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1、第六章 种子生活力测定的原理和方法一、种子生活力的概念和测定意义一、种子生活力的概念和测定意义二、种子生活力四唑染色测定二、种子生活力四唑染色测定三、种子生活力的其他测定方法三、种子生活力的其他测定方法1/3/20231A1、种子生活力（、种子生活力（seed viability）的概念）的概念 种子生活力种子生活力是指是指种子发芽的潜在能力和种胚所具有的生命种子发芽的潜在能力和种胚所具有的生命力力。通常是指一批种子中具有生命力的种子数占种子总数的。通常是指一批种子中具有生命力的种子数占种子总数的百分率。百分率。一、种子生活力的概念和测定意义一、种子生活力的概念和测定意义第六章 种子生活力测定
2、的原理和方法能发芽的种子能发芽的种子暂时不能发芽而具有生命力的休眠种子暂时不能发芽而具有生命力的休眠种子1/3/20232A2、测定种子生活力的意义、测定种子生活力的意义（1 1）休眠的种子必须进行生活力测定）休眠的种子必须进行生活力测定（2 2）快速预测种子发芽能力）快速预测种子发芽能力第六章 种子生活力测定的原理和方法1/3/20233A二、种子生活力四唑染色测定二、种子生活力四唑染色测定（TTC test or TZ test）1、发展简史、发展简史第六章 种子生活力测定的原理和方法l1942年由德国年由德国H.Lakon发明发明l1950年年ISTA成立四唑测定技术委员会成立四唑测定技
3、术委员会l 1953年年ISTA世界大会世界大会第一次将四唑测定列入国际种子检验规程第一次将四唑测定列入国际种子检验规程l四唑测定手册（四唑测定手册（Handbook on Tetrazolium Test），），Moore，1984年，年，650多个属和种多个属和种l1995年我国将四唑测定列入农作物种子检验规程年我国将四唑测定列入农作物种子检验规程1/3/20234A 无色的的三苯基四氮唑被种子吸收后，在胚部活细无色的的三苯基四氮唑被种子吸收后，在胚部活细胞中脱氢酶的作用下，还原成为胞中脱氢酶的作用下，还原成为红色的、稳定、不扩散红色的、稳定、不扩散的三苯基甲的三苯基甲 ，这样，就可根据染
4、色的部位和深浅来区分这样，就可根据染色的部位和深浅来区分种子红色的有生活力部分和无色的死亡部分。种子红色的有生活力部分和无色的死亡部分。2、原理、原理第六章 种子生活力测定的原理和方法1/3/20235A3、特点、特点原理可靠原理可靠结果准确结果准确(与标准发芽率误差一般不超过与标准发芽率误差一般不超过3-3-5%)5%)不受休眠限制不受休眠限制简便快速简便快速 6-24h 6-24h VitascopeVitascope 20-30min 20-30min成本低廉成本低廉第六章 种子生活力测定的原理和方法1/3/20236A测定休眠种子的发芽潜力测定休眠种子的发芽潜力测定收获后马上要播种的种
5、子的发芽潜力测定收获后马上要播种的种子的发芽潜力测定发芽缓慢的种子的发芽潜力测定发芽缓慢的种子的发芽潜力测定发芽末期未发芽种子的生活力测定发芽末期未发芽种子的生活力测定种子收获或加工期间损伤种子的生活力测定种子收获或加工期间损伤种子的生活力解决发芽期间遇到的问题解决发芽期间遇到的问题查明种子贮藏期间劣变衰老程度查明种子贮藏期间劣变衰老程度时间紧迫，调种时快速测定种子生活力时间紧迫，调种时快速测定种子生活力第六章第六章 种子生活力测定的原理和方法种子生活力测定的原理和方法4、适应范围、适应范围1/3/20237A5、所需试剂、所需试剂第六章 种子生活力测定的原理和方法四氮唑：四氮唑：2,3,5-
6、2,3,5-氯（溴）化三苯基四氮唑氯（溴）化三苯基四氮唑 （2,3,5-Triphenyl 2,3,5-Triphenyl TetrazoliumTetrazolium Chloride or Bromide Chloride or Bromide）简简称：称：四唑四唑或或红四唑红四唑 缩写：缩写：TTC，TTB，TZ 理化性质理化性质u白色或淡黄色的粉剂，熔点白色或淡黄色的粉剂，熔点243243；u当温度达到当温度达到245245时就会分解，易溶于水，具有微毒；时就会分解，易溶于水，具有微毒；u遇到直射光线时会被还原成粉红色，遇到直射光线时会被还原成粉红色，所以该试剂需用棕色瓶装盛，并用黑纸
