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1、第十五章第十五章基因技术基因技术哈尔滨医科大学生物化学哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学与分子生物学教研室教研室 高旭高旭 刘兴汉刘兴汉 1 基因工程基因工程 2 分子杂交分子杂交 3 聚合酶链反应聚合酶链反应 4 DNA序列测定序列测定 5 转基因动物转基因动物 6 基因剔除技术基因剔除技术 7 克隆动物克隆动物 8 基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗 基因操作技术基因操作技术 第一节第一节 基因工程基因工程 （Geneticengineering）一、基因工程的基本概念一、基因工程的基本概念（一）重组重组DNA技术的基本定义技术的基本定义（二）基因工程的基本定义基因工程的基本定义（三）克
2、隆的定义克隆的定义 （一）重组（一）重组DNA技术技术 （recombinantDNAtechnology）是指在体外按人们的意愿将不同的是指在体外按人们的意愿将不同的 DNA分子重组的技术。分子重组的技术。是指利用重组是指利用重组DNA技术将目的基因技术将目的基因 和载体重组，再导入受体细胞内进行扩和载体重组，再导入受体细胞内进行扩 增和表达的过程。增和表达的过程。（二）基因工程（二）基因工程 (Geneticengineering)是指通过无性繁殖过程所产生的是指通过无性繁殖过程所产生的 与亲代完全相同的子代群体。与亲代完全相同的子代群体。基因工程相当于目的基因的无性基因工程相当于目的基因
3、的无性 繁殖过程，也称其为基因克隆繁殖过程，也称其为基因克隆 (genecloning)。（三）克隆（三）克隆 （clone）(一)工具酶工具酶 (二)载载 体体 二、基因工程操作中常用的工具二、基因工程操作中常用的工具（一）工具酶（一）工具酶1 限制性内切酶限制性内切酶2 TDNA连接酶连接酶3 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶4 逆转录酶逆转录酶5 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶6 碱性磷酸酶碱性磷酸酶7 末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶1 1限制性内切限制性内切酶酶(restrictionendonuclease)定义定义:一类能识别和切割双链一类能识别和切割双链DNA 分子中特
4、定碱基序列的核酸水分子中特定碱基序列的核酸水解解酶。酶。分类分类:、作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身保护自身DNA。命命 名名：第一个字母代表细菌的属名，用大写；第一个字母代表细菌的属名，用大写；第二、三个字母是该细菌种名，用小写；第二、三个字母是该细菌种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。EcoRE=Eschrichia属属 co=coli种种 R=RY13菌株菌株=发现的第一个限制酶发现的第一个限制酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸
5、酶 型限制酶识别序列特点型限制酶识别序列特点回文结构回文结构ll3 C G A3 C G A C T T A A GC T T A A G C T C 5C T C 5ll5 G C T5 G C T G A A T T CG A A T T C G A G 3G A G 3EcoR的切割位点的切割位点EcoR的识别序列的识别序列 EcoRHpa GAATTCGTTAACCTTAAGCAATTG GCTTAA 粘端切口 平端切口 +AATTCGGTTCAA+AACTTG切口切口：粘性切口和平端切口粘性切口和平端切口2.其他相关酶类其他相关酶类lTDNA连接酶连接酶用于互补粘性末端和用于互补粘性
6、末端和平端平端DNA分子之间的连接。分子之间的连接。l大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶具有具有53的聚合的聚合作用，作用，53外切作用和外切作用和35的外切作用。的外切作用。l逆转录酶逆转录酶是以是以mRNA为模板合成互补为模板合成互补DNA即即cDNA，用于组建，用于组建cDNA基因文库。基因文库。lT多核苷酸激酶多核苷酸激酶能催化能催化ATP的的-磷酸磷酸转移到转移到DNA或或RNA的的5端羟基上。端羟基上。l碱性磷酸酶碱性磷酸酶简称简称AKP，此酶能特异的切除，此酶能特异的切除DNA或或RNA5端的磷酸产生端的磷酸产生5端羟基以端羟基以防止载体的自身连接。防止载体的自身连接。l末端脱氧
