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1、基因工程第四章工具基因工程第四章工具基因工程第四章工具基因工程第四章工具酶酶第1页，此课件共34页哦Restriction EndonucleaseSection one第2页，此课件共34页哦v核酸酶：指通过切割相邻的两个核苷核酸酶：指通过切割相邻的两个核苷酸之间的酸之间的35磷酸二酯键，而引发磷酸二酯键，而引发核酸分子发生水解断裂的酶。按水解核酸分子发生水解断裂的酶。按水解断裂核酸分子的方式不同，分为核酸断裂核酸分子的方式不同，分为核酸内切酶和外切酶。内切酶和外切酶。v核酸外切酶：从核酸分子的末端开核酸外切酶：从核酸分子的末端开始，一个核苷酸，一个核苷酸地始，一个核苷酸，一个核苷酸地消化降
2、解多核苷酸的酶。消化降解多核苷酸的酶。v核酸内切酶：从核酸分子的内部，切核酸内切酶：从核酸分子的内部，切割磷酸二酯键使之断裂并形成小分子割磷酸二酯键使之断裂并形成小分子片断的酶。片断的酶。v限制性内切酶是核酸内切酶的一限制性内切酶是核酸内切酶的一种。种。第3页，此课件共34页哦The two different types of exonucleaseIt removes nucleotide from both strands of DNAIt removes nucleotide only from the 3 terminus第4页，此课件共34页哦一、限制性内切酶的发现与种类：一、限制
3、性内切酶的发现与种类：1、限制性内切酶的发现：、限制性内切酶的发现：v 20世纪世纪60年代在研究细菌的限制和修饰现象时年代在研究细菌的限制和修饰现象时被被Linn和和Arber发现，他们研究的是大肠杆菌。发现，他们研究的是大肠杆菌。大肠杆菌细胞可以降解噬菌体的大肠杆菌细胞可以降解噬菌体的DNA入侵，也就入侵，也就是在生物体可识别外源是在生物体可识别外源DNA，并将其降解，而保，并将其降解，而保护自身的护自身的DNA不被感染。不被感染。W.Arber 第5页，此课件共34页哦v这就是在生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是这就是在生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是restriction,修
4、饰修饰modification,所以书上把这一系统叫做：所以书上把这一系统叫做：R/M体系。体系。v限制与修饰是由两种酶引起的，一种是甲基转移酶，一种是核酸内限制与修饰是由两种酶引起的，一种是甲基转移酶，一种是核酸内切酶。切酶。v核酸有四个碱基，碱基排列有核酸有四个碱基，碱基排列有44个排列顺序，内切酶具有识别个排列顺序，内切酶具有识别位点，他的限制性体现在可以识别这些位点，并进行切割，这样位点，他的限制性体现在可以识别这些位点，并进行切割，这样外源的外源的DNA即使进入生物细胞，也可以被降解，这就是限制即使进入生物细胞，也可以被降解，这就是限制;修饰修饰是由甲基化酶来完成的。在生物内部有甲基
5、化酶，他们可以催化是由甲基化酶来完成的。在生物内部有甲基化酶，他们可以催化甲基从给体分子甲基从给体分子S酰苷甲硫氨酸转移给可识别的序列（内切酰苷甲硫氨酸转移给可识别的序列（内切酶），使之甲基化，这样内切酶无法识别甲基化的序列，就酶），使之甲基化，这样内切酶无法识别甲基化的序列，就不能进行切割，从而保全了自身的不能进行切割，从而保全了自身的DNA。第6页，此课件共34页哦v限制与修饰存在两方限制与修饰存在两方面的作用：一是保护面的作用：一是保护自身的自身的DNA不受限制，不受限制，即不被切割；二是破即不被切割；二是破坏外源坏外源DNA使之迅速使之迅速降解。降解。v如果没有限制修饰，如果没有限制修
