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1、会计学1酶组织化学总论酶组织化学总论一一.概述概述酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质高效性 103-106倍专一性低反应条件易变性失活降低生化反应的反应活化能第1页/共33页酶活性的检测方法酶活性的检测方法广义上说，任何一种可以测定反应物变化速度的分析技术，都可用来测定酶活性l容量法（量气法）l比色法与分光光度法l荧光法与同位素法l离子选择电极法，旋光法l分子生物学，免疫化学法等第2页/共33页酶的组织化学酶的组织化学 利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法第3页/共33页 酶组织化学发展历史酶组织化学发展历史酶组织化学发展
2、历史酶组织化学发展历史1.1.18681868年年 Klebs Klebs 组化组化2.2.19391939年年 TakamatsuTakamatsu、Gomori Gomori 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 1940-1960 1940-1960年年3.3.电镜酶组织化学电镜酶组织化学 1955 1955年年 Scheldon Scheldon 酸性磷酸酶酸性磷酸酶4.4.免疫酶组织化学免疫酶组织化学 1970 1970年年 Sternberger Sternberger 酶标抗体法酶标抗体法目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达100100余种余种第4页/共33页
3、 酶的种类酶的种类酶的种类酶的种类 1.氧化还原酶 2.转移酶 3.水解酶 4.裂解酶 5.异构酶 6.合成酶第5页/共33页二二.酶组织化学反应的基本知识酶组织化学反应的基本知识l酶的特性l酶的定位l酶组织化学的基本原理第6页/共33页（一）酶的特性（一）酶的特性1.1.水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂2.2.有机溶剂不同程度降低酶的活性3.3.易受温度影响，对热耐受性弱4.4.对干燥耐受性强第7页/共33页（二）酶的定位（二）酶的定位 酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位 5-核苷酸酶浆膜 ATPase肌球蛋白 细胞膜 线粒体第8页/共33页(三）酶组化的基本条件三）酶组化的基本条件
4、同时保存结构和酶的活性 保存酶的定位，防止酶的扩散或移位 保证反应产物的特异性*影响酶活性的因素：温度 PH值 抑制剂 激活剂第9页/共33页（四）原理及一般原则（四）原理及一般原则第10页/共33页1.1.基本原理基本原理基本原理基本原理 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物）然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物 该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在第11页/共33页第一反应：酶促反应 底物 初级反应产物（PRP）第二反应：捕捉反应 PRP+捕捉剂 终反应产物（FRP）酶第12页/共33页*PRP弥散：1.底物在酶催化下水解的速度 2.PR
5、P在缓冲液中的弥散系数 3.PRP与辅助物反应的速度 应选择合适的底物和辅助物,减少弥散 捕捉剂的浓度 （1mg/ml）第13页/共33页2.2.一般原则一般原则一般原则一般原则1.1.对组织处理对组织处理,制片过程不能影响酶的活性制片过程不能影响酶的活性及分布及分布2.2.所选底物和辅助物必须迅速所选底物和辅助物必须迅速,同步穿透入同步穿透入组织和细胞中组织和细胞中3.3.所选底物最好只能被一种酶催化分解所选底物最好只能被一种酶催化分解4.4.所选辅助物不影响细胞内酶的活性所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影不影响其他反应试剂的穿透性响其他反应试剂的穿透性5.5.PRPPRP必须迅速与辅助物
6、反应必须迅速与辅助物反应,FRPFRP为水不溶为水不溶性的有色稳定产物性的有色稳定产物6.6.所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合附或结合第14页/共33页(五五)酶组织化学的主要步骤酶组织化学的主要步骤 1.酶的固定 （fixation）2.酶的特异性反应 （specific reaction）3.在最适条件下,酶反应产物的沉着（precipitation）4.使沉着物具有可见性 （visualization）组织组织/细胞细胞 制作切片制作切片 酶反应（孵育）酶反应（孵育）显色显色 封片封片 镜检镜检第15页/共33页（六）各步骤注意问题（六）各