7、核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶能催化单核苷酸转能催化单核苷酸转移到移到DNA的的3端的羟基上。端的羟基上。（二）（二）载体载体 是携带目的是携带目的DNA片段进入受体片段进入受体 细胞进行扩增和表达的工具。细胞进行扩增和表达的工具。常用载体：常用载体：质粒质粒 噬菌体噬菌体 粘粒粘粒 病毒病毒 1.质粒质粒（plasmid）特点：特点：能在宿主细胞内独立复制，能在宿主细胞内独立复制，带有某些遗传信息，会赋予宿主带有某些遗传信息，会赋予宿主 细胞一些遗传性状。细胞一些遗传性状。定义：定义：是染色体外能自我复制的是染色体外能自我复制的 双链环状小分子双链环状小分子DNA。pUC19质质粒的物理图
8、谱粒的物理图谱pBR322质粒质粒基因工程中使用的质粒具备的特点基因工程中使用的质粒具备的特点l质粒的复制型质粒的复制型分为松弛型和严谨型两类。分为松弛型和严谨型两类。l质粒的不相容性质粒的不相容性作为载体的质粒一般是不相容的。作为载体的质粒一般是不相容的。l质粒的接合性质粒的接合性用作载体的质粒都是非接合性质粒。用作载体的质粒都是非接合性质粒。l多克隆位点多克隆位点即多种限制性内切酶的单一识别序列。即多种限制性内切酶的单一识别序列。l筛选标记筛选标记常用双抗生素抗性插入失活筛选标记和常用双抗生素抗性插入失活筛选标记和蓝白菌落筛选标记。蓝白菌落筛选标记。头部 尾尾部纤维 蛋白衣壳 2.噬菌体噬
9、菌体（bacteriophage,phage）3.粘粒粘粒(cosmid)：由由噬菌体的噬菌体的cos区与区与pBR322质粒质粒组合的杂种载体。粘粒可克隆组合的杂种载体。粘粒可克隆29-45kb的大片段，常用作建立真核基的大片段，常用作建立真核基因组文库的载体。因组文库的载体。4.病毒病毒（virus）病毒载体更多用于真核表达病毒载体更多用于真核表达系统，如腺病毒，腺病毒相关病系统，如腺病毒，腺病毒相关病毒、痘病毒，逆转录病毒，猴空毒、痘病毒，逆转录病毒，猴空泡病毒等。泡病毒等。三三、基因工程的操作过程、基因工程的操作过程（一）目的基因的获得（一）目的基因的获得（二）目的基因与载体的连接（二
10、）目的基因与载体的连接（三）重组体导入受体细胞（三）重组体导入受体细胞（四）基因工程菌的筛选（四）基因工程菌的筛选（五）外源基因的表达（五）外源基因的表达（一）（一）目的基因的获得目的基因的获得3.人工合成法人工合成法 要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物 的氨基酸序列1.构建基因组构建基因组DNADNA文库文库基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)2.构建构建cDNAcDNA文库文库 cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应聚合酶链反应 (polymerasechainreaction,PCR)将某种生物的基因组将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，切割
11、成一定大小的片段，分别与适合的载体重组后导入宿主细胞，这些重组分别与适合的载体重组后导入宿主细胞，这些重组分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列。分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列。这种通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中的各种这种通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中的各种DNA重组分子的集合体称为基因组重组分子的集合体称为基因组DNA文库。文库。基因组基因组DNA文库文库(genomicDNAlibrary)构建基因组构建基因组DNA文库的过程文库的过程（二）目的基因与载体的连接（二）目的基因与载体的连接1.1.同源粘性末端连接同源粘性末端连接 2.2.平端连接平端连接 3.
