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1、 第二节第二节 培养基的组成、配制与灭菌培养基的组成、配制与灭菌一、培养基的组成和作用一、培养基的组成和作用 培养基（培养基（mediummedium）是植物组织培养的重要材料，是植物组织培养的重要材料，是外植体生长的营养物质，只有配制出适宜的培养是外植体生长的营养物质，只有配制出适宜的培养基，才能使组织培养获得成功。基，才能使组织培养获得成功。通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即成分，即矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等碳源、琼脂以及其他附加物等。培养基的主要指标是营养成分及植
2、物生长调节培养基的主要指标是营养成分及植物生长调节物质的浓度。物质的浓度。（一）矿质营养：（一）矿质营养：矿质营养又称无机营养，是指植物生矿质营养又称无机营养，是指植物生长发育所需要的各种化学元素。长发育所需要的各种化学元素。矿质元素的生理作用：矿质元素的生理作用：（1 1）组成各种化合物，成为结构物质；）组成各种化合物，成为结构物质；（2 2）构成特殊物质，参与代谢；）构成特殊物质，参与代谢；（3 3）维持离子平衡、胶体稳定及电荷平衡等）维持离子平衡、胶体稳定及电荷平衡等电化学作用；电化学作用；（4 4）影响形态发生和组织、器官的建成等。）影响形态发生和组织、器官的建成等。根据植物对元素的吸
3、收量，可以把植物必需元素根据植物对元素的吸收量，可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。分为大量元素和微量元素。国际植物生理学会建议将植物所需浓度国际植物生理学会建议将植物所需浓度大于大于0.5 0.5 mmol/lmmol/l的的元素称为大量元素。的的元素称为大量元素。低于低于0.5 0.5 mmol/lmmol/l的元的元素称为微量元素。素称为微量元素。根据此规则大量元素种类包括根据此规则大量元素种类包括C C、H H、O O、N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S。其中其中C C、H H、O O为气体元素，其余六种为矿为气体元素，其余六种为矿质元素，分别占植物干重的百分数为
4、质元素，分别占植物干重的百分数为1818、1010、7070、0.3%0.3%、0.070.07、0.3%0.3%、0.3 0.3、0.07%0.07%、0.050.05。微量元素包括微量元素包括FeFe、B B、MnMn、ZnZn、MoMo、CuCu、CoCo、ClCl等。等。1 1、大量元素：、大量元素：组织培养中，各种矿质营养主要从培养基中获得，组织培养中，各种矿质营养主要从培养基中获得，N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S等等6 6种大量元素依靠各种无机盐提种大量元素依靠各种无机盐提供。供。不同植物种类和不同试验目的对元素的使用量要求不同植物种类和不同试验目的对元素的使用
5、量要求不同，需经试验确定。不同，需经试验确定。目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养。目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养。其中以其中以MSMS应用最广泛。应用最广泛。以以MSMS为例为例6 6中矿质元素分别由中矿质元素分别由KNOKNO3 3、NHNH4 4NONO3 3、KHKH2 2POPO4 4、MgSOMgSO4 4.7H7H2 2O O、CaClCaCl2 2.2H2H2 2O O提供。提供。大量元素中的氮通常采用硝态氮或铵态氮的形大量元素中的氮通常采用硝态氮或铵态氮的形式被使用，但铵态氮浓度过高会对有些植物培养物式被使用，但铵态氮浓度过高会对有些植物培养物造成伤害，不适
6、宜使用过高的浓度。而常用造成伤害，不适宜使用过高的浓度。而常用MSMS培养培养基中既有硝态氮又有铵态氮。基中既有硝态氮又有铵态氮。2 2、微量元素：、微量元素：植物组织的对其需要量极少，过多会产生植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如造成蛋白质变性、酶系失活。代谢毒害，如造成蛋白质变性、酶系失活。代谢障碍等。障碍等。各种微量元素均具有特定的生理功能，如各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关；铜能硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成；锰参与植物的光合作用促进离体根的形成；锰参与植物的光合作用和呼吸作用；钼为氮素代谢的重要元素。和呼吸作用；钼为
