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1、微生物学课程微生物学课程微生物学课程微生物学课程绪论与常规实验技术绪论与常规实验技术一、什么是微生物一、什么是微生物v定义：微生物是所有形体微小形体微小、单细胞单细胞或结构较为简结构较为简单单的多细胞多细胞生物、甚至没有细胞结构没有细胞结构的生物的通称。v种类：微生物类群十分庞杂，包括：v无细胞结构的病毒、类病毒、拟病毒病毒、类病毒、拟病毒等等，v属于原核生物的细菌细菌、放线菌、立克次氏体、衣放线菌、立克次氏体、衣原体原体等等，v属于真核生物的酵母菌酵母菌和霉菌霉菌，单细胞藻类单细胞藻类、原原生动物生动物等。二，微生物和人类的关系有益的方面。1，在食品生产中应用广泛。如：面包，奶酪，酸奶，各种
2、酒类，柠檬酸等食品添加剂，各种氨基酸，各种维生素，酱醋腐乳泡菜等副食品 2，在医药方面应用广泛。如：青霉素等抗生素的生产，疫苗，胰岛素等药品的生产。3，工业方面的应用。如：洗衣粉，皮革，丙酮等化工原料生产。4，能源方面的应用。如：沼气，生物乙醇，氢气。5，环保方面的应用。污水处理，重金属吸收，有毒化学品的降解。此外，微生物还能应用于采矿，农牧，冶金等许多行业。对人有害方面：致病微生物致病微生物：1347年，鼠疫耶森氏菌引起的瘟疫使整个欧洲死亡约1/3的人口大约2500万人。整个人类历史，据统计约2亿人死于鼠疫。其他如SARS、肺结核、疟疾、霍乱、AIDS、flu 生化武器生化武器 三、微生物学
3、及其分科微生物学微生物学是在分子、细胞或群体水平上研究微生物的形态结构、生长繁殖、生理代谢、遗传异、生态分布和分类进化等 生命活动的基本规律，并将其应用于工业发酵、医学卫生和生物工程等领域的科学。微生物学分科微生物学分科：按基本问题分：普通微生物学、微生物分类学、微生物生理学、微生物生态学、微生物遗传学等。按研究对象分：细菌学、真菌学、病毒学、噬菌体学等。按应用领域分：工业、农业、医学、食品、石油、土壤、海洋、环境、发酵微生物学等等四，微生物的发现及微生物学的发展史前时期人类对微生物的认识与利用微生物学初创时期微生物形态认识时期微生物学奠基时期微生物生理学发展时期微生物学发展时期微生物生物化学
4、发展时期微生物学成熟时期微生物分子生物学发展时期1.史前期 史前期是指人类还未见到微生物个体尤其是细菌细胞前的一段漫长的历史时期，大约在距今8000年1676年间。开创者：各国劳动人民，其中尤以我国的制曲、酿酒技术蓍称。特点：未见细菌等微生物个体；凭实践经验利用微生物的有益活动（酿酒、制酱、酿醋、沤肥、轮作、治病）。微生物学的初创期（16761861）列文虎克(AntonyvanLeeuwenhoek）奠基期奠基期时 间：18611897开创者：Pasteur和Koch特 点：建立了一系列研究微生物所必要的独特方法；借助于良好的研究方法，开创了寻找病原微 生物的“黄金时期”；把微生物的研究从形
5、态描述推进到生理学研 究的新水平；微生物学以独立的学科形式开始形成。贡献：A 彻底否定了“自生说”学说B 免疫学预防接种C 证实发酵是由微生物引起的D 其他贡献：巴斯德消毒法等。巴斯德(LouisPasteur)贡献：A 彻底否定了“自生说”学说“曲颈瓶”实验B 免疫学预防接种RobertKoch（柯赫）是微生物学的奠基人，德国人，细菌学家。A微生物学基本操作技术方面的贡献B对病原细菌的研究作出了突出的贡献：a）细菌纯培养方法的建立土豆切面 营养明胶 营养琼脂（平皿）A 微生物学基本操作技术方面的贡献b）设计了各种培养基，实现了在实验室内对各种微 生物的培养c）蒸汽灭菌d）染色观察和显微摄影B
6、 对病原细菌的研究作出了突出的贡献：a）具体证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌；b）发现了肺结核病的病原菌；（1905年获诺贝尔奖）c）证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则 著名的柯赫原则1在每一病例中都出现这种微生物；2要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来；3用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生；4从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。柯赫法则时 间：18971953开创者：Buchner特 点：进入微生物生化水平的研究；应用微生物的分支学科更为扩大，出现了抗生素等学科；开始寻找各种有益微生物代谢产物；普通微生物学开始形成；各相关学科和技术方
