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1、第五章第五章 微生物生长动力学微生物生长动力学第一节第一节 微生物生长的基本特征微生物生长的基本特征 微生物一般包括细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、立克次氏体、支原体和病毒等。微生物特有的现状：（1）生长速度快（2）对物质具有强烈的转化作用（3）容易引起变异，致使种类繁多（4）生长繁殖形式具有一定特征微生物种类繁多，其形态构造及功能有很大差异，但也有共同之处：1、以细胞为构造单位，其数目随时间的增加而增加（生长）2、构成细胞的物质大体相同3、细胞内的化学反应（代谢）基本相同4、适应能力较强，能随环境变化而自行调节 微生物是反应过程的生物催化剂，把原料转为有用的产品；微生物又如同一个微小的容器，原料
2、中的反应物透过微生物细胞周围的细胞壁和细胞膜进入微生物体内，把反应物转化为产物，接着这些产物又被释放出来。在微生物细胞的生长过程中，细胞的形态、结构、活性都处在一动态过程中。从细胞组成分析，它含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸等，这些细胞的基本组成部分含量的大小也随环境的变化而变化。第二节第二节 微生物生长动力学微生物生长动力学n n微生物生长动力学是研究微生物生长过程的速率及其影响速率的因素，从而获得相关信息。一、一、生长现象与繁殖方式生长现象与繁殖方式 根据微生物的个体形态、群体形态、生理特征、根据微生物的个体形态、群体形态、生理特征、生化反应等生物学特征，微生物可分为三大类：生化反应等生
3、物学特征，微生物可分为三大类：、非细胞型微生物（病毒）；、非细胞型微生物（病毒）；、原核细胞型微生物，仅有原始细胞核，如细、原核细胞型微生物，仅有原始细胞核，如细 菌、放线菌等；菌、放线菌等；、真核细胞型微生物，霉菌、酵母菌和单细胞、真核细胞型微生物，霉菌、酵母菌和单细胞 藻类，原生动物。藻类，原生动物。表表1 1 微生物的生长现象与繁殖方式微生物的生长现象与繁殖方式类 别生长特征繁殖方式细菌个体增重和增大 分裂繁殖放线菌、霉菌菌丝伸长和分支霉菌-无性孢子、有性孢 子酵母菌个体增重和增大 出芽生殖放线菌-无性孢子二、微生物生长的测定二、微生物生长的测定n n微生物的生长和产物的生成有着密切的关
4、系，因此生长的测定对发酵的控制很重要。n n微生物生长的测定，通常是测群体的重量或细胞数，而不是测细胞个体的重量或大小。n n生长测定常用理化方法，分为测定细胞数目和细胞重量两类。1、计数法n n浊度计比浊法测定稀的细胞悬液的透光量，间接测出细胞数量的生长。n n计数器计数法在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出细菌数的生长。2、测定细胞重量测定细胞重量n n细胞干重称量法细胞干重称量法细胞干重称量法细胞干重称量法直接测定单位体积培养物的细胞干重，由此代直接测定单位体积培养物的细胞干重，由此代表菌体细胞物质总量。表菌体细胞物质总量。n n细胞堆积容积测量法
5、细胞堆积容积测量法细胞堆积容积测量法细胞堆积容积测量法 （离心压缩细胞体积法）（离心压缩细胞体积法）（离心压缩细胞体积法）（离心压缩细胞体积法）用刻度锥形管测量经离心的细胞沉淀物的容积用刻度锥形管测量经离心的细胞沉淀物的容积，由此间接表示细胞重量。，由此间接表示细胞重量。n n细胞组成分析法细胞组成分析法细胞组成分析法细胞组成分析法 测定一种大分子的细胞组成测定一种大分子的细胞组成(如蛋白质、如蛋白质、RNARNA、DNADNA等等)，间接算出细胞的重量。，间接算出细胞的重量。n n营养物消耗分析法营养物消耗分析法测定培养基中不用于合成代谢产物的营养物（磷酸盐、硫酸盐等）的消耗，由此间接表示生