7、氮素代谢的重要元素。微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿素的合成起微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿素的合成起重要作用，由于在较高重要作用，由于在较高pHpH下，下，FeClFeCl3 3极易形成极易形成FeFe（OHOH）3 3沉淀，难以被吸收，所以多用沉淀，难以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二钠盐与乙二胺四乙酸二钠盐与硫酸亚铁硫酸亚铁形成的螯合物，并且单独配制。形成的螯合物，并且单独配制。（二）有机成分：（二）有机成分：主要包括各种主要包括各种维生素和氨基酸维生素和氨基酸，如硫胺素（，如硫胺素（V VB1B1）、）、烟酸（烟酸（V VB3B3）、）、吡哆醇（吡哆醇（V VB6B6）、）、泛酸钙
8、（泛酸钙（V VB5B5）、）、生物素、钴胺素（生物素、钴胺素（V VB12B12）、）、叶酸等以及甘氨酸、谷氨叶酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛氨酸等。有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有乳经酶法加工的水解产物，含有2020种氨基酸的混合种氨基酸的混合物，用量物，用量10101000mg/L,1000mg/L,通常用于原生质体等培养。通常用于原生质体等培养。此外此外肌醇肌醇是另外一种重要的有机成分，又叫环己是另外一种重要的有机成分，又叫环己六醇，
9、在糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷六醇，在糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及维持离子平衡等生理作用。脂代谢及维持离子平衡等生理作用。（三）植物生长调节物质：（三）植物生长调节物质：植物激素是植物新称代谢中产生的天然植物激素是植物新称代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的用量直接影响植化合物，它能以极微小的用量直接影响植物细胞的分化、分裂以及发育，影响植物物细胞的分化、分裂以及发育，影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱的形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱落、休眠、萌发等生理活动。落、休眠、萌发等生理活动。在植物组织培养中，主要通过植物激素在植物组织培养中，主要通过植物激素及
10、生长调节物质对离体的组织、器官的形及生长调节物质对离体的组织、器官的形态发生进行调控。包括诱导细胞分裂、愈态发生进行调控。包括诱导细胞分裂、愈伤组织的生长、根芽的分化以及体细胞胚伤组织的生长、根芽的分化以及体细胞胚胎发生等。胎发生等。常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素：激素：1 1、生长素类：、生长素类：IAAIAA、IBAIBA、NAANAA、2 2，4-D4-D2 2、细胞分裂类：、细胞分裂类：6-BA6-BA、KTKT（KinKin）、）、ZTZT、2ip2ip3 3、赤霉素类：、赤霉素类：GAGA3 3、GAGA4 4、GAGA7 74
11、 4、脱落酸：、脱落酸：ABAABA5 5、乙烯：、乙烯：ETHETH1 1、生长素类：、生长素类：主要促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形主要促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，促进生根。成愈伤组织，促进生根。常用的有常用的有NAANAA、IAAIAA、IBAIBA、2 2，4 4D D等。等。2 2、细胞分裂素类：、细胞分裂素类：促进细胞分裂和扩大，促进茎增促，抑制茎促进细胞分裂和扩大，促进茎增促，抑制茎伸长；诱导芽的分化、促进侧芽萌发；延缓衰伸长；诱导芽的分化、促进侧芽萌发；延缓衰老。老。常用细胞分裂素有常用细胞分裂素有BABA、KINKIN、ZTZT、2ip2ip等。等。此外近
12、年来发现苯基脲衍生物具有非常高的细此外近年来发现苯基脲衍生物具有非常高的细胞分裂素活性，在多种植物上应用。胞分裂素活性，在多种植物上应用。如如TDZTDZ，CPPUCPPU，4 4PUPU等。等。3 3、赤霉素类：、赤霉素类：主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无效；对主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无效；对形成层细胞分化有影响，与生长素协同作用；形成层细胞分化有影响，与生长素协同作用；可以诱导离体成花；打破休眠等功能。可以诱导离体成花；打破休眠等功能。常用常用GAGA3 3、GAGA4 4等等。4 4、脱落酸（、脱落酸（ABAABA）：）：促进休眠、衰老和脱落。组织培养中较促进休眠、衰老和脱落。组织