7、外面包装。所以该试剂需用棕色瓶装盛，并用黑纸外面包装。已配好的四唑溶液应装入棕色玻璃瓶里，存放在暗处。已配好的四唑溶液应装入棕色玻璃瓶里，存放在暗处。在进行种子染色时，也许将其放在暗处和弱光处进行。在进行种子染色时，也许将其放在暗处和弱光处进行。1/3/20238A5、所需试剂、所需试剂第六章 种子生活力测定的原理和方法 测定方法测定方法l建议使用建议使用 0.1%1.0%四唑盐的水溶液四唑盐的水溶液切开的种子用切开的种子用 0.1%0.5%浓度的四唑溶液；浓度的四唑溶液；整个胚、整粒种子或斜切、横切或穿刺的种子需用整个胚、整粒种子或斜切、横切或穿刺的种子需用 1.0%浓度浓度的四唑溶液；的四
8、唑溶液；种子染色时间与四唑溶液浓度有关。种子染色时间与四唑溶液浓度有关。l浓度增加，染色反应所需时间也随之缩短，从染色效果看，以较低浓度为宜；浓度增加，染色反应所需时间也随之缩短，从染色效果看，以较低浓度为宜；l测定时，要求四唑溶液的测定时，要求四唑溶液的 ph 值在值在 6 7 范围之内。范围之内。1/3/20239A5、所需试剂、所需试剂第六章 种子生活力测定的原理和方法 配制方法配制方法l称取称取 1 g 四唑粉剂四唑粉剂溶解于溶解于 100 ml 磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液中，即配成中，即配成 1.0%四唑溶液四唑溶液；l称取称取 0.1 g 四唑粉剂四唑粉剂溶解于溶解于 100 ml
9、磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液中，即配成中，即配成 0.1%四唑溶液四唑溶液；l可用可用 NaOH 或或 NaHCO3 溶液调节溶液调节 ph 值。值。1/3/202310A5、所需试剂、所需试剂第六章 种子生活力测定的原理和方法磷酸缓冲液磷酸缓冲液uISTA TZ手册法手册法 uAOSA 规程法规程法母液母液：称取称取 9.078 g 磷酸二氢钾（磷酸二氢钾（KH2PO4）溶解于）溶解于1000 ml 蒸馏水中；蒸馏水中；母液母液：称取称取 9.472 g 磷酸氢二钠（磷酸氢二钠（Na2HPO4）或）或 11.876 g Na2HPO4 2H2O 溶解溶解于于1000 ml 蒸馏水；蒸馏水；然后取
10、然后取 2 份份母液母液和和 3 份份母液母液混合即成。混合即成。在在1000 ml 蒸馏水中加入蒸馏水中加入 5.45 g NaH2PO4 和和 3.79 g Na2HPO4 ，充分溶解即成。，充分溶解即成。1/3/202311A5、所需试剂、所需试剂第六章 种子生活力测定的原理和方法乳酸苯酚透明液乳酸苯酚透明液 用于小粒豆类种子或牧草种子用于小粒豆类种子或牧草种子,染色后种皮、稃壳或胚乳变为染色后种皮、稃壳或胚乳变为透明。透明。过氧化氢溶液过氧化氢溶液1.1.用于某些牧草种子（黑麦草）的预湿浸种，加快酶的活化和吸用于某些牧草种子（黑麦草）的预湿浸种，加快酶的活化和吸胀。胀。杀菌剂和抗生素杀
11、菌剂和抗生素1.1.延缓衰弱种子的劣变进程。延缓衰弱种子的劣变进程。胶液硬化剂胶液硬化剂1.1.有些种子浸种后，种皮表面出现胶液而变得非常光滑，难以拿有些种子浸种后，种皮表面出现胶液而变得非常光滑，难以拿牢进行样品准备。牢进行样品准备。1/3/202312A6、测定程序、测定程序第六章 种子生活力测定的原理和方法（1 1）预处理）预处理 l预措：预措：是指在种子预湿前除去种子外部的附属物和在种子是指在种子预湿前除去种子外部的附属物和在种子非要害部位弄破种皮。非要害部位弄破种皮。l预湿预湿:为加快种子充分吸湿，软化种皮，便于样品准备，为加快种子充分吸湿，软化种皮，便于样品准备，以提高染色的均匀度