12、3.定向连接定向连接 1.同源粘性末端连接同源粘性末端连接 方式：同一限制酶切割位点连接配伍末方式：同一限制酶切割位点连接配伍末端连接端连接2.平端连接平端连接适用于：限制性内切酶产生的平端切割适用于：限制性内切酶产生的平端切割粘性未端或切平形成的平端粘性未端或切平形成的平端3.定向连接定向连接 适用于：两种不同的粘性末端适用于：两种不同的粘性末端一个粘端，一个平端一个粘端，一个平端目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接（三）重组体导入受体细胞（三）重组体导入受体细胞1.受体菌的条件：受体菌的条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷 处于感受态处于感受态2.导入方式：
13、导入方式：转化转化(transformation)转染转染(transfection)转导转导(transduction)（四）基因工程菌的筛选（四）基因工程菌的筛选1.抗药性标记选择抗药性标记选择2.标志补救标志补救 ：互补互补3.分子杂交法：分子杂交法：原位杂交原位杂交 Southern印迹印迹4.免疫学方法免疫学方法:如免疫化学方法如免疫化学方法 酶免检测法酶免检测法pBR322质粒质粒双抗生素抗性双抗生素抗性1.抗药性标记选择抗药性标记选择bla=氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因Ori=复制起始点复制起始点lacZ=-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端编码序列端编码序列质粒质粒pUC18-蓝
14、白菌落筛选标记蓝白菌落筛选标记2.标志补救标志补救：互补互补 z平皿上的单菌落复印硝酸纤维膜 溶菌DNA变性固定杂交菌落原位杂交菌落原位杂交 继续培养3.分子杂交法分子杂交法：（五）外源基因的表达（五）外源基因的表达1.原核表达体系原核表达体系-大肠杆菌大肠杆菌 标准：标准：复制子，复制子，筛选标志，多克隆位点筛选标志，多克隆位点 强启动子强启动子,SD序列，终止子。序列，终止子。不足：不宜表达真核基因组不足：不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 很难表达大量可浴性蛋白很难表达大量可浴性蛋白 2
15、.真核表达体系真核表达体系优点：优点：重组质粒转染的细胞具有遗传的稳定性和可重复性重组质粒转染的细胞具有遗传的稳定性和可重复性 哺乳动物细胞能对外源基因转录的哺乳动物细胞能对外源基因转录的hnRNA剪切加工剪切加工 成成熟的成成熟的mRNA 对表达的蛋白质能进行转录后的加工如糖基化对表达的蛋白质能进行转录后的加工如糖基化 可将表达产物分泌到培养基中方便下游的提纯可将表达产物分泌到培养基中方便下游的提纯缺点：缺点：操作技术难操作技术难费时费时不经济不经济基基因因工工程程的的操操作作过过程程第二节第二节 核酸核酸分子杂交分子杂交（nucleic acidhybridization）RNADNA复性
16、复性 以以DNA的变性和复性为理论基础。分子杂交是不的变性和复性为理论基础。分子杂交是不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合双链的过程。同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合双链的过程。核酸分子杂交：核酸分子杂交：分子杂交的目的：检测分子杂交的目的：检测DNA和和RNA一、一、核酸探针核酸探针（probe）是分子杂交的技术基础，它是一段与被检测是分子杂交的技术基础，它是一段与被检测的核酸序列互补的带有标记的核苷酸片段，长度的核酸序列互补的带有标记的核苷酸片段，长度一般为十几到几千个碱基不等。一般为十几到几千个碱基不等。碱基对间氢键碱基对间氢键探针探针待测待测DNA或或RNA核酸分子与探针杂交核酸
17、分子与探针杂交探针标记方法探针标记方法（一）（一）放射性同位素标记放射性同位素标记（二）（二）光敏生物素标记光敏生物素标记（三）（三）地高辛标记物地高辛标记物（四）（四）分子信标分子信标（一）同位素探针：同位素探针：32P:常用，灵敏度高，半衰期短，穿透力强常用，灵敏度高，半衰期短，穿透力强 3H：分辨力高，半衰期长，适合原位杂交：分辨力高，半衰期长，适合原位杂交 35S:标记蛋白，也可用标记蛋白，也可用S取代磷酸中的取代磷酸中的O杂交后通过放射自显影检测杂交后通过放射自显影检测(二)光敏物质光敏物质光敏物质光敏物质生物素生物素冷光冷光GATTCAGGC链酶亲和素链酶亲和素酶标抗体酶标抗体dN