7、法相互渗透，相互促进，加速了微生物学的发展。发展期发展期 时 间：1953至今开创者：Watson 和Crick特 点：微 生 物 学 从 一 门 在 生 命 科 学 中 较 为 孤 立 的以应用为主的学科，成为一门十分热门的前沿基础学科；在 基 础 学 理 论 的 研 究 方 面，逐 步 进 入 到 分子水平的研究，微生物迅速成为分子生物学研究中的最主要的对象；在 应 用 研 究 方 面，向 着 更 自 觉、更 有 效 和可人为控制的方向发展。成熟期成熟期六，六，2121世纪微生物学的发展趋势世纪微生物学的发展趋势1，微生物基因组学研究将全面开展。2，与环境密切相关的微生物学研究将长足发展。
8、3，多学科交差趋势增强。4，微生物的应用将更加广泛。五，微生物的特点及其应用1 1、体积小，面积大、体积小，面积大 2 2、吸收多，转化快、吸收多，转化快3 3、生长旺，繁殖快、生长旺，繁殖快4 4、分布广，种类多、分布广，种类多5 5、适应性强，易变异、适应性强，易变异病毒0.2m杆状细菌0.52.0m支原体立克次氏体衣原体0.20.5m放线菌菌丝直径霉菌菌丝直径210m酵母15530m1.体积小、面积大1.体积小、面积大比面=面积/体积乳酸杆菌120,000豌豆6.0鸡蛋1.5体重200磅的人0.322吸收多，转化快吸收多，转化快3克地鼠每天消耗与体重等重的粮食；1克闪绿蜂鸟每天消耗两倍于
9、体重的粮食；大肠杆菌每小时消耗2000倍于体重的糖。；发酵乳糖的细菌在1小时内就可以分解相当于其自身重量1,00010,000倍的乳糖，产生乳酸；1公斤酵母菌体，在一天内可发酵几千公斤的糖，生成酒精；33生长旺，繁殖快生长旺，繁殖快例如：Escherichia coli(大肠杆菌)在最适的生长条件下，每12.520分钟细胞就能分裂一次。在液体培养基中，细菌细胞的浓度一般为108109个/ml。利用微生物的这一特性就可以:实现发酵工业的短周期、高效率生产。例如生产鲜酵母时，几乎12小时就可以收获一次，每年可以收获数百次。谷氨酸短杆菌：摇瓶种子50吨发酵罐：52小时内细胞数目可增加亿倍。表13若干
10、微生物的代时及每日增殖率微生物名称代时每日分裂次数温度每日增殖率乳酸菌38分38252.71011大肠杆菌18分80371.21024根瘤菌110分13258.2103枯草杆菌31分46307.01013光合细菌144分10301.0103酿酒酵母120分12304.1103小球藻7小时3.42510.6念珠藻*23小时1.04252.1硅藻17小时1.4202.64草履虫10.4小时2.3264.92*为念珠蓝菌属(Nostoc)的旧称，与细菌同属原核生物。112（348）=2144=848=2.21043个个E.coli=2.21031克（克（1克克=1012个个E.coli）=2.210
11、25吨吨 （地球（地球=5.51021吨）吨）=4000个地球的重量！个地球的重量！问题：E.coli在条件适宜的情况下可以达到20分钟一代。那么请大家估计一下，一个E.coli经过48小时后产生的E.coli的重量会有多重？4.4.种类多、分布广种类多、分布广分布广：如分布广：如:万米深海、万米深海、8585公里高空、公里高空、地地层下下128128米米和和427427米米 沉沉积岩中都岩中都发现有微生物存在。有微生物存在。类型型 低限低限 倾向种数向种数 高限高限 病毒与立克次氏体病毒与立克次氏体 1,217 1,217 1,217 支原体支原体 42 42 42 细菌与放菌与放线菌菌 1
12、,000 1,500 1,500 蓝细菌菌 1,227 1,500 1,500 藻藻类 15,051 23,100 23,100 真菌真菌 37,175 47,300 68,939 原生原生动物物 24,068 24,068 30,000 总数数 79,780 98,727 127,298微生物的种数，据微生物的种数，据1972年：年：更重要的是在于微生物的生理代谢类型多、代谢产物种类多。更重要的是在于微生物的生理代谢类型多、代谢产物种类多。答案：答案：A：十几亿几十亿个B：流感患者一声咳嗽，可散播约有10万个病菌；一个喷嚏约含有100万个病菌。C：4万个左右日常生活中的微生物数字A、1克肥沃
13、的土壤中微生物的数目？B、一个流感病人一声咳嗽，一个喷嚏会有多少个病菌？C、手皮肤平均每平方厘米大致会多少个微生物？5.5.易变异、适应强易变异、适应强任何有其它生物生存的环境中，都能找到微生任何有其它生物生存的环境中，都能找到微生物。而在其它生物不可能生存的极端环境中也有物。而在其它生物不可能生存的极端环境中也有微生物存在。微生物存在。突突变频率一般率一般为10-510-10，但因繁殖快，但因繁殖快，数量多，与外界数量多，与外界环境直接接触，因而在短境直接接触，因而在短时间内可出内可出现大量大量变异的后代。异的后代。青霉素产量变异、耐药性变异举例青霉素产量变异、耐药性变异举例例如，青霉素生产
