相相当当于于柱柱的的容容量量大大，因因此此又又称称分分配配容容量量或或容容量量因因子子。它它是是衡衡量量色色谱谱柱柱对对被被分分离离组组分分保保留留能能力力的的重重要要参参数数。k k值值也也决决定定于于组组分分及及固固定定相相热热力力学学性性质质。它它不不仅仅随随柱柱温温、柱柱压压变变化化而而变变化化，而而且且还还与与流流动动相相及及固固定定相的体积有关。相的体积有关。第43页，共163页，编辑于2022年，星期二 k=ns/nm=CsVS/CmVm 式式中中c cs s,c,cm m分分别别为为
29、组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相的的浓浓度度；V Vm m为为柱柱中中流流动动相相的的体体积积，近近似似等等于于死死体体积积。VsVs为为柱柱中中固固定定相相的的体体积积，在在各各种种不不同同的的类类型型的的色色谱谱中中有有不同的含义。不同的含义。第44页，共163页，编辑于2022年，星期二例如：在分配色谱中，例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。相的孔体积。分配比分配比k 值可直接从色谱图中测得。值可直接从色谱图中测得。k=(tRtM)/tM=t R/tM=V R/V0第45页，共163页，编
30、辑于2022年，星期二3.分配系数分配系数K与分配比与分配比k 的关系的关系K=kVM/VS=k.其中其中称为相比称为相比，它是反映各种色谱柱柱，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其其值一般为值一般为6-35；对毛细管柱，其；对毛细管柱，其值值为为60-600。第46页，共163页，编辑于2022年，星期二滞留因子滞留因子Rs 分配比分配比k k值可直接从色谱图测得。设流值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为动相在柱内的线速度为u u，组分在柱内线，组分在柱内线速度为速度为u us s，由于固定相对组分有保留作用，由于固定相对组
31、分有保留作用，所以所以u us su u此两速度之比称为此两速度之比称为滞留因子滞留因子RsRs。第47页，共163页，编辑于2022年，星期二Rs若用质量分数表示，即若用质量分数表示，即 对对组组分分和和流流动动相相通通过过长长度度为为L的的色色谱谱柱柱，其所需时间分别为其所需时间分别为第48页，共163页，编辑于2022年，星期二整整 理理 式式（18-14）（18-17），可得可得 第49页，共163页，编辑于2022年，星期二4.分配系数分配系数K及分配比及分配比k与选择因子与选择因子的关系的关系对对A、B两组分的选择因子，用下式表示：两组分的选择因子，用下式表示：=t R(A)/t
32、R(B)=k（A）/k（B）=K（A）/K（B）通过选择因子通过选择因子把实验测量值把实验测量值k与热力学性与热力学性质的分配系数质的分配系数K直接联系起来，直接联系起来，对固定相的对固定相的选择具有实际意义。选择具有实际意义。第50页，共163页，编辑于2022年，星期二 如果两组分的如果两组分的K K或或k k值相等，则值相等，则=1=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的分不开。两组分的K K或或k k值相差越大，则值相差越大，则分离得越好分离得越好。因此两组分具有不同的分。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。配系数是色谱分离的先决
33、条件。第51页，共163页，编辑于2022年，星期二下图是下图是A、B两组分沿色谱柱移动时，两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。不同位置处的浓度轮廓。浓浓度度沿柱移动距离沿柱移动距离LABABKAKB 图中图中K KA AKKB B ，因此，因此，A A组分在移动过程中滞后。随着两组组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。区域扩宽对分离是不利的，
34、但又是不可避免的。若要使若要使A A、B B组分完全分离，必须满足以下三点：组分完全分离，必须满足以下三点：第52页，共163页，编辑于2022年，星期二第一第一，两组分的分配系数必须有差异；，两组分的分配系数必须有差异；第二第二，区域扩宽的速率应小于区域分，区域扩宽的速率应小于区域分 离的速度；离的速度；第三第三，在保证快速分离的前提下，提，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。供足够长的色谱柱。第53页，共163页，编辑于2022年，星期二 第一、二点是完全分离的必要条件第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动
35、的速率，而且应说明组在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理，故称为线性色谱理论。论。第54页，共163页，编辑于2022年，星期二小小结结色谱法研究的核心色谱法研究的核心-选择最选择最适合的色谱体系和条件、在最短的适合的色谱体系和条件、在最短的时间达到最佳的分离效果。时间达到最佳的分离效果。第55页，共163页，编辑于2022年，星期二（二）塔板理论二）塔板理论 把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏把色谱柱比作