18、TP生物素生物素Bio-16-dUTPBio-7-dATPBio-11dCTPBio-11-dUTP替代替代dNTP酶促生物素酶促生物素（三）酶促生物素（三）酶促生物素（三）地高辛（三）地高辛 地高辛地高辛CCCCCCCCCCCdUTP抗体抗体酶标抗体酶标抗体（四）（四）分子信标：荧光标记分子信标：荧光标记淬灭剂淬灭剂荧光荧光53二、分子杂交的方法二、分子杂交的方法（一）斑点杂交（一）斑点杂交(dotblothybridization)（二）原位杂交（二）原位杂交(insituhybridization)（三）转移印迹技术（三）转移印迹技术 提取提取DNA或或RNA，直接点在硝酸纤维素，直接点
19、在硝酸纤维素膜上，和探针杂交膜上，和探针杂交检查有没有目的检查有没有目的DNA或或RNA。硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜待测待测DNA或或RNA杂交液杂交液探针探针1234（一）斑点杂交：（一）斑点杂交：SlotblotDotblotDNA点阵点阵:将多种探针序列成排的点在硝酸纤维素膜上，将多种探针序列成排的点在硝酸纤维素膜上，检测检测DNADNA或或RNARNA和那一个探针杂交。和那一个探针杂交。待检样品进行标记待检样品进行标记 一种样品多种探针一种样品多种探针多种探针序列多种探针序列标记待测核酸标记待测核酸基因芯片：基因芯片：将更多的探针排列在硅片上，借助计算机检测将更多的探针排列在硅片上，借助
20、计算机检测未知的未知的DNA或或RNA和哪一个探针杂交。和哪一个探针杂交。基因芯片基因芯片（二）原位杂交（二）原位杂交 1.组织切片或细胞涂片原位杂交：组织切片或细胞涂片原位杂交：将将DNA或或RNA在组织切片和细胞涂片中变性在组织切片和细胞涂片中变性和固定，和探针杂交，确定和固定，和探针杂交，确定DNA或或RNA在组织和在组织和细胞中的定位。细胞中的定位。2.菌落或噬菌斑原位杂交：菌落或噬菌斑原位杂交：基因工程中筛选阳性克隆。基因工程中筛选阳性克隆。覆盖覆盖滤膜滤膜取下沾取下沾有有菌落菌落的滤膜的滤膜裂解、裂解、变性、变性、固定等固定等与与探针探针杂交杂交放射性放射性自显影自显影123456
21、3和和5是阳性克隆是阳性克隆菌落原位杂交示意图菌落原位杂交示意图3.转移印迹技术：转移印迹技术：先用电泳将先用电泳将DNA或或RNA条带分开，再转移条带分开，再转移到硝酸纤维素膜上，与探针杂交，鉴定待测到硝酸纤维素膜上，与探针杂交，鉴定待测DNA或或RNA。lSouthernblotting:检测检测DNAlNorthernblotting:检测检测RNAlWesternblotting:检测蛋白质，因要用抗体检测蛋白质，因要用抗体检测，也叫免疫印迹（检测，也叫免疫印迹（Immunoblotting）在众多样品中哪一个是在众多样品中哪一个是目的目的DNA、RNA或或目标蛋白质。目标蛋白质。三三
22、种种印印迹迹技技术术的的比比较较 Southern印迹杂交印迹杂交(Southernblotting)Northern印迹杂交印迹杂交(Northernblotting)Western印迹杂交印迹杂交(Westernblotting)第三节第三节 聚合酶链反应聚合酶链反应 （PolymeraseChainReaction,PCR）PCR技术是技术是1985年由美国科学家年由美国科学家Mullis建立，荣获建立，荣获1993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。PCR方法被美国方法被美国Science杂志编辑部评为杂志编辑部评为1989年的十大科技成就之一，而年的十大科技成就之一，而TaqDNA聚聚合
23、酶合酶被评选为象征被评选为象征1989年的年的“年分子年分子”(themoleculeofyear)一、一、PCR工作原理工作原理lPCR是一种在体外由引物介导的是一种在体外由引物介导的DNA酶促合酶促合成反应，也叫基因扩增技术，类似体内的成反应，也叫基因扩增技术，类似体内的DNA复制过程。主要是利用复制过程。主要是利用DNA聚合酶依赖聚合酶依赖DNA模板的特性，在一对引物间诱发聚合酶模板的特性，在一对引物间诱发聚合酶反应。反应。lPCR具有特异性强，灵敏度高，操作简便，具有特异性强，灵敏度高，操作简便，对待检材料质量要求低等特点，能够快速扩对待检材料质量要求低等特点，能够快速扩增任何目的基因