14、菌例如，青霉素生产菌 Penicillium chrysogenum(产黄青霉产黄青霉)的产量的产量1943年年为每毫升发酵液中含为每毫升发酵液中含20单位青霉素，单位青霉素，40多年来，经过世界各国微生物遗多年来，经过世界各国微生物遗传育种工作者的不懈努力使该菌产量变异逐渐积累，加上发酵条件的改传育种工作者的不懈努力使该菌产量变异逐渐积累，加上发酵条件的改进，目前世界上先进国家的发酵水平每毫升已超过进，目前世界上先进国家的发酵水平每毫升已超过5万单位，甚至接近万单位，甚至接近10万单位。微生物的数量性状变异和育种使产量提高的幅度之大，是动万单位。微生物的数量性状变异和育种使产量提高的幅度之大
15、，是动植物育种工作中绝对不可能达到的。正因为如此，几乎所有微生物发酵植物育种工作中绝对不可能达到的。正因为如此，几乎所有微生物发酵工厂都十分重视菌种选育工作。工厂都十分重视菌种选育工作。第一章：微生物的分离和纯培养第一章：微生物的分离和纯培养微生物培养的常用器具微生物培养的常用器具Test tube(试管)Culture dish/Petri dish(培养皿）Shake Flask（三角瓶)FermentorLab scale fermentorFermentorIndustrial Scale fermentor接种操作无菌箱或无菌室内操作 用固体培养基获得纯培养常见固体培养基常见固体培养
16、基涂布平板法涂布平板法稀释倒板法稀释倒板法平板划线法平板划线法用液体培养基获得纯培养用液体培养基获得纯培养对于不能在固体培养基上生长的微生物，有一部对于不能在固体培养基上生长的微生物，有一部分可以用液体培养基稀释法获得纯培养。分可以用液体培养基稀释法获得纯培养。单细胞（孢子）分离单细胞（孢子）分离稀释法有个重要的缺点，它只能分离样品稀释法有个重要的缺点，它只能分离样品中占优势的菌种。中占优势的菌种。采用显微分离法从混杂群体中直接分离单采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞进行培养，这种获得纯培养的方法个细胞进行培养，这种获得纯培养的方法称为单细胞分离法。称为单细胞分离法。选择培养选择培养1
17、 1，采用选择性平板。，采用选择性平板。2 2，富集培养。，富集培养。菌种的保藏菌种的保藏1、菌种保藏的原理、菌种保藏的原理 首先要挑选典型菌种的优良纯种首先要挑选典型菌种的优良纯种,最好采用它最好采用它们的休们的休 眠体眠体(如分生孢子、芽孢等如分生孢子、芽孢等);其次其次,创造创造一个最有利休眠的环境条件一个最有利休眠的环境条件,如干燥、低温、缺如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂等。氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂等。2、菌种保藏方法、菌种保藏方法1）斜面菌种低温保藏法）斜面菌种低温保藏法-利用低温对微生利用低温对微生物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。物生命活动有抑制作用的
18、原理进行保藏。把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液等等,直接放入直接放入45冰箱中。保藏时间一冰箱中。保藏时间一般不超过般不超过3个月个月,到时必须进行移接传代到时必须进行移接传代,再放回冰箱。再放回冰箱。2 2）砂土管保藏法）砂土管保藏法-将干燥砂粒与细土混合后灭将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管菌制成砂土管,然后接种保藏然后接种保藏 。若把砂土管放。若把砂土管放在低温或抽气后密封在低温或抽气后密封,效果更佳。此法适用于产效果更佳。此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。保藏期孢子及芽孢菌种的保藏。保藏期1 11010年年3 3）石蜡油封藏法）石蜡油封藏法-向培养
19、好的菌种斜面上向培养好的菌种斜面上,加入加入灭菌石蜡油灭菌石蜡油,高出斜面高出斜面1cm,1cm,然后蜡封管口然后蜡封管口,放入放入冰箱。该法既可防止培养基水分蒸发冰箱。该法既可防止培养基水分蒸发,又能使菌又能使菌种与空气隔绝。保藏期种与空气隔绝。保藏期1 12 2年年 4）真空冷冻干燥法）真空冷冻干燥法-是目前较理想的一种方法。是目前较理想的一种方法。在低于在低于-15下下,快速将细胞冻结快速将细胞冻结,并保持细胞完并保持细胞完整整,然后在真空中使水分升华致干。在此环境中然后在真空中使水分升华致干。在此环境中,微生物的生长和代谢都暂时停止微生物的生长和代谢都暂时停止,不易发生变异不易发生变异