6、饰，DNA、基因到处都是，、基因到处都是，顺利进入任何生物顺利进入任何生物,改改变遗传物质，发生变变遗传物质，发生变异。异。第7页，此课件共34页哦2.限制性内切酶的种类：限制性内切酶的种类：v有三种不同类型：有三种不同类型：型、型、型、型、型型 型、型、型在同一蛋白分子中兼有内切和甲基化活性并且其依赖型在同一蛋白分子中兼有内切和甲基化活性并且其依赖ATP，作用时吸收能量。作用时吸收能量。第8页，此课件共34页哦v型：其内切酶活性和甲基化活性是分开的，只型：其内切酶活性和甲基化活性是分开的，只负责限制，因此叫限制性内切酶。修饰由独立负责限制，因此叫限制性内切酶。修饰由独立的甲基酶完成。的甲基酶
7、完成。而且核酸内切作用具有序列而且核酸内切作用具有序列的特异性，可识别回文序列，的特异性，可识别回文序列，AGCT-，便于，便于操作，广泛应用。操作，广泛应用。v特点：特点：v识别识别特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列，其长度为，其长度为4-6个碱基，甚至个碱基，甚至8个，少个，少数酶识别更长的序列。特定的序列：又叫识别序列或识别位点。这数酶识别更长的序列。特定的序列：又叫识别序列或识别位点。这些序列的一个共同特点是具有双重螺旋对称的结构形式，可以进行些序列的一个共同特点是具有双重螺旋对称的结构形式，可以进行180度的旋转，呈回文结构。度的旋转，呈回文结构。第9页，此课件共34页哦限制性内切酶在
8、识别序列后，对双链限制性内切酶在识别序列后，对双链DNA进行切割，双链锻裂后，进行切割，双链锻裂后，形成特定的酶切末端，叫形成特定的酶切末端，叫“粘性末端粘性末端”。粘性末端有三种形式：。粘性末端有三种形式：5”突出粘端：突出粘端：EcoRI切点切点 5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5 3”突出粘端突出粘端：PstI切割位点切割位点 5-CTGCA G-3 3-G ACGTC-5第10页，此课件共34页哦 平端：平端：SmaI 切割位点切割位点 5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5第11页，此课件共34页哦二、限制性片断末端的连接作用二、限制性片断末端的连接作用:vDNA
9、片断经限制性内切酶切割后，可自然的重新片断经限制性内切酶切割后，可自然的重新连接起来，或环化起来；连接起来，或环化起来；不同不同DNA片断通过互不的粘性末端之间的碱基配对而彼片断通过互不的粘性末端之间的碱基配对而彼此相连接，称之为分子间连接。此相连接，称之为分子间连接。同一同一DNA片断通过互不的粘性末端的碱基配对连接成环片断通过互不的粘性末端的碱基配对连接成环状形分子，状形分子，称为分子内连接。称为分子内连接。v对重新连接的对重新连接的DNA片断经加热处理后，会重新线片断经加热处理后，会重新线性化；性化；v如果对连接或环化的分子用连接酶处理，形成的如果对连接或环化的分子用连接酶处理，形成的D
10、NA分子就是永久性的。分子就是永久性的。第12页，此课件共34页哦v限制性内切酶识别的靶序列同限制性内切酶识别的靶序列同DNA的来源无关，的来源无关，也就是说不带有种的特异性，对各种也就是说不带有种的特异性，对各种DNA都普遍都普遍适用。无论那种生物的适用。无论那种生物的DNA经同一种酶作用切割经同一种酶作用切割后，形成的片断都能连接再一起，来实现后，形成的片断都能连接再一起，来实现DNA重重组。组。第13页，此课件共34页哦三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名:v1973年，年，Smith和和 Nathans提出了一个较系提出了一个较系统的命名原则：统的命名原则：Hin d III