6、长的细胞重量。n n产物重量分析法产物重量分析法 测定培养中间形成的二氧化碳，氢，ATP等产物，由此间接换算出生长的细胞重量。三、微生物生长动力学三、微生物生长动力学n n微生物不能调节自身的温度，每种微生物都有它的生长最适温度，以及最适pH、无机盐浓度和糖浓度等。1、微生物生长曲线微生物生长曲线n n细胞的生长过程可以用细胞浓度的变化来描述和表达。若取细胞浓度的对数值与细胞生长时间对应作图，可得到分批培养时的细胞浓度变化曲线。在培养成分一定时，微生物的生长一般分五个阶段n n 迟缓期（适应期）迟缓期（适应期）n n对数生长期对数生长期n n减速期减速期n n静止期（平衡期）静止期（平衡期）n
7、 n衰退期（死亡期）衰退期（死亡期）（1）迟缓期n n延迟期系指培养基接种后，细胞浓度在一段时延迟期系指培养基接种后，细胞浓度在一段时间内无明显增加的这一阶段。它是细胞在环境间内无明显增加的这一阶段。它是细胞在环境改变后表现出来的一个适应阶段。如果新培养改变后表现出来的一个适应阶段。如果新培养基中含有较丰富的某种营养物质，而在老环境基中含有较丰富的某种营养物质，而在老环境中则缺乏这种物质，细胞在新环境中就必须合中则缺乏这种物质，细胞在新环境中就必须合成有关的酶来利用该物质，从而表现出延迟期。成有关的酶来利用该物质，从而表现出延迟期。（2）对数生长期在在此此阶阶段段中中，培培养养基基中中营营养养
8、物物质质较较充充分分，细细胞胞的的生生长长不不受受限限制制，细细胞胞浓浓度度随随时时间间呈呈指指数数生生长长。由由于于在在此此阶阶段段，细细胞胞分分裂裂繁繁殖殖最最为为旺旺盛盛，生生理理活活性性最最高高。因因此此在在工工业业微微生生物物反反应应中中，常常转转接接处处于于指指数数生生长长期期中中期期的的细细胞胞，以以保保证证转转接接后后细细胞能迅速生胞能迅速生长，微生物反应能快速进行。长，微生物反应能快速进行。（3）减速期n n减速期的存在是由于当细胞大量生长后，培养基中营养物质大量消耗，加上有害代谢物质的积累，细胞的生长速率开始减缓，从而进入减速期。（4）平衡期n n平衡期是由于营养物质已耗尽
9、或有害物质的大量积累，使细胞浓度不再增加。平衡期内的细胞浓度为最大浓度。（5）衰退期n n衰亡期是由于环境恶化，细胞开始死亡，活细胞浓度下降，细胞生长速率为负值。2、微生物生长动力学n n微生物生长动力学可反映出细胞适应环境变化的能力。这也是我们学习研究生长动力学的原因。(1)(1)比生长速率比生长速率n n微生物生长的特点表现为细胞数目或细胞物质微生物生长的特点表现为细胞数目或细胞物质（量）增加一倍所需要的时间。（量）增加一倍所需要的时间。n n如果细胞物质或细胞数增长一倍的时间间隔是如果细胞物质或细胞数增长一倍的时间间隔是常数，则微生物是以指数速度增长，可用数学常数，则微生物是以指数速度增
10、长，可用数学模型来描述。模型来描述。：比生：比生长长速率速率 ：比生长速率：比生长速率 X X：细细胞胞浓浓度度(g/L)(g/L)N N：每升细胞数：每升细胞数n n上式表明细胞物质随时间而增加或细胞数目随时间增加而增加。n n大多数情况下生长是以物质的增加来衡量的，因而符号得到应用。X为单位体积生长速率。若为常数，则：此式可在此式可在t=td时求得，td即在X2=2X1时所需时间，于是 td=ln2/=0.693/对上式积分得：n n例5-1 某微生物的0.125 h-1，求td。解：td=ln2/=0.693/0.125=5.544 hn n在微生物培养过程中，菌体浓度的生长速率是菌体浓