13、培养中较少使用，主要用于调节激素平衡，促进形少使用，主要用于调节激素平衡，促进形态建成。态建成。5 5、乙烯：、乙烯：主要促进衰老和脱落，高浓度易形态变化。主要促进衰老和脱落，高浓度易形态变化。（四）碳源：（四）碳源：碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在2 25 5，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养
14、。露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。糖浓度高低直接影响形态建成。糖浓度高低直接影响形态建成。（五）琼脂：（五）琼脂：琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水（子化合物，仅溶于热水（90 90 o oC C以上），成为凝胶，以上），成为凝胶，冷却后（冷却后（40 40 o oC C以下）即凝固为凝胶。以下）即凝固为凝胶。琼脂的用量通常在琼脂的用量通常在4 410g/L.10g/L.琼脂是组织培养培养基中主要的成本支出，约琼脂是组织培养培养基中主要的
15、成本支出，约占占8080。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工工艺琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工工艺有关外，还受高压灭菌时的温度、时间以及有关外，还受高压灭菌时的温度、时间以及pHpH影响。影响。（六）有机附加物：（六）有机附加物：1 1、椰子汁：、椰子汁：用量为用量为100100200g/L200g/L。2 2、香蕉泥：香蕉泥：使用量为使用量为150150200g/L200g/L。3 3、苹果汁、番茄汁等。苹果汁、番茄汁等。（七）其他成分：（七）其他成分：1 1、活性炭：、活性炭：使用量为使用量为0.2-1%0.2-1%。2 2、抗生素：、抗生素：常用青霉素、链霉素、庆大霉素等，用常用青霉
16、素、链霉素、庆大霉素等，用量在量在5 520mg/L20mg/L。3 3、抑制酚类物质形成的物质：、抑制酚类物质形成的物质：（1 1）抗坏血酸：）抗坏血酸：可以加入培养基或浸泡处理外植体。可以加入培养基或浸泡处理外植体。（2 2）聚乙烯吡咯烷酮）聚乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）：）：加入培养基中。加入培养基中。4 4、生长抑制剂：、生长抑制剂：常用矮壮素、比久（常用矮壮素、比久（B9B9）、）、多效唑多效唑（pp333pp333）、三碘苯甲酸、根皮酚等。三碘苯甲酸、根皮酚等。二、培养基的类型：二、培养基的类型：1 1、高盐浓度培养基：高盐浓度培养基：MSMS、B5B5、SHSH等等。适用于多数营
17、养需求量较大的植物。适用于多数营养需求量较大的植物。2 2、中等盐浓度培养基：中等盐浓度培养基：NitshNitsh、MillerMiller等等 大量元素浓度约为大量元素浓度约为MSMS的的1/21/2。3 3、低盐培养基：低盐培养基：WPMWPM、WhiteWhite等。等。大量元素浓度约为大量元素浓度约为MSMS的的1/41/4左右左右。适用于木本植物的培养。适用于木本植物的培养。表表1MS培养基的组成配方培养基的组成配方组成成分组成成分数量数量(mg/l)组成成分组成成分数量数量(mg/l)NH4NO31650 Na2-EDTA37.3 KNO31900 FeSO47H2O 27.8
18、CaCl22H2O 440 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 370 蔗糖蔗糖 30 KH2PO4170 pH 5.8 KI0.83 肌醇肌醇 100.0 H3BO36.2 烟酸烟酸 0.5 MnSO44H2O22.3 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.5 ZnSO47H2O8.6 甘氨酸甘氨酸 2.0 Na2MoO42H2O0.25 盐酸硫铵等盐酸硫铵等 0.4 CoCl26H2O0.025 表表2 2B B5 5培养基的组成和配方培养基的组成和配方组成成分组成成分 数量数量(mg/l）组成成分组成成分 数量数量(mg/l)KNO3 2500 FeSO47H2O 27.8 CaCl
19、22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖蔗糖40(NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇肌醇 100 H3BO4 3.0 烟酸烟酸 1.0 MnSO44H2O 10 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素激动素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 盐酸硫铵盐酸硫铵 10 Na2-EDTA37.3 表表3 N6培养基的组成和配方培养基的组成和配方组成成分组成成分 数量数量(mg/l)组成成分组成成分(mg/l)KNO3 2.3 Na2EDTA 37.