11、Haemphilus influenzae嗜血流杆菌嗜血流杆菌D菌株菌株第三个酶第三个酶Eco R I Escherichia coli 大肠杆菌大肠杆菌R菌株菌株第一个酶第一个酶第14页，此课件共34页哦四、影响酶活性的因素：四、影响酶活性的因素：1、靶、靶DNA的纯度：内切酶的消化底物的速率很大的纯度：内切酶的消化底物的速率很大程度上取决于使用的程度上取决于使用的DNA样品本身的纯度。通常样品本身的纯度。通常我们从生物样品中提取出的我们从生物样品中提取出的DNA容液中，含有许容液中，含有许多物质，如蛋白质，多糖，酚、氯仿，酒精、乙多物质，如蛋白质，多糖，酚、氯仿，酒精、乙二胺四乙酸（二胺四
12、乙酸（EDTA）,SDS（十二烷基磺酸纳）（十二烷基磺酸纳），高浓度的盐离子。这些都是酶活性的钝化剂。，高浓度的盐离子。这些都是酶活性的钝化剂。酚的影响最大，他可以使蛋白质变性，使酶失活。酚的影响最大，他可以使蛋白质变性，使酶失活。第15页，此课件共34页哦v消除办法：消除办法：尽量保证尽量保证DNA纯度达到最大。酚抽提去蛋白；醇抽提（氯仿、纯度达到最大。酚抽提去蛋白；醇抽提（氯仿、异戊醇的抽提）去酚，去多糖；乙醇抽提去多元醇；沉淀（蛋异戊醇的抽提）去酚，去多糖；乙醇抽提去多元醇；沉淀（蛋白也沉，但白也沉，但DNA和蛋白能看的出来）；干燥去乙醇。和蛋白能看的出来）；干燥去乙醇。增加酶的用量，平
13、均每增加酶的用量，平均每ug底物底物DNA的用量可达的用量可达10个单位或更个单位或更多。但有一个问题：商品化的酶均加入多。但有一个问题：商品化的酶均加入50的甘油作为保护剂，的甘油作为保护剂，在在20度保藏不会结冻。如果加入酶量过大，甘油浓度过高，会抑度保藏不会结冻。如果加入酶量过大，甘油浓度过高，会抑制酶活性。制酶活性。扩大酶切反映的扩大酶切反映的(体积体积)体系体系,使潜在的抑制因素被相应的稀释。使潜在的抑制因素被相应的稀释。延长酶反映时间。可切延长酶反映时间。可切24小时。小时。第16页，此课件共34页哦2、DNA的甲基化程度：的甲基化程度：核酸内切酶是原核生物限制修饰的组成部分，因核
14、酸内切酶是原核生物限制修饰的组成部分，因此，识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会强此，识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会强烈的影响酶的活性，造成烈的影响酶的活性，造成DNA只能被局部消化。只能被局部消化。为了避免这种问题，在基因克隆中使用的是失去为了避免这种问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA。第17页，此课件共34页哦3、酶切温度：、酶切温度：vDNA消化反应的温度是影响核酸内切酶活性的另消化反应的温度是影响核酸内切酶活性的另一个重要的因素。一个重要的因素。v不同内切酶具有不同的最适反应温度，大多数酶不同内切酶具有不同的最适反
15、应温度，大多数酶的反映温度在的反映温度在37，消化时温度低于或高于最适，消化时温度低于或高于最适温度，都会影响酶的活性，比如温度低切割时之温度，都会影响酶的活性，比如温度低切割时之产生切口，而不能切断产生切口，而不能切断DNA。第18页，此课件共34页哦4.DNA的分子结构：的分子结构：vDNA分子的结构有很多种，以质粒分子的结构有很多种，以质粒DNA为例，为例，他有三种存在方式，超螺旋、环状带切刻、线性。他有三种存在方式，超螺旋、环状带切刻、线性。v往往切割超螺旋时用的酶量要比消化线性往往切割超螺旋时用的酶量要比消化线性DNA的的量高出许多倍，甚至量高出许多倍，甚至20倍。倍。第19页，此课