11、度、基质浓度和抑制剂浓度的函数，即 dx/dt=f(X.S.I)n n以上两式表明菌体浓度的增长速率与培养液中菌体浓度成正比。n n比生长速率的意义：比生长速率就是菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比，它与微生物的生命活动有联系。在对数生长期，是一个常数，这时（2）无抑制的细胞生长动力学）无抑制的细胞生长动力学 Monod方程方程现代细胞生长动力学的奠基人Monod在1942年便指出，在培养基中无抑制剂存在的情况下，细胞的比生长速率与限制性基质浓度的关系可用下式表示：n n该方程中 为比生长速率(s-1)；为最大比生长速率(s-1，min-1，h-1)，S为限制性基质浓度(g/L)；Ks为饱和常
12、数(g/L)，其值等于比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。MonodMonod方方程程是是典典型型的的均均衡衡生生长长模模型型，其其基基本本假假设设如下：如下：细细胞胞的的生生长长为为均均衡衡式式生生长长，因因此此描描述述细细胞胞生生长的唯一变量是细胞的浓度；长的唯一变量是细胞的浓度；培培养养基基中中只只有有一一种种基基质质是是生生长长限限制制性性基基质质，而而其它组分为过量不影响细胞的生长；其它组分为过量不影响细胞的生长；细胞的生长视为简单的单一反应，细胞得率细胞的生长视为简单的单一反应，细胞得率为一常数。为一常数。细胞的比生长速率与限制性基质浓度细胞的比生长速率与限制性基质浓
13、度的关系的关系S 当限制性基质浓度很低时，S Ks时，=m，若继续提高基质浓度，细胞生长速率基本不变。此时细胞的比生长速率与基质浓度无关，为零级动力学特点。n n将Monod方程式变为为直线方程。不同的菌种，不同的培养基，Ks和是不同的。微生物微生物限制生长基质限制生长基质Ksm（hr）大肠杆菌大肠杆菌葡萄糖葡萄糖0.22/大肠杆菌大肠杆菌乳糖乳糖0.58/啤酒酵母啤酒酵母乳糖乳糖2.63.00.18啤酒酵母啤酒酵母葡萄糖葡萄糖0.56/纤维素分解菌纤维素分解菌葡萄糖葡萄糖0.860.125固氮菌固氮菌葡萄糖葡萄糖0.160.330.13青霉菌青霉菌氧气氧气0.0070.35Ks和和m值随菌种
14、、限制性基质种类值随菌种、限制性基质种类的变化的变化mm值基本接近，是同一个数量级。值基本接近，是同一个数量级。KsKs和和mm值不值不仅随菌种而异，对不同的限制性基质也不同。仅随菌种而异，对不同的限制性基质也不同。KsKs的意义：的意义：KsKs越小，则越小，则S S增加少许，增加少许，增加很大，所以增加很大，所以KsKs越小，越小，就越敏感。就越敏感。KsKs可以表示菌体细胞与基可以表示菌体细胞与基质亲和力的关系。质亲和力的关系。Monod方程虽然表述简单，但它不足以完整地说明复杂的生化反应过程，并且已发现它在某些情况下与实验结果不符，因此人们又提出了另外一些方程。（3）其他几种生长速率方
15、程式n nTessier方程式（1942年）n n当S很低时，代入原式与Monod方程一样。n nContois方程式（1959年）：单位菌体消耗的基质量。此公式对污水处理很重要。n nMoser方程式（1958年）：经验常数当1时，上式就是Monod方程单基质限制的细胞生长动力学模型单基质限制的细胞生长动力学模型3、营养物质对生长的影响营养物质对生长的影响 所有营养物质均存在一上限浓度，超过此限，所有营养物质均存在一上限浓度，超过此限，反而会引起生长速率的下降。这种效应称为基反而会引起生长速率的下降。这种效应称为基质抑制作用（高渗透压作用）。质抑制作用（高渗透压作用）。另外，某些代谢产物也能