24、。增任何目的基因。PCR反应第一次循环反应第一次循环PCR反应第二次循环反应第二次循环二、二、PCR体系的基本成分体系的基本成分1x1xPCR缓冲液缓冲液模板模板DNA g水平，或水平，或10104 4拷贝拷贝特异引物特异引物 各各0.10.10.50.5mol/LTaqDNA聚合酶聚合酶 0.50.52.5 2.5 单位单位dNTP 各各5050200200mol/LMg21.52mol/L三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性95退火Tm-5延伸72（一）（一）DNADNA的微量分析的微量分析 （二）目的基因的克隆（二）目的基因的克隆 （三）测定基因的表达水平（三）测定基因的表达水
25、平 （四）基因的定点突变（四）基因的定点突变四、四、PCR的主要用途的主要用途PCRPCR技术是生命科学领域中的一项革技术是生命科学领域中的一项革命性创举和里程碑。命性创举和里程碑。广泛广泛应用于应用于临床临床医学医学、遗传咨询、司、遗传咨询、司法鉴定、考古、工业、农业及分子生物学法鉴定、考古、工业、农业及分子生物学等各个领域等各个领域 第四节DNA的序列分析(DNAsequenceanalysis)DNA序列分析的基本原理序列分析的基本原理1.双脱氧合成末端终止法双脱氧合成末端终止法(Sanger法法)2.化学修饰法化学修饰法 (Maxam-Gillbert法法)1.双脱氧合成末端终止法测序
26、双脱氧合成末端终止法测序2脱氧核糖脱氧核糖2，3双脱氧核糖双脱氧核糖放射自显影凝胶电泳碱性专一性裂解反应A/GGC/TC5GTCGTAA5GTCGTA5GTCGT5GTCG5GTC5GT5G-+2.化学修饰法测序基本原理化学修饰法测序基本原理 第五节第五节 转基因动物、克隆动物转基因动物、克隆动物 和基因剔除技术和基因剔除技术 (Transgenic,cloneanimalandgeneknockouttechnique)一一、转基因动物、转基因动物将外源基因导入动物的受精卵，将外源基因导入动物的受精卵，再将受精卵植入到代孕动物的再将受精卵植入到代孕动物的输卵管或子宫中培育的动物。输卵管或子宫
27、中培育的动物。（一）转基因小鼠的技术路线（一）转基因小鼠的技术路线通过病毒通过病毒载体导入载体导入ES细胞建细胞建立立成功转入生长激素基因的转基因鼠成功转入生长激素基因的转基因鼠（二）应用（二）应用1.能够创造医学研究需要的动物模型能够创造医学研究需要的动物模型2.改良动物品质改良动物品质3.培育动物新品种培育动物新品种二、克隆动物二、克隆动物 克隆是英语克隆是英语clone的音译，即无性繁殖系。的音译，即无性繁殖系。克隆动物是生物体通过体细胞进行的无性克隆动物是生物体通过体细胞进行的无性繁殖以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的繁殖以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。后代个
28、体组成的种群。1.制备成熟的卵细胞制备成熟的卵细胞2.细胞核移植，将供体细胞的细胞核与细胞核移植，将供体细胞的细胞核与去核的卵细胞融合成一个杂合细胞去核的卵细胞融合成一个杂合细胞3.将将“核质融合核质融合”的卵细胞移植到借腹怀的卵细胞移植到借腹怀孕动物的子宫发育直到出生孕动物的子宫发育直到出生（一）克隆动物技术主要包括三个步骤（一）克隆动物技术主要包括三个步骤 三、基因剔除技术三、基因剔除技术 通过通过DNA定点同源重组，定向地定点同源重组，定向地去除基因组中的某一基因，称为基去除基因组中的某一基因，称为基因敲除（因敲除（geneknockout）或基因剔）或基因剔除。基因剔除技术目前主要在小
29、鼠除。基因剔除技术目前主要在小鼠的胚胎干细胞中进行。的胚胎干细胞中进行。（一）基因剔除的技术路线（一）基因剔除的技术路线1.先将待剔除基因的同源基因片段与质粒载体重组先将待剔除基因的同源基因片段与质粒载体重组2.重组质粒转入小鼠的胚胎干细胞重组质粒转入小鼠的胚胎干细胞(EScell)3.EScell注入胚泡，胚泡植入子宫培育嵌合体小鼠注入胚泡，胚泡植入子宫培育嵌合体小鼠4.嵌合体小鼠与野生型小鼠交配产生嵌合体小鼠，嵌合体小鼠与野生型小鼠交配产生嵌合体小鼠，证明生殖细胞中的基因已被剔除证明生殖细胞中的基因已被剔除5.嵌合体小鼠之间交配，得到基因剔除的纯系小鼠嵌合体小鼠之间交配，得到基因剔除的纯系