12、，通常种子在染色前要进行预湿。以提高染色的均匀度，通常种子在染色前要进行预湿。1/3/202313A6、测定程序、测定程序第六章 种子生活力测定的原理和方法l预湿预湿（1）预处理）预处理u水浸快速预湿：适合于水稻、大豆和花生等作物种子水浸快速预湿：适合于水稻、大豆和花生等作物种子u纸床缓慢预湿：适合于葱、玉米和小麦等作物种子纸床缓慢预湿：适合于葱、玉米和小麦等作物种子 纸床预湿纸床预湿(小粒豆类种子小粒豆类种子)纸卷预湿纸卷预湿(大豆、菜豆、豌豆）大豆、菜豆、豌豆）uH2O2溶液浸种：溶液浸种：（为了加快种子吸胀和促进酶的活化以及（为了加快种子吸胀和促进酶的活化以及缩短预湿时间）缩短预湿时间）
13、0.3%,2030,1 h 农作物种子四唑染色技术规定农作物种子四唑染色技术规定1/3/202314Aa)a)不需预湿和附加准备：不需预湿和附加准备：如苜蓿种子如苜蓿种子b)b)采用缓慢预湿后不需样品准备：采用缓慢预湿后不需样品准备：如大豆种子等如大豆种子等c)c)穿刺或切开胚乳：穿刺或切开胚乳：小粒牧草等种子小粒牧草等种子d)d)沿胚纵切：沿胚纵切：水稻、玉米、和麦类等水稻、玉米、和麦类等e)e)近胚纵切：近胚纵切：松柏和伞形科等植物种子松柏和伞形科等植物种子f)f)上半粒纵切：上半粒纵切：莴苣和其他菊科等植物种子莴苣和其他菊科等植物种子第六章 种子生活力测定的原理和方法（2）染色前的样品准
14、备）染色前的样品准备目的：使四唑溶液快速和充分渗入种子全部活组织，加快染色反目的：使四唑溶液快速和充分渗入种子全部活组织，加快染色反应，采用适当方法使胚的主要构造和活的营养组织暴露出来。应，采用适当方法使胚的主要构造和活的营养组织暴露出来。1/3/202315Ag)g)切去种子基端：切去种子基端：茜草科等植物种子茜草科等植物种子h)h)斜切种子：斜切种子：菊科、十字花科和蔷薇科等菊科、十字花科和蔷薇科等i)i)横切胚乳：横切胚乳：黑麦草、羊茅等植物种子黑麦草、羊茅等植物种子j)j)剥去种皮：剥去种皮：矮牵牛、茶籽和棉花等植物种子矮牵牛、茶籽和棉花等植物种子k)k)剥开胚乳取出胚：剥开胚乳取出胚
15、：杜仲等林木种子杜仲等林木种子l)l)横切胚轴和盾片：横切胚轴和盾片：大麦和小麦等大麦和小麦等m)m)从果实内取出胚：从果实内取出胚：桃等桃等n)n)横切种子两端：横切种子两端：山茱萸和胡颓子等山茱萸和胡颓子等o)o)平切果种皮和胚乳，露出胚的构造：平切果种皮和胚乳，露出胚的构造：洋葱和菠菜等植物种子洋葱和菠菜等植物种子第六章 种子生活力测定的原理和方法（2）染色前的样品准备）染色前的样品准备1/3/202316A第六章 种子生活力测定的原理和方法1.1.禾谷类禾谷类:通过胚和约在胚乳四通过胚和约在胚乳四分之三个纵切分之三个纵切2.2.燕麦属燕麦属:靠近胚部横切靠近胚部横切3.3.牧草牧草:通
16、过胚乳末端部分横切通过胚乳末端部分横切和纵切和纵切4.4.牧草牧草:种子刺穿胚乳种子刺穿胚乳5.5.莴苣属莴苣属:通过子叶末端一半纵通过子叶末端一半纵切切6.6.第第5 5种方式进行纵切时的解剖种方式进行纵切时的解剖刀部位刀部位7.7.伞形科伞形科:沿胚的旁边纵切沿胚的旁边纵切8.8.针叶树针叶树:种子沿胚旁边纵切种子沿胚旁边纵切9.9.两端横切两端横切,打开胚腔打开胚腔,并切去小并切去小部分胚乳部分胚乳.1/3/202317A（3）染色温度和时间）染色温度和时间第六章 种子生活力测定的原理和方法l将准备好的种子样品放入染色盘中，加入将准备好的种子样品放入染色盘中，加入适宜浓度的四唑溶液适宜浓
17、度的四唑溶液完全淹没种完全淹没种子，移置于子，移置于一定温度一定温度的的黑暗黑暗控温设备内或控温设备内或弱光弱光下进行染色反应。下进行染色反应。l所用染色时间因四唑溶液浓度、温度、种子种类、样品准备方法等因素的所用染色时间因四唑溶液浓度、温度、种子种类、样品准备方法等因素的不同而异。不同而异。l在在 2045 范围内，温度范围内，温度每增加每增加 5，其，其染色时间可减少一半染色时间可减少一半。l达到规定时间或染色已很明显时，倒去达到规定时间或染色已很明显时，倒去四唑溶液，用清水冲洗。四唑溶液，用清水冲洗。l已达到规定时间，样品的染色仍不够充分，可适当延长染色时间，以便证已达到规定时间，样品的