7、步骤注意问题1.1.检测方法的选择2.2.酶的保存与固定 一般新鲜组织快速冷冻一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片冰冻切片 -70 -70长期保存长期保存 固定剂固定剂 1-4%1-4%多聚甲醛多聚甲醛,福尔马林福尔马林,戊二醛戊二醛 固定时间固定时间 固定方法固定方法:浸泡固定浸泡固定 灌流固定灌流固定 固定温度固定温度:04:04第16页/共33页（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题3.切片制作:切片厚度40um4.缓冲液选择 缓冲液用于缓冲液用于 A.A.配置固定液配置固定液 B.B.漂洗液漂洗液 C.C.配置酶反应孵育液配置酶反应孵育液 选择缓冲液应注意选择缓冲液应注意 A.A.不能减弱
8、目标酶的活性不能减弱目标酶的活性 B.B.不能含有与捕捉机制相同的物质不能含有与捕捉机制相同的物质 C.C.注意漂洗用缓冲液的渗透压注意漂洗用缓冲液的渗透压 D.D.漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同第17页/共33页（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题5.孵育反应 A.孵育液配置 B.孵育的温度和时间:37 15-30min C.切片孵育法 -切片孵育 -漂浮孵育第18页/共33页（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题6.酶特异性对照实验 用酶活性抑制剂 采用无底物的孵育液 过固定或加热 用针对目标酶的激活剂 改变孵育液底物 选择最适P
9、H 酶细胞内的定位差异第19页/共33页（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题7.孵育后操作 光镜:酶孵育后进行后固定酶孵育后进行后固定 脱水脱水 封片封片,镜检镜检 电镜:孵育后孵育后,后固定后固定 脱水脱水 超薄切片超薄切片 后染后染色色 电镜检查电镜检查第20页/共33页（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题8.人为产物及其原因 酶或与检测有关物质的扩散 最终反应产物的扩散 吸附现象 反应阴性第21页/共33页三三.显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法（一）金属离子沉淀法 一般用于显示磷酸酶第22页/共33页1.1.钙钴法钙钴法钙钴法钙钴法-甘油磷酸钠 磷酸酯+Ca+磷酸钙 磷酸
10、钴 硫化钴（黑色沉淀）（黑色沉淀）酶底物酶底物 PRPPRP（磷酸）磷酸）+某金属某金属 金属金属 显色显色 与底物混合液中与底物混合液中 置换置换 某金属离子结合某金属离子结合AKPCo+硝酸钴硫化胺酶第23页/共33页2.2.Gomori Gomori 硝酸铅法硝酸铅法硝酸铅法硝酸铅法-甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅（黑色沉淀）（黑色沉淀）酶底物酶底物 PRPPRP（磷酸）磷酸）显色反应显色反应 与底物混合液中与底物混合液中 金属离子结合金属离子结合 ACP硫化胺 酶 直接沉着第24页/共33页 （二）偶氮偶联法（偶氮色素法）1.原理底物混合液底物混合液 PRPPRP与与 不溶性不
11、溶性 重氮盐结合重氮盐结合 偶氮色素偶氮色素2.方法 同时偶联法同时偶联法 后偶联法后偶联法酶 偶氮偶联第25页/共33页3.常用底物 萘酚AS-BI 萘酚AS-D 萘酚AS-MX 萘酚AS-TR 常用重氮盐 坚牢兰RR 坚牢兰B 坚牢红RC 坚牢红TR 坚牢紫B 六偶氮副品红 六偶氮新品红第26页/共33页4.举例-萘基磷酸钠 磷酸氢二钠+-萘酚-萘酚+坚牢兰 偶氮染料沉淀5.应用 可显示ALPase,ACPase,酯酶,转肽酶,肽酶,-葡糖苷酶等磷酸酶第27页/共33页(三三三三)联苯胺色素法联苯胺色素法联苯胺色素法联苯胺色素法 用于显示过氧化物酶 原理:无色联苯胺无色联苯胺 有色联苯胺有
12、色联苯胺过氧化物酶,H2O2 脱氢(DAB)联苯胺褐第28页/共33页(四四四四)四唑盐法四唑盐法四唑盐法四唑盐法用于显示氧化酶和脱氢酶原理:四唑盐或双四唑盐四唑盐或双四唑盐 氢离子氢离子 与与 与与 底物混合液底物混合液 无色四唑盐结合无色四唑盐结合 红色或兰色的沉淀红色或兰色的沉淀 脱氢酶 +2H被还原第29页/共33页常用四唑盐种类 三苯四唑氯化物 TTC 蓝四唑盐 BT 新四唑盐 NT 四唑氮蓝 NBT 四氮四唑盐氯化物 TNBT第30页/共33页(五五五五)靛蓝反应靛蓝反应靛蓝反应靛蓝反应原理:底物被酶分解为二个初级反应产物,其中之一可在一定条件下形成不溶性的靛蓝应用:可显示胆碱酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特异性酯酶例如：吲哚酚酯吲哚酚酯 吲哚酚吲哚酚+RCOOHRCOOH 吲哚酚吲哚酚 靛蓝（兰色沉淀）靛蓝（兰色沉淀）酯酶+水氧化作用 O2第31页/共33页四四.酶组织化学的应用酶组织化学的应用1.1.了解组织、细胞的代谢活动2.2.细胞类型的判断3.3.了解细胞定位4.4.用于肿瘤的研究5.5.用于免疫组化和杂交组化的显示手段第32页/共33页