30、小鼠（二）基因敲除的基本原理（二）基因敲除的基本原理 第六节第六节 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗(Gene diagnosis and gene therapy)基因诊断基因诊断 是指利用分子生物学和分子遗传学的技是指利用分子生物学和分子遗传学的技 术方法通过直接检测基因结构是否改变、基因术方法通过直接检测基因结构是否改变、基因 表达有否异常，对疾病作出诊断。表达有否异常，对疾病作出诊断。基因诊断的特点基因诊断的特点 1.针对性强针对性强 2.灵敏度高灵敏度高 3.适用范围广适用范围广 4.早期诊断早期诊断 一、基因诊断的常用技术和方法一、基因诊断的常用技术和方法 1.分子杂交分子杂交
31、 2.PCR 3.DNA序列测定序列测定 4.多态性分析多态性分析 (一一)基因突变的诊断方法基因突变的诊断方法 1.点突变的诊断方法点突变的诊断方法 2.插入和丢失片段的诊断方法插入和丢失片段的诊断方法 3.限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析（二）基因表达异常的诊断（二）基因表达异常的诊断 （三）外源基因侵入的诊断三）外源基因侵入的诊断二、某些疾病的基因诊断二、某些疾病的基因诊断 1.遗传性疾病的基因诊断遗传性疾病的基因诊断 2.感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断 3.肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断 4.基因诊断在法医学鉴定中的应用基因诊断在法医学鉴定中的应用 基因治疗基因
32、治疗 早期早期-将通过基因转移技术用正常基因将通过基因转移技术用正常基因 原位置换有缺陷的基因治疗单基原位置换有缺陷的基因治疗单基 因遗传病叫做基因治疗。因遗传病叫做基因治疗。目前目前-广义上来讲广义上来讲,将某种遗传物质转移将某种遗传物质转移 到患者细胞内到患者细胞内,使其在体内发挥作使其在体内发挥作 用用,以达到治疗疾病目的方法，均以达到治疗疾病目的方法，均 称为基因治疗。称为基因治疗。一、基因治疗的基本方法一、基因治疗的基本方法 1.基因矫正基因矫正（genecorrection）2.基因置换（基因置换（genereplacement）3.基因增补基因增补（geneaugmentatio
33、n）4.基因失活基因失活（geneinactivation）常见的几种基因失活方法常见的几种基因失活方法反义核酸反义核酸 核酶核酶 基因剔除技术基因剔除技术二、基因治疗的基本程序二、基因治疗的基本程序治疗基因的选择治疗基因的选择 基因载体的选择基因载体的选择-病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体靶细胞的选择靶细胞的选择-体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞基因转移的方法基因转移的方法-病毒介导病毒介导非病毒介导非病毒介导外源基因表达的检测外源基因表达的检测-利用在体内的标记基因利用在体内的标记基因基因治疗基本原理基因治疗基本原理问 题单单 选选 题题A在分子水平上的操作，在分子水平上表达B在分子水平上
34、操作，回到细胞水平上表达C在细胞水平上操作，在分子水平上表达D在细胞水平上操作，在细胞水平上表达E在细胞水平上操作，在整体水平上表达 1.1.基因工程的特点是基因工程的特点是:2.实验室常用的连接外源性和载体的实验室常用的连接外源性和载体的酶是酶是:ATaq酶酶BT4DNA连接酶连接酶CDNA聚合酶聚合酶IDDNA聚合酶聚合酶IIEDNA聚合酶聚合酶III3.不能用作克隆载体的是不能用作克隆载体的是:A质粒质粒B噬菌体噬菌体DNAC细菌基因组细菌基因组DNAD腺病毒腺病毒E逆转录病毒逆转录病毒 4.用来鉴定蛋白质的技术是用来鉴定蛋白质的技术是:A亲和层析亲和层析BSouthern印迹杂交印迹杂
35、交CNorthern印迹杂交印迹杂交DWestern印迹杂交印迹杂交E离子交换层析离子交换层析5.F因子从一个细胞转移到另一个细胞的基因转移因子从一个细胞转移到另一个细胞的基因转移过程称为过程称为:A转化转化B转导转导C转染转染D转座转座E接合接合6.用来鉴定用来鉴定RNA的技术是的技术是:ANorthern印迹杂交印迹杂交BSouthern印迹杂交印迹杂交CWestern印迹杂交印迹杂交D离子交换层析离子交换层析E亲和层析亲和层析 7.克隆羊多莉的诞生是应用：克隆羊多莉的诞生是应用：A转基因技术转基因技术B核转移技术核转移技术C基因剔除技术基因剔除技术D基因同源重组技术基因同源重组技术E基因