20、,故可长时间保存故可长时间保存,一般为一般为510年年,最多可达最多可达15年之久。此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面年之久。此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面条件条件,使微生物可以保存较长时间使微生物可以保存较长时间,但手续较麻烦但手续较麻烦,需要一定的设备。需要一定的设备。3 3、菌种保藏中心、菌种保藏中心我国由于我国由于19791979年年7 7月成立了中国微生物菌种保藏月成立了中国微生物菌种保藏管理委员会管理委员会(CCCCM),(CCCCM),-普通微生物菌种保藏管理中心普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)-(CCGMC)-中科院微生物所中科院微生物所,北北京京(AS),(AS),真
21、菌、细菌真菌、细菌;中科院武汉病毒研究所中科院武汉病毒研究所,武汉武汉(AS-IV),(AS-IV),病病毒。毒。-农业微生物菌种保藏管理中心农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)-(ACCC)-中国农业科学院土中国农业科学院土壤肥料研究所壤肥料研究所,北京北京(ISF)(ISF)。-工业微生物菌种保藏管理中心工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)-(CICC)-轻工业部轻工业部美国的美国的“美国典型菌种收藏所美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏方，保藏方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。显微镜和显微技术显微镜和显微技术1.1.决定显微观察效果的因素
22、：放大倍数，分辨率和反差。决定显微观察效果的因素：放大倍数，分辨率和反差。2.2.分辨率是辨别两点间最小距离的能力。分辨率是辨别两点间最小距离的能力。3.3.反差是样品区别于背景的程度。反差是样品区别于背景的程度。普通光学显微镜普通光学显微镜由于肉眼的正常由于肉眼的正常分辨率为分辨率为0.25mm左右，左右，因此光学显微镜因此光学显微镜的有效放大倍数的有效放大倍数只能达到只能达到1000-1500倍。倍。暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜光穿过标本时，光穿过标本时，由于标本各部分由于标本各部分的折射率和厚度的折射率和厚度不同，加快和滞不同，加快和滞后的光波产生相后的光波产生相位差。利
23、用特殊位差。利用特殊光学装置光学装置环环状光阑和相差板，状光阑和相差板，可以将产生的相可以将产生的相位差转换为人眼位差转换为人眼可以观察的振幅可以观察的振幅差。差。荧光显微镜荧光显微镜透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微镜显微观察样品的制备显微观察样品的制备1.1.光学显微镜样品的制备光学显微镜样品的制备活体观察。活体观察。压滴法，悬滴法，菌丝埋片法。压滴法，悬滴法，菌丝埋片法。染色观察。染色观察。悬滴法悬滴法2,2,电子显微镜样品制备电子显微镜样品制备 生物样品电镜观察前，必须进行固定和干燥，否则镜筒中的高真空会导致其严重脱水，结构变形。此外，由于构成生物样品的元素对电子的
24、散射和吸收能力较弱，样品一般需用重金属盐染色和喷镀，以提高其反差。显微镜下的生物显微镜下的生物代表性细菌代表性细菌单球菌：细胞分裂沿一个平面进行，新个体分散而单独存在.如尿素微球菌(Micrococcus ureae)双球菌：细胞沿一个平面分裂，新个体成对排列.如肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)链球菌：细胞沿一个平面进行分裂，新个体不但可保持成对的样子，并可连成链状.如：乳链球菌 （Streptococcus lactis）无乳链球菌（Streptococcus agalactiae)溶血链球菌（Streptococcus hemolyticus)四联球菌：细胞分裂是
25、沿两个相垂直的平面进行，分裂后每四个细胞特征性地连在一起，呈田字形.如四联微球菌 （Micrococcus tetragenus）八叠球菌：细胞按三个互相垂直的平面进行分裂后，每八个球菌特征性地连在一起成立方体形.如藤黄八叠球菌（Sarcina ureae)葡萄球菌：细胞无定向分裂，多个新个体形成一个不规则的群体，犹如一串葡萄。如：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)白色葡萄球菌（Staphylcoccus albus)杆菌杆菌(bacillus)及其排列状态及其排列状态杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状等；按杆菌细胞繁殖后的排列方式则有链状、栅状、“八”字状等。短杆菌长杆菌梭状芽孢杆菌放线菌放线菌古细菌古细菌霉菌霉菌毛霉毛霉根霉根霉曲霉曲霉青霉青霉霉霉 菌菌 菌菌 丝丝 图图酵酵 母母 菌菌 菌菌 落落 图图