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1、课题导入1、简述蛋白质工程的实质及基因工程生、简述蛋白质工程的实质及基因工程生产的蛋白质种类。产的蛋白质种类。2、解释蛋白质工程的基本原理及基本途、解释蛋白质工程的基本原理及基本途径径。1.4 蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起一、蛋白质工程崛起的缘由一、蛋白质工程崛起的缘由 通过基因工程能够大规模生产生物体内微量存在的通过基因工程能够大规模生产生物体内微量存在的活性物质，并借助转基因而改变动植物性状，得以在活性物质，并借助转基因而改变动植物性状，得以在人类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。然而在广人类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。然而在广泛利用自然界各种蛋白质的过程中就发现，这些蛋白泛利用
2、自然界各种蛋白质的过程中就发现，这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对它们进行产业化开质只是适应生物自身的需要，而对它们进行产业化开发往往不合意，需要加以改造。发往往不合意，需要加以改造。活动活动1:阅读阅读P26.回答回答:为什么要进行蛋白质工程为什么要进行蛋白质工程?在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应活性或活性很低
3、。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。例如例如:干扰素是一种抗病毒、抗
4、肿瘤的药物。将人干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然产品，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，这样？如何改变这种状况？研究发现，-干扰素蛋白干扰素蛋白质中有质中有3个半胱氨酸（第个半胱氨酸（第17位、位、31位和位和141位），推位），推测可能是有
5、一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第键。研究人员将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的-干扰素干扰素的抗病性活性提高到的抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然，并且比天然-干扰干扰素的贮存稳定性高很多。素的贮存稳定性高很多。例如：例如：改造改造干扰素（半胱氨酸）干扰素（半胱氨酸）体外很难保存体外很难保存干扰素（丝氨酸）干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶天冬氨
6、酸激酶（352位的苏氨酸）位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）位的天冬酰胺）改造改造改造改造天冬氨酸激酶（异亮氨酸）天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍玉米中赖氨酸含量可提高数倍“后后基基因因组组时时代代”将将是是“蛋蛋白白质质组组学学时时代代”，即即从从对对基基因因信信息息的的研研究究转转向向对对蛋蛋白白质质信信息息的的研研究究，包包括括研研究究蛋蛋白白质质结结构构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。功能与应用及蛋白质相互关系和作用。蛋蛋白白质质工工程程就就是是在在对对蛋蛋白白
7、质质的的化化学学、晶晶体体学学、动动力力学学等等结结构构与与功功能能认认识识的的基基础础上上，对对蛋蛋白白质质人人工工改改造造与与合合成成，最最终终获获得商业化的产品。得商业化的产品。何谓蛋白质工程？何谓蛋白质工程？是指以蛋白质分子的结构规律及其与是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。产和生活的需求。二、蛋白质工程的基本原理二、蛋白质工程的基本原理活动2：对照P27蛋白质工程流程
8、图，说出主要步骤。蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；）测定其氨基酸序列；（3）借借助助核核磁磁共共振振和和X射射线线晶晶体体衍衍射射等等手手段段，尽尽可可能能地地了了解解蛋蛋白质的二维重组和三维晶体结构白质的二维重组和三维晶体结构;（4）设设计计各各种种处处理理条条件件，了了解解蛋蛋白白质质的的结结构构变变化化，包包括括折折叠叠与与去去折折叠叠等对其活性与功能的影响；等对其活性与功能的影响；（5）设设计计编编码码该该蛋蛋白
9、白的的基基因因改改造造方方案，如定点突变；案，如定点突变；（6）分分离离、纯纯化化新新蛋蛋白白，功功能能检检测测后投入实际使用。后投入实际使用。活动活动3：对照密码表，至少写出三种决定对照密码表，至少写出三种决定“丙氨酸丙氨酸色氨酸色氨酸赖氨酸赖氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸苯苯丙氨酸丙氨酸”的脱氧核苷酸序列。的脱氧核苷酸序列。第一个第一个 字母字母第二个字母第二个字母第三个第三个 字母字母UCAGU苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸 亮氨酸亮氨酸 亮氨酸亮氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸 终止终止 终止终止半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸 终止终止 色氨酸色氨
10、酸UCAGC亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸UCAGA 异亮氨酸异亮氨酸 异亮氨酸异亮氨酸 异亮氨酸异亮氨酸甲硫氨酸（起始）甲硫氨酸（起始）苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸天门冬酰胺天门冬酰胺天门冬酰胺天门冬酰胺 赖氨酸赖氨酸 赖氨酸赖氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸UCAGG 缬氨酸缬氨酸 缬氨酸缬氨酸 缬氨酸缬氨酸缬氨酸缬氨酸（起始）（起始）丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸
11、天门冬氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸 谷氨酸谷氨酸 谷氨酸谷氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸UCAG讨论：讨论：1、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。请把相应的碱基序列写出来。2、确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造、确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（目的基因（DNA）？）？丙氨酸：丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG 色氨酸：色氨酸：UGG 赖氨酸：赖氨酸：AAA、AAG 甲硫氨酸：甲硫氨酸：AUG 苯丙氨酸：苯丙氨酸：UUU、UUC 可以通过人工合成的方法获取或基