36、一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用用H H表示，称为塔板高度，简称板高。表示，称为塔板高度，简称板高。第56页，共163页，编辑于2022年，星期二 塔板理论假设：塔板理论假设：1.1.在在柱柱内内一一小小段段长长度度H H内内，组组分分可可以以在在两两相相间间迅迅速速达达到到平平衡衡。这这一一小小段段柱柱长长称称为为
37、理论塔板高度理论塔板高度H H。2.2.以以气气相相色色谱谱为为例例，载载气气进进入入色色谱谱柱柱不不是是连连续续进进行行的的，而而是是脉脉动动式式，每每次次进进气气为为一个塔板体积（一个塔板体积（VVm m）。）。3.3.所所有有组组分分开开始始时时存存在在于于第第0 0号号塔塔板板上上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4.4.分分配配系系数数在在所所有有塔塔板板上上是是常常数数，与与组组分分在某一塔板上的量无关。在某一塔板上的量无关。第57页，共163页，编辑于2022年，星期二 简单地认为：在每一块塔板上，溶质在简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快
38、达到分配平衡，然后随着流动相两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为长为L L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n=L/H n n称为理论塔板数称为理论塔板数。与精馏塔一样，色。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数谱柱的柱效随理论塔板数n n的增加而增加，的增加而增加，随板高随板高H H的增大而减小。的增大而减小。第58页，共163页，编辑于2022年，星期二根据上述假定，在色谱分离过程中，该组根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量
39、，即开始时，若有单位质量，即m=1m=1（例例1 1mgmg或或1 1gg）的该组分加到第的该组分加到第0 0号塔板上，分配平衡后，号塔板上，分配平衡后，由于由于k=1k=1，即即n ns s=n=nm m故故n nm m=n=ns s=0.5=0.5。当当一个板体积一个板体积（lVlV）的载气的载气以脉动形式进入以脉动形式进入0 0号板时，就将号板时，就将气相中含有气相中含有n nm m部分组分的载气顶到部分组分的载气顶到1 1号板上，此号板上，此时时0 0号板液相（或固相）中号板液相（或固相）中n ns s部分组分及部分组分及1 1号板号板气相中的气相中的n nm m部分组分，将各自在两相
40、间重新分配。部分组分，将各自在两相间重新分配。故故0 0号板上所含组分总量为号板上所含组分总量为0 05 5，第59页，共163页，编辑于2022年，星期二其中气液（或气固）两相其中气液（或气固）两相各为各为0 025,25,而而1 1号板号板上所含总量同样为上所含总量同样为0 05 5气液（或气固）相亦气液（或气固）相亦各为各为0 02525。以后每当一个新的板体积载气以脉。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下见下表表)。第60页，共163页，编辑于2022年，星期二 第61页，共163页，编辑于2022年，星期二 塔板
41、理论指出塔板理论指出：第一第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数塔板数n n大于大于5050时时，可得到基本对称的峰形曲，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，线。在色谱柱中，n n值一般很大，如气相色值一般很大，如气相色谱柱的谱柱的n n约为约为10103 3-10-106 6 ，因而这时的流出曲线，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。可趋近于正态分布曲线。第二第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。多次的分配平
42、衡后，仍可获得良好的分离。第62页，共163页，编辑于2022年，星期二第三第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：与半峰宽及峰底宽的关系式为：n=5.54(tR/Y1/2)2=16(tR/Y)2式中式中tR与与Y1/2(Y)应采用同一单位应采用同一单位（时间或距离）。从公式可以看出，在（时间或距离）。从公式可以看出，在tR一定时，如果色谱峰很窄，则说明一定时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，越大，H越小，柱效能越高。越小，柱效能越高。第63页，共163页，编辑于2022年，星期二在实际工作中，由公式在实际工作中，由公式n=L/H和和n=5.54(tR/Y1/2)2=16(tR/Y)2计算出来的的计