36、克隆技术基因克隆技术8.关于基因工程的叙述错误的是关于基因工程的叙述错误的是:A根据实验目的选择目的基因根据实验目的选择目的基因B选择一个合适的载体选择一个合适的载体C将目的基因和载体分别用限制性内切酶切将目的基因和载体分别用限制性内切酶切DT4连接酶只用于连接目的基因和载体黏性连接酶只用于连接目的基因和载体黏性末端末端E将重组体转化到细胞中的过程不是绝对的将重组体转化到细胞中的过程不是绝对的8.关于基因工程的叙述错误的是关于基因工程的叙述错误的是:A根据实验目的选择目的基因根据实验目的选择目的基因B选择一个合适的载体选择一个合适的载体C将目的基因和载体分别用限制性内切酶切将目的基因和载体分别
37、用限制性内切酶切DT4连接酶只用于连接目的基因和载体黏性连接酶只用于连接目的基因和载体黏性末端末端E将重组体转化到细胞中的过程不是绝对的将重组体转化到细胞中的过程不是绝对的 9.下列哪项不是限制性内切酶的特点？下列哪项不是限制性内切酶的特点？A仅存在原核细胞中仅存在原核细胞中B是一种水解酶是一种水解酶C能识别双链中的特定碱基顺序能识别双链中的特定碱基顺序D具有一定外切酶的活性具有一定外切酶的活性E酶切辨认的碱基顺序一般具有回文结构酶切辨认的碱基顺序一般具有回文结构10.互补筛选法属于：互补筛选法属于：A抗药性标志筛选抗药性标志筛选B酶联免疫筛选酶联免疫筛选C标志补救筛选标志补救筛选D原位杂交筛
38、选原位杂交筛选E免疫化学筛选免疫化学筛选 11.下列哪项不适合作下列哪项不适合作cDNA文库探针文库探针?A基因外显子基因外显子B基因内含子基因内含子CcDNADRNAE寡核苷酸寡核苷酸 12.重组重组DNA技术常用的限制性内切核酸酶为技术常用的限制性内切核酸酶为:A类酶类酶B类酶类酶C类酶类酶D类酶类酶E类酶类酶13.下列哪种染料不是核酸电泳的染色剂下列哪种染料不是核酸电泳的染色剂?A溴乙锭溴乙锭B银试剂银试剂C考马斯亮蓝考马斯亮蓝D丫啶橙丫啶橙E亚甲蓝亚甲蓝 14.重组的连接方式不包括：重组的连接方式不包括：A粘性末端连接粘性末端连接B平头末端连接平头末端连接C粘性末端与平头末端连接粘性末
39、端与平头末端连接DDNA连接子技术连接子技术EDNA适配子技术适配子技术15.可识别并切割特异序列的称为可识别并切割特异序列的称为A限制性核酸外切酶限制性核酸外切酶B限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶CDNA酶酶D非限制性核酸外切酶非限制性核酸外切酶E非限制性核酸内切酶非限制性核酸内切酶16.下列哪项不是限制性内切酶的作用特点下列哪项不是限制性内切酶的作用特点?A特异性很高特异性很高B常由个核苷酸组成常由个核苷酸组成C限制性内切酶识别的位点一般具有回文结构限制性内切酶识别的位点一般具有回文结构D少数内切酶的识别位点中的碱基可以有规律少数内切酶的识别位点中的碱基可以有规律 地替换地替换E限制性内切
40、酶的切口均为粘性末端限制性内切酶的切口均为粘性末端 17.下列哪种条件不适合用于核酸的分离提取下列哪种条件不适合用于核酸的分离提取?ADNA溶液的溶液的pH值是值是410B因所有溶液内均含有因所有溶液内均含有EDTA，故实验所用的器，故实验所用的器 皿和溶液不需灭菌处理皿和溶液不需灭菌处理C避免强烈高速的振荡避免强烈高速的振荡D尽量简化操作步骤尽量简化操作步骤E避免将细胞突然置于低渗溶液中避免将细胞突然置于低渗溶液中18.在重组技术中催化形成重组在重组技术中催化形成重组分子的是分子的是:A DNA聚合酶聚合酶B DNA解链酶解链酶C DNA连接酶连接酶D 拓扑酶拓扑酶E DNA内切酶内切酶19
41、.基因重组不包括基因重组不包括:A转化转化B转换转换C整合整合D转导转导E转位转位20.20.关于原位杂交的叙述，正确的是：关于原位杂交的叙述，正确的是：关于原位杂交的叙述，正确的是：关于原位杂交的叙述，正确的是：A 在在DNA芯片上进行杂交芯片上进行杂交B 直接在组织切片上或细胞涂片上杂交直接在组织切片上或细胞涂片上杂交C 将核酸点在将核酸点在NC膜上直接进行杂交膜上直接进行杂交D 即即DNA点阵法点阵法E 在凝胶中进行杂交在凝胶中进行杂交多多 选选 题题1.载体和目的基因的连接效率最高而且是定向载体和目的基因的连接效率最高而且是定向连接的是：连接的是：A两种不同限制性内切酶产生的粘性末端两