16、件共34页哦5、内切酶对不同部位的切割位点，其切割效率有、内切酶对不同部位的切割位点，其切割效率有着明显的差别。这主要是由于切割位点的侧翼序着明显的差别。这主要是由于切割位点的侧翼序列存在着差异的结果（通常切割效率的差异不会列存在着差异的结果（通常切割效率的差异不会超过超过10倍）。倍）。第20页，此课件共34页哦6、内切酶的缓冲液：不同的酶使用不同的类型、内切酶的缓冲液：不同的酶使用不同的类型vBuffer 盐：盐：Mgcl,Nacl,Kcl提供离子环境。酶的活性提供离子环境。酶的活性需要需要2价阳离子，价阳离子，“Mg”是最普遍的酶激活剂。是最普遍的酶激活剂。Tris-Hcl:缓冲液，他可
17、以创造出缓冲液，他可以创造出pH是是7.4的缓的缓冲环境，保护酶分子，维持体系冲环境，保护酶分子，维持体系pH恒定。恒定。巯基乙醇或二硫苏糖醇（巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）:巯基试剂巯基试剂对于保护某些核酸限制性内切酶的结构稳定性起对于保护某些核酸限制性内切酶的结构稳定性起着很大作用，防止其失活变性。有效防止二硫键着很大作用，防止其失活变性。有效防止二硫键形成。形成。BSA：牛血清白蛋白，酶的稳定性。：牛血清白蛋白，酶的稳定性。第21页，此课件共34页哦7.非适宜环境包括：非适宜环境包括：v非适宜环境包括：高浓度的内切酶（酶专一性变非适宜环境包括：高浓度的内切酶（酶专一性变化，产生无度切割，
18、一个位点本来不能切割，但化，产生无度切割，一个位点本来不能切割，但切割了，又叫切割了，又叫Star活性变化），高浓度的甘油，活性变化），高浓度的甘油，低离子强度，低离子强度，Mg被被Mn取代，高取代，高pH。8、酶切时间：通常酶切时间、酶切时间：通常酶切时间12小时，但大多数酶小时，但大多数酶的活性可维持很长时间，我们可以酶切过夜。的活性可维持很长时间，我们可以酶切过夜。第22页，此课件共34页哦五、双酶切：五、双酶切：v没有不同的没有不同的buffer:A/B/H/M/K.注意选注意选择两个酶通用的缓冲液择两个酶通用的缓冲液第23页，此课件共34页哦LigasesSection two第24
19、页，此课件共34页哦DNA连接酶：连接酶：vDNA被限制性内切酶消化后，单凭粘性末端是被限制性内切酶消化后，单凭粘性末端是不能彼此牢固的连接在一起的，需要进行连接不能彼此牢固的连接在一起的，需要进行连接处理，这样我们用到了处理，这样我们用到了DNA连接酶。连接酶。1.概念：能够催化在概念：能够催化在2条条DNA 链之间形成磷酸二链之间形成磷酸二脂键的酶。条件是需要一条链的脂键的酶。条件是需要一条链的3末端具有一个末端具有一个游离的羟基（游离的羟基（OH）,在另一条链的在另一条链的5端具有一端具有一个磷酸基团（个磷酸基团（P），另外由于形成二脂键是一），另外由于形成二脂键是一种吸能反映所以反应中
20、要有种吸能反映所以反应中要有ATP（动物）和（动物）和NAD（原核生物，氧化型）作为能源。（原核生物，氧化型）作为能源。第25页，此课件共34页哦2.特性：特性：vDNA连接酶不能连接两条单链连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链分子或环化的单链DNA分分子，被连接的必须是双螺旋子，被连接的必须是双螺旋DNA的一部分。连接酶的来源有两的一部分。连接酶的来源有两种，一种是大肠杆菌染色体编种，一种是大肠杆菌染色体编码的码的DNA连接酶；另一种是大连接酶；另一种是大肠杆菌肠杆菌T4噬菌编码的叫噬菌编码的叫T4连接连接酶，这种酶容易制备，直接从感酶，这种酶容易制备，直接从感染染T4大肠杆菌的菌体