43、算出来的的n和和H值有时并不能充分地值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算计算时，没有扣除死时间时，没有扣除死时间tM，所以常用有效所以常用有效塔板数塔板数n有效有效表示柱效：表示柱效：n有效有效=5.54(tR/Y1/2)2=16(tR/Y)2有效板高有效板高：H有效有效=L/n有效有效 第64页，共163页，编辑于2022年，星期二因为在相同的色谱条件下，对不同的物因为在相同的色谱条件下，对不同的物质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物时，除注明色谱条件外，还应指出用
44、什么物质进行测量。质进行测量。例：例：已知某组分峰的峰底宽为已知某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为保留时间为400s，计算此色谱柱的理论塔板数。计算此色谱柱的理论塔板数。解：解：n=16(tR/Y)2=16（400/40）2=1600块块第65页，共163页，编辑于2022年，星期二塔板理论是一种半经验性理论。塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学它用热力学的观点的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数。效高低的参数。但是但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，
45、色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。数，因而限制了它的应用。第66页，共163页，编辑于2022年，星期二1、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该方程可以预测具有不同分配系数程，通过该方程可以预测具有不同分配系
46、数K的两种物质在塔板数为的两种物质在塔板数为n的色谱柱上分离的色谱柱上分离的情况；的情况；小结小结2、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数板数n，其值越大，色谱峰月窄，分离效果越好；其值越大，色谱峰月窄，分离效果越好；第67页，共163页，编辑于2022年，星期二3、既然色谱分离的依据是组分在两相中的分既然色谱分离的依据是组分在两相中的分配能力差异，因此，两相不限于液配能力差异，因此，两相不限于液-固相，对固相，对气体成分而言，亦可是气气体成分而言，亦可是气-固项或气固项或气-液相。液相。第68页，共163页，编辑于2022年，星期二（三）速率理论（
47、三）速率理论 19561956年年荷荷兰兰学学者者vanDeemter（范范第第姆姆特特）等等在在研研究究气气液液色色谱谱时时，提提出出了了色色谱谱过过程程动动力力学学理理论论速速率率理理论论。他他们们吸吸收收了了塔塔板板理理论论中中板板高高的的概概念念，并并充充分分考考虑虑了了组组分分在在两两相相间间的的扩扩散散和和传传质质过过程程，从从而而在在动动力力学学基基础础上上较较好好地地解解释释了了影影响响板板高高的的各各种种因因素素。该该理理论模型对气相、液相色谱都适用。论模型对气相、液相色谱都适用。第69页，共163页，编辑于2022年，星期二vanDeemter方程方程的数学简化式为的数学简
48、化式为H=A+B/u+Cu式式中中u为为流流动动相相的的线线速速度度；A、B、C、为为常常数数，分分别别代代表表涡涡流流扩扩散散系系数数、分分子子扩散项系数、传质阻力项系数。扩散项系数、传质阻力项系数。第70页，共163页，编辑于2022年，星期二1.1.涡流扩散项涡流扩散项A 在填充色谱柱中，当组分随流动相在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称流动，故称涡流扩散。涡流扩散。第71页，共16
49、3页，编辑于2022年，星期二第72页，共163页，编辑于2022年，星期二涡流扩散示意图涡流扩散示意图第73页，共163页，编辑于2022年，星期二 由由于于填填充充物物颗颗粒粒大大小小的的不不同同及及填填充充物物的的不不均均匀匀性性，使使组组分分在在色色谱谱柱柱中中路路径径长长短短不不一一，因因而而同同时时进进色色谱谱柱柱的的相相同同组组分分到到达达柱柱口口时时间间并并不不一一致致，引引起起了了色色谱谱峰峰的的变变宽宽。色色谱谱峰峰变变宽宽的的程程度度由由下下式式决决定：定：A=2dp第74页，共163页，编辑于2022年，星期二 上式表明，上式表明，A与填充物的平均直径与填充物的平均直径
50、dp的的大小和填充不规则因子大小和填充不规则因子有关有关，与流动相的，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此心毛细管，不存在涡流扩散，因此A=0。第75页，共163页，编辑于2022年，星期二2.分子扩散项分子扩散项B/u（纵向扩散项）纵向扩散项）纵纵向向分分子子扩扩散散是是由由浓浓度度梯梯度度造造成成的的。组组分分从从柱柱入入口口加加入入，其其浓浓度度分分布布的的构构型型呈呈“