18、染色仍不够充分，可适当延长染色时间，以便证实是由于实是由于四唑溶液渗入缓慢引起，还是由于种子本身的缺陷所引起的。四唑溶液渗入缓慢引起，还是由于种子本身的缺陷所引起的。农作物种子四唑染色技术规定农作物种子四唑染色技术规定1/3/202318A（4）鉴定前处理）鉴定前处理第六章 种子生活力测定的原理和方法直接观察，不需处理直接观察，不需处理轻压出胚，观察鉴定轻压出胚，观察鉴定扯开营养组织，暴露出胚扯开营养组织，暴露出胚切去一层营养组织，暴露出胚和活的营养组织切去一层营养组织，暴露出胚和活的营养组织沿胚中轴纵切沿胚中轴纵切沿种子中线纵切沿种子中线纵切剥去半透明的种皮或种子组织剥去半透明的种皮或种子组
19、织剥去种皮和残余营养组织剥去种皮和残余营养组织切去切面碎片或掰开子叶切去切面碎片或掰开子叶乳酸苯酚透明液的应用乳酸苯酚透明液的应用(便于小粒种子观察便于小粒种子观察)1/3/202319A 目标：目标：第六章 种子生活力测定的原理和方法（5）观察鉴定）观察鉴定l计算种子生活力百分率计算种子生活力百分率l按染色程度和组织特性，判断种子活力强弱，并分级按染色程度和组织特性，判断种子活力强弱，并分级l查明种子劣变和生活力丧失的原因查明种子劣变和生活力丧失的原因1/3/202320Al裸眼或在解剖镜下逐个鉴定，分清健壮组织，衰弱裸眼或在解剖镜下逐个鉴定，分清健壮组织，衰弱活组织，衰弱死组织和死亡组织并
20、综合判断种子活活组织，衰弱死组织和死亡组织并综合判断种子活力力第六章 种子生活力测定的原理和方法 鉴定：鉴定：（5）观察鉴定）观察鉴定1/3/202321A l凡是胚的主要构造及有关活营养组织染成有光泽的鲜红色，且凡是胚的主要构造及有关活营养组织染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有活力种子组织状态正常的，为有活力种子l凡是胚的主要构造局部不染色或染色成异常的颜色和光泽，并凡是胚的主要构造局部不染色或染色成异常的颜色和光泽，并且活营养组织不染成部分已超过二分之一，或超过允许范围且活营养组织不染成部分已超过二分之一，或超过允许范围且组织软化的，为不正常种子且组织软化的，为不正常种子l凡完全不
21、染色或染色成无光泽的淡红色或灰白色，且组织已腐凡完全不染色或染色成无光泽的淡红色或灰白色，且组织已腐化、虫蛀、损伤、腐烂的，为死种子。化、虫蛀、损伤、腐烂的，为死种子。l各种植物的种子活力判别标准参照种子检验规程。各种植物的种子活力判别标准参照种子检验规程。第六章 种子生活力测定的原理和方法一般的鉴定原则：一般的鉴定原则：1/3/202322Al水水稻稻：凡凡是是胚胚的的主主要要构构造造染染成成正正常常鲜鲜红红色色，或或胚胚根根尖尖端端2/32/3不不染染色色而而其其他他部部分分正正常常染染色色的的种种子子为为有有生生活活力力种种子。子。l大大豆豆：凡凡是是整整个个种种子子染染成成明明亮亮红红
22、色色，或或仅仅胚胚根根尖尖端端1/31/3不不染染色色，或或子子叶叶表表面面有有小小范范围围坏坏死死，或或子子叶叶顶顶端端1/31/3不染色，为有生活力种子。不染色，为有生活力种子。第六章 种子生活力测定的原理和方法1/3/202323A（6）计算和结果表示）计算和结果表示第六章 种子生活力测定的原理和方法l计算各重复有生活力种子百分率，重复间误差不得计算各重复有生活力种子百分率，重复间误差不得超过最大允许误差超过最大允许误差l结果计算到近似整数结果计算到近似整数 生活力测定重复间的最大容许差距生活力测定重复间的最大容许差距1/3/202324A种种子子检检验验结结果果报报告告单单1/3/202325A1/3/202326A1/3/202327A1/3/202328A三、种子生活力的其他测定方法三、种子生活力的其他测定方法l甲烯兰法甲烯兰法l溴麝香草酚兰法（溴麝香草酚兰法（BTB法）法）l红墨水染色法红墨水染色法l软软射线造影技术射线造影技术第六章 种子生活力测定的原理和方法1/3/202329A