21、中分离纯大肠杆菌的菌体中分离纯化，而且他可以连接两条平末化，而且他可以连接两条平末端的端的DNA片断片断第26页，此课件共34页哦vDNA连接酶只能连接连接酶只能连接DNA双螺旋骨架上的切刻，而不能连接双螺旋骨架上的切刻，而不能连接封闭缺口。封闭缺口。v反应温度：连接酶的最适反映温度是反应温度：连接酶的最适反映温度是37，但我们不能采用，但我们不能采用这个温度这个温度？比如由内切酶比如由内切酶EcoRI 产生的粘性末端是产生的粘性末端是TTAA-，末端搭，末端搭连后，作用力是由连后，作用力是由4个个A-T碱基对维持，碱基对维持，37度下，他们的作用并度下，他们的作用并不牢靠。但温度低末端连接慢
22、。不牢靠。但温度低末端连接慢。我们在实验室操作中往往采用我们在实验室操作中往往采用415比较合适，这个温度比较合适，这个温度是介于酶的作用速率和末端结合速率之间，一般认为是介于酶的作用速率和末端结合速率之间，一般认为4连接反应连接反应进行较慢。连接反应可以是进行较慢。连接反应可以是4连接连接24小时，或小时，或15过夜过夜（注意参照说明书）。（注意参照说明书）。第27页，此课件共34页哦vDNA连接酶用法与用量：连接酶用法与用量：平末端平末端DNA分子的连接最适反应的酶量为分子的连接最适反应的酶量为12个单位，个单位，粘末端的连接，酶量为粘末端的连接，酶量为0.1个单位较好。个单位较好。第28
23、页，此课件共34页哦polymeraseSection three第29页，此课件共34页哦vDNA聚合酶聚合酶vDNA聚合酶聚合酶I Klenow大片段大片段vT4 DNA聚合酶聚合酶v反转录酶反转录酶vTaq酶酶共同点：以一条共同点：以一条DNA（RNA）为模板，通过聚）为模板，通过聚合作用能够把脱氧核糖核酸连续的加到引物链合作用能够把脱氧核糖核酸连续的加到引物链的的3OH末端。末端。第30页，此课件共34页哦一、一、DNA聚合酶聚合酶Iv大肠杆菌的大肠杆菌的DNA聚合酶聚合酶I是一条约是一条约1000个个aa 的多肽链形成的的多肽链形成的单亚基蛋白，分子量单亚基蛋白，分子量109x103
24、Da.1.三种活性：三种活性：聚合活性：将聚合活性：将4种脱氧核糖核苷酸聚合为新的种脱氧核糖核苷酸聚合为新的DNA链。链。5-3外切酶活性外切酶活性:3-5外切酶活性：防止错配。外切酶活性：防止错配。2.DNA聚合酶聚合酶I催化合成催化合成DNA链的条件：链的条件：四种核苷酸，四种核苷酸，游离的游离的OH 模板链模板链第31页，此课件共34页哦3.作用：作用：DNA杂交的探针制备：依靠杂交的探针制备：依靠DNA聚合酶缺口聚合酶缺口平移。由于平移。由于DNA聚合酶聚合酶I具有具有53外切酶活性，外切酶活性，切下后，聚合酶活性表现出来，又加上一个新切下后，聚合酶活性表现出来，又加上一个新的碱基可使
25、切刻由的碱基可使切刻由53的方向移动，加上的的方向移动，加上的dNTP用用P标记，这样换上的新链上就有了放射标记，这样换上的新链上就有了放射性标记。性标记。第32页，此课件共34页哦二、二、klenow 片断：片断：v用蛋白酶处理大肠杆菌用蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I产生两个片断，一个片断带产生两个片断，一个片断带有有53外切酶活性；一个片断失去外切酶活性；一个片断失去53外切酶活性，而外切酶活性，而保留下两种活性，该片断的分子量为保留下两种活性，该片断的分子量为76 x 103 dal,这个片这个片段就是段就是Klenow大片段。大片段。v作用：可对作用：可对3隐藏性末端进行修补，尤其是被内切酶消化后隐藏性末端进行修补，尤其是被内切酶消化后标记标记DNA片断的末端；片断的末端；cDNA合成中催化第二条链的合成合成中催化第二条链的合成（DNA聚合酶聚合酶I也可，但安全性差，可能会将原链切割。）也可，但安全性差，可能会将原链切割。）NH2cooH323 Polymerase exonuclease 53第33页，此课件共34页哦第34页，此课件共34页哦