16、抑制生长。其反应方另外，某些代谢产物也能抑制生长。其反应方程式为：程式为：K Kp p为经验常数为经验常数 两种或两种以上的底物同时用于生长时，则可考虑用Monod式的形式表示各种底物与比生长速率的关系：带有两个生长期两种碳源（S1和S2）的二次生长S1S2X4 4、环境对生长的影响、环境对生长的影响微生物的发育、生长及代谢等物理学性质受到各种环境条件的促进或阻碍的影响很大。可以说，培养工程的主要问题是控制环境因素，使所培养的微生物反应成为最合适。（1）温度n n为了定量表示微生物生长与温度的关系，常用比生长速率与绝对温度T倒数的关系来表示。在 某 个 T范 围 内，按 照 阿 累 尼 乌 斯
17、（Arrhenius）方程式可得：Ea:Ea:生长活化能生长活化能R:R:气体常数气体常数TT：绝对温度：绝对温度AA：ArrheniusArrhenius常数常数图中的直线部分是上式适用的范围。从直线的斜率图中的直线部分是上式适用的范围。从直线的斜率可求出可求出EaEa。n n生生长长温温度度范范围围有有上上限限与与下下限限，若若偏偏离离这这个个温温度度范范围围，生生长长速速率率就就急急剧剧降降低低。由由于于菌菌的的种种类类不不同同，分分别别有有发发育育的的最最低低温温度度、最最适适温温度度、最最高高温温度度。这这三三个个温温度度叫叫做做生生育育的的基基本本温温度度。在在高高温温下下生生长长
18、急急剧剧降降低低，这这是是由由于于蛋蛋白白质质及及细细胞胞构构造造的的热热变变性性所所引引起起的的。所所谓谓最最高高生生育育温温度度是是指指合合成成反反应应战战胜胜由由热热变变性性而而破破坏坏反反应应的的温温度度。通通常常这这个个温温度度只只比比最适温度高几度（最适温度高几度（3 355）。）。按照发育最适温度，微生物大致可分为三群：最低温度最适温度最高温度低温菌01010202530发光细菌中温菌0720404045霉菌、酵母、放线菌、一般细菌高温菌254550607080枯草菌、温泉细菌等（2）pHn n氢离子浓度（pH）对微生物生长产生非常强烈的影响。由于菌的种类不同，因而各有自己的生长
19、最适pH值。n n细菌的最适pH一般在中性或微碱性范围（6.58.0），霉菌、酵母的最适pH为微碱性（4.06.0）。但是，乳酸菌、醋酸菌等产酸菌例外，他们对低pH有抗性。（3）氧及氧化还原电位氧以溶解于水的状态（溶解氧dissolvedoxygen，简称：DO）被微生物利用。微生物的生长随溶解氧浓度的变化而变化。DO水平低到用氧电极难以检定的程度时，以培养基的氧化还原电位Eh来代替DO。因为在一定的pH下，溶解氧水溶液的Eh与DO的对数成比例。对于厌氧菌，用Eh表示氧的动态，更为正确。（4）湿度液体培养时，由于周围全部是水，湿度不成问题。但是，在所谓固体培养的情况下，固体是否具有微生物可能利
20、用的水 分 就 成 为 问 题。平 衡 相 对 湿 度（ERH）可用以表示固体所具有的水蒸汽压，并作为衡量水分可能利用程度的标准。（5）渗透压微生物一般在高渗透压下难以生长。但是，嗜高渗菌、嗜盐菌和嗜糖菌例外，在30以上浓度的食盐中仍有生长的霉菌存在，在70浓度的蔗糖中也有生长的酵母生存。（6）压力 一般微生物甚至可在几十个大气压的水压下也不受影响，对于通常的微生物反应过程，压力的影响可以不考虑。（7）光线 红色或绿色细菌及绿藻类的生长需要光，而一般的微生物在明亮处的生长不如暗处好，日光甚至是有害的。（8）环境因子对微生物反应的影响环境因子对微生物反应的影响 环环境境因因子子对对微微生生物物反