20、3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185 蔗糖蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8(NH4)2SO4 463 烟酸烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵盐酸硫铵 1.0 ZnSO47H2O1.5 三、培养基母液及激素母液的配制：三、培养基母液及激素母液的配制：由于培养基中元素种类多，用量少，因此每次称量由于培养基中元素种类多，用量少，因此每次称量繁琐，因此通常将各种营养成分配制成母液保存，配制繁琐，因此通常将各种营养成分配制成母液保存，配制
21、培养基时根据需要量取用，从而简化操作，节省时间。培养基时根据需要量取用，从而简化操作，节省时间。营养元素母液根据其性质和反应特性混合。营养元素母液根据其性质和反应特性混合。激素母液激素母液 根据使用浓度配制。根据使用浓度配制。1、器皿和用具的准备、器皿和用具的准备 仪器包括万分之一天平，百分之一天平，仪器包括万分之一天平，百分之一天平，pH计计 用品包括不同型号的烧杯（用品包括不同型号的烧杯（2000ml、1000ml、100ml），），容量瓶（容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、）、移液移液管（管（10ml、5ml、2ml、1ml）、）、试剂瓶若干（试剂瓶若干（1000ml、25
22、0ml）、）、移液器（移液器（1000ul、200ul）滴灌、玻璃棒、滴灌、玻璃棒、试管、各种规格三角瓶（试管、各种规格三角瓶（150ml、100ml、50ml）、）、培养基分装器，漏斗、称量纸、标签纸、不同范围培养基分装器，漏斗、称量纸、标签纸、不同范围pH试纸、铅笔等。试纸、铅笔等。玻璃器皿用前清洗干净。玻璃器皿用前清洗干净。2、药品及蒸馏水准备：、药品及蒸馏水准备：药品采用分析纯或化学纯试剂。药品采用分析纯或化学纯试剂。水利用蒸馏水或去离子水。水利用蒸馏水或去离子水。3、母液配制：、母液配制：（1）配制母液原则：）配制母液原则：相同类型的试剂混合；相同类型的试剂混合；易形成沉淀的药品分开
23、；易形成沉淀的药品分开；母液浓度要适宜；母液浓度要适宜；用量要认真计算和核对；用量要认真计算和核对；药品要准确称量。药品要准确称量。（2）MS培养基母液的配制：培养基母液的配制：MS培养基母液根据试剂特性通常配成四种母液，培养基母液根据试剂特性通常配成四种母液，即大量元素母液（即大量元素母液（10或或20倍倍）、）、微量元素母液（微量元素母液（100或或1000倍倍）、）、Fe盐（盐（100倍）、有机物（倍）、有机物（100倍）。倍）。配置前先进行根据培养基组成和配制体积计算母配置前先进行根据培养基组成和配制体积计算母液试剂用量，然后称取药品，大量元素可以用百分液试剂用量，然后称取药品，大量元
24、素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，铁盐和有机物用之一或千分之一天平，微量元素，铁盐和有机物用万分之一天平称量。万分之一天平称量。（3）激素母液的配制：）激素母液的配制：根据各种激素的使用浓度配制适宜的母液，用根据各种激素的使用浓度配制适宜的母液，用万分之一天平称取激素，溶剂溶解后加水定容。万分之一天平称取激素，溶剂溶解后加水定容。生长素类、赤霉素类及脱落酸等用生长素类、赤霉素类及脱落酸等用95乙醇溶乙醇溶解；细胞分裂素类用解；细胞分裂素类用1N HCl或或1N NaOH溶解溶解。通常激素母液浓度生长素类为通常激素母液浓度生长素类为0.10.5 mg/ml,细胞分裂素母液浓度为细胞分裂素
25、母液浓度为0.21.0 mg/ml.四、培养基的配制：四、培养基的配制：1、量取母液：营养元素和激素。、量取母液：营养元素和激素。2、称量蔗糖、琼脂，放入、称量蔗糖、琼脂，放入600ml左右蒸馏水的锅左右蒸馏水的锅内，电路上加热，使琼脂溶化。内，电路上加热，使琼脂溶化。3、加入母液，混合均匀，调整、加入母液，混合均匀，调整pH值。值。4、分装入瓶，每瓶、分装入瓶，每瓶4050ml。5、封口：用封口：用46层称量纸封口，之后灭菌备用。层称量纸封口，之后灭菌备用。五、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）：五、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）：1、加热、加热：灭菌前检查灭菌锅内水量是否充足，灭菌前检查灭菌锅内水
26、量是否充足，然后将培养基放于灭菌锅内，改好盖，关然后将培养基放于灭菌锅内，改好盖，关闭放气阀，打开电源，加热升温。闭放气阀，打开电源，加热升温。2、排气、排气：当温度升至当温度升至0.5kg/cm2时，打开放气阀时，打开放气阀彻底排出锅内冷空气。然后关闭放气阀，彻底排出锅内冷空气。然后关闭放气阀，促使压力继续上升。促使压力继续上升。3、温度控制：、温度控制：当锅内压力升至当锅内压力升至1.1kg/cm2时，计时时，计时1520分钟，计时结束后，关闭电源。分钟，计时结束后，关闭电源。4、出锅：、出锅：当灭菌锅自然冷却后，取出培养基，放置当灭菌锅自然冷却后，取出培养基，放置于接种室备用。于接种室备用。六、培养基的保存：六、培养基的保存：1、防尘：、防尘：防治灰尘污染。防治灰尘污染。2、避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。、避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。3、恒温：、恒温：4 oC可保存可保存36周，室温下两周内用完。周，室温下两周内用完。4。定期更新：不易长期保存。定期更新：不易长期保存。2005091320050913