12、因的定点诱变技可以通过人工合成的方法获取或基因的定点诱变技术来改变。术来改变。“丙氨酸丙氨酸色氨酸色氨酸赖氨酸赖氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸”的脱氧核苷酸序列。的脱氧核苷酸序列。（一）蛋白质的分子设计与改造（一）蛋白质的分子设计与改造 蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质的一级结构、晶体结构和溶液构象通过蛋白质的一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累了成千上万蛋白质一级结构和高的研究，积累了成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，并编制成系统的数据库，级结构的数据资料，并编制成系统的数据库，得以从中找出蛋白质分子间的进化关系、一级
13、得以从中找出蛋白质分子间的进化关系、一级结构和高级结构的关系、结构与功能的关系方结构和高级结构的关系、结构与功能的关系方面的规律。面的规律。蛋白质作为生物大分子是生物化学和分子生物学蛋白质作为生物大分子是生物化学和分子生物学的研究重点，大量蛋白质被分离纯化，测定了它们的的研究重点，大量蛋白质被分离纯化，测定了它们的结构、性质和生物学作用。分子生物学有关基因组的结构、性质和生物学作用。分子生物学有关基因组的研究，也可以用以推测出一些未知蛋白质的结构与功研究，也可以用以推测出一些未知蛋白质的结构与功能。采用定位诱变的方法，可以对编码蛋白质的基因能。采用定位诱变的方法，可以对编码蛋白质的基因进行核苷
14、酸密码子的插入、删除、置换和改组，其结进行核苷酸密码子的插入、删除、置换和改组，其结果为分子改造提供新的设计方案。现有的蛋白质是生果为分子改造提供新的设计方案。现有的蛋白质是生物长期进化的结果，蛋白质工程则是对生物进化的模物长期进化的结果，蛋白质工程则是对生物进化的模拟，按照蛋白质形成的规律，改造蛋白质或构建新的拟，按照蛋白质形成的规律，改造蛋白质或构建新的蛋白质。蛋白质。蛋白质的改造通常需要先经周密的分子设计，然蛋白质的改造通常需要先经周密的分子设计，然后依赖基因工程获得突变型蛋白质，以检验其是否达后依赖基因工程获得突变型蛋白质，以检验其是否达到了预期的效果。如果改造的结果不理想，还需要从到
15、了预期的效果。如果改造的结果不理想，还需要从新设计再进行改造，往往经历多次实践摸索才能达到新设计再进行改造，往往经历多次实践摸索才能达到改进蛋白质性能的预定目标。改进蛋白质性能的预定目标。（二）蛋白质改造工程举例（二）蛋白质改造工程举例1水蛭素改造水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由多种变异体，由65或或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭活性，在综
16、合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体素主要变异体HV2的设计方案，将的设计方案，将47位的位的Asn（天冬酰（天冬酰胺）变成胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第（赖氨酸），使其与分子内第4或第或第5位位Thr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高4倍，倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。倍。2生长激素改造生长激素改造生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体生长激素通过对它特异受体的作用促进细
17、胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体
18、结合需加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第侧链，如第18和第和第21位位His（组氨酸）和第（组氨酸）和第17位位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还有大量的工作要做。发作为临床用药还有大量的工作要做。3胰岛素改造胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注
19、射部位进入血液，从而延缓了其降血延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。胰岛素已通过临床实验。4治癌酶的改造治癌酶的改造 癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正
20、常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而使这些碱基结构类似物磷酸化而使这些碱基3-OH缺乏缺乏,从而阻断从而阻断DNA的合成，杀死癌细胞。的合成，杀死癌细胞。HSVTK催化能力可以通过催化能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种酶酶,在酶活性部位附近有在酶活性部位附近有6个氨基酸被替换，催化能力个氨基酸被替换，催化能力20倍以上。倍以上。蛋白质工程的发展很
21、快，研究工作很多，以上仅介绍蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍了几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设了几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能计制造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作的一种强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并论。用，可以和任何重大的生物研究方法相提并论。比较基因工程和蛋白质工程比较基因工程和蛋白质工程基因工程基因工程蛋白质工程蛋白质工程操作水平操作水平都属于分子水平都属于分子水平操作对象操作对象DNADN
22、A中的基因中的基因基因的碱基基因的碱基 蛋白质蛋白质产生新的产生新的基因型，无新基因基因型，无新基因基因（型）基因（型）产生的蛋白质产生的蛋白质原有的原有的新的新的联系联系蛋白质工程以基因工程为基础，蛋白质工程以基因工程为基础，是基因工程的应用和延伸是基因工程的应用和延伸三、蛋白质工程的进展和前景三、蛋白质工程的进展和前景蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。新时期。