21、反应应系系统统的的影影响响除除上上述述各各因因子子对对微微生生物物的的发发育育、生生长长和和繁繁殖殖的的影影响响外外，还还必必须须考考虑虑它它对对产产物物生生成成速速度度的的影影响响。对对微微生生物物生生长长最最合合适适的的环环境境条条件件未未必必是是微微生生物物反反应应的的最最适适条条件件。分分批批培培养养时时，生生长长的的好好坏坏大大致致以以最最终终的的菌菌体体浓浓度度来来判判断断。而而得得到到最最大大菌菌体体浓浓度度的的培培养养条条件件不不一一定定能能得得到到最最高高产产量量的的目目的的代代谢谢产产物物；温温度度对对生生长长与与代代谢谢产产物物生生成成的的影影响响也也不不一一定定是是并并
22、行行的的；生生长长的的最最适适pHpH与与代代谢谢产产物物生成速度的最适生成速度的最适pHpH值一般是不相同的等等。值一般是不相同的等等。第三节 微生物生长对营养的需求n n微生物为了生长，必须从周围环境摄取合成细微生物为了生长，必须从周围环境摄取合成细胞物质与获得能量所需要的全部物质。这些物胞物质与获得能量所需要的全部物质。这些物质称为营养源或营养物。微生物的发育、生长质称为营养源或营养物。微生物的发育、生长必须的营养物可以分为五类：必须的营养物可以分为五类：（a a）能源（）能源（b b）碳源）碳源（c c）氮源）氮源（d d）无机盐类）无机盐类（e e）微量营养物或生长因子（维生素类等）
23、。）微量营养物或生长因子（维生素类等）。n n能源，这里主要指能利用光的光能菌和依赖化学能的化能菌。在碳源方面，我们遇到的主要是依赖有机碳源的异养菌。n n氮氮源源，是是蛋蛋白白质质合合成成的的素素材材，即即各各种种氨氨基基酸酸的的生生物物合合成成不不可可缺缺少少的的物物质质。在在实实际际应应用用微微生生物物工工业业中中，采采用用硫硫酸酸铵铵、尿尿素素、干干酪酪素素、豆豆饼饼、酵酵母母浸浸出出液液、玉玉米米浆浆等等为为氮氮源源。其其次次，P P、S S、MgMg、K K是是微微生生物物发发育育生生长长必必需需的的无无机机元元素素，其其需需要要量量较较多多。对对于于合合成成培培养养基基，需需要要
24、加加入入KHKH2 2POPO4 4、K K2 2HPOHPO4 4、MgSOMgSO4 47H7H2 2O O、CaClCaCl2 22H2H2 2O O、FeSOFeSO4 4等形式的无机盐。等形式的无机盐。n n除除碳碳源源、氮氮源源、无无机机盐盐外外，一一部部分分微微生生物物如如果果没没有有生生长长因因子子的的微微量量因因子子，往往往往不不生生长长。微微量量因因子子主主要要是是维维生生素素类类、嘌嘌呤呤及及嘧嘧啶啶等等碱碱基基类类物物质质。在在应应用用微微生生物物反反应应的的工工业业中中，常常用用酵酵母母浸浸出出液液、玉玉米米浆浆作作为为生生长长因因子子的的来来源源。微微量量生生长长因因子子不不仅仅有有促促进进生生长长的的效效果果，而而且且发发现现它它对对微微生生物物生生理理活活性性产产生生大大的的影影响响。微微量量生生长长因因子子有有成成为为代代谢谢控控制制因因子子的的情情况况，影影响响目目的的产产物物产产量量的的情情况况也也较较多多。因因此此必必须须研研究究它它的的最最适适浓浓度度，并控制它的浓度。并控制它的浓度。本章小节 了解微生物反应动力学研究的基本内容及其基本概念 掌握Monod方程，及其参数的求解