42、种不同限制性内切酶产生的粘性末端B一种限制性内切酶产生的粘性末端一种限制性内切酶产生的粘性末端C一个粘性末端和一个平端一个粘性末端和一个平端D两个酶切产生的平端两个酶切产生的平端E两个由粘性末端补平产生的平端两个由粘性末端补平产生的平端2.RNA2.RNA诊断常用的方法：诊断常用的方法：诊断常用的方法：诊断常用的方法：ARNA点杂交点杂交BNorthern印迹分析印迹分析CSouthern印迹分析印迹分析D定量逆转录定量逆转录PCREWestern印迹分析印迹分析3.基因诊断的方法包括：基因诊断的方法包括：A核酸分子杂交核酸分子杂交BPCRCASO法法D基因测序基因测序E基因芯片基因芯片4.基
43、因治疗的基本过程包括：基因治疗的基本过程包括：A治疗性基因的选择治疗性基因的选择B载体的选择载体的选择C靶细胞的选择靶细胞的选择D基因转移基因转移E回输体内回输体内5.关于关于DNA链末端合成终止法的叙述，正确的是：链末端合成终止法的叙述，正确的是：A以以ddNTP和和dNTP作原料作原料B以以32P、35S或荧光染料标记或荧光染料标记DNAC反应开始即加入反应开始即加入ddNTPDddNTP和和dNTP比例要适合比例要适合E需将待测需将待测DNA克隆入质粒或噬菌体克隆入质粒或噬菌体B B 型型 题题A.基因、载体的切割基因、载体的切割B.重组重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞C.外源
44、基因与载体连接外源基因与载体连接D.表达目的基因编码的蛋白质表达目的基因编码的蛋白质E.筛选、繁殖含有重组分子的受体细胞筛选、繁殖含有重组分子的受体细胞1.()产生重组分子产生重组分子2.()需要限制性内切核酸酶需要限制性内切核酸酶3.()获得获得DNA克隆克隆4.()应用转化、转染技术应用转化、转染技术答答 案案1.1.基因工程的特点是（基因工程的特点是（B B）在分子水平对在分子水平对DNADNA进行人为切割与重组，在细胞、整进行人为切割与重组，在细胞、整体水平进行表达是基因工程技术的基本特点。体水平进行表达是基因工程技术的基本特点。2.2.实验室常用的连接外源性和载体的酶是实验室常用的连
45、接外源性和载体的酶是（B B）T4 DNAT4 DNA连接酶连接的效率高，而且即可以连接黏性连接酶连接的效率高，而且即可以连接黏性末端，也可以连接平末端。末端，也可以连接平末端。单选题答案单选题答案3.3.不能用作克隆载体的是（不能用作克隆载体的是（C C）细菌基因组细菌基因组DNADNA不具备载体不具备载体DNADNA可进出细胞、并进行可进出细胞、并进行外源外源DNADNA连接、克隆等特性。连接、克隆等特性。4.4.用来鉴定蛋白质的技术是（用来鉴定蛋白质的技术是（D D）Western Western 印迹杂交是利用抗原与抗体特异性结合印迹杂交是利用抗原与抗体特异性结合反应而对蛋白质进行鉴定
46、的技术。反应而对蛋白质进行鉴定的技术。5.F5.F因子从一个细胞转移到另一个细胞的基因转移过程因子从一个细胞转移到另一个细胞的基因转移过程称为称为(E(E）较大的较大的F F质粒通过结合作用进行细胞间的转移过程。质粒通过结合作用进行细胞间的转移过程。6.6.用来鉴定用来鉴定RNARNA的技术是（的技术是（A A）Northern blotting Northern blotting 技术是将技术是将RNARNA分子转移到固相分子转移到固相支持物上进行探针检测的技术。常用于基因表达的特异性支持物上进行探针检测的技术。常用于基因表达的特异性分析和定量分析。分析和定量分析。7.7.克隆羊多莉的诞生是
47、应用：克隆羊多莉的诞生是应用：（B)B)克隆动物即将成年动物的体细胞核与去核的卵细胞质克隆动物即将成年动物的体细胞核与去核的卵细胞质融合，转入另一个动物子宫去发育繁殖。克隆羊多莉就是融合，转入另一个动物子宫去发育繁殖。克隆羊多莉就是第一只成功诞生的克隆动物。第一只成功诞生的克隆动物。8.8.关于基因工程的叙述错误的是（关于基因工程的叙述错误的是（D D）T4 DNAT4 DNA连接酶可以连接黏性连接酶可以连接黏性DNADNA末端，也可以连末端，也可以连接平头接平头DNADNA末端，是基因工程技术中常用的末端，是基因工程技术中常用的DNADNA连接酶。连接酶。9.9.下列哪项不是限制性内切酶的特
48、点？（下列哪项不是限制性内切酶的特点？（D D）限制性核酸内切酶是识别限制性核酸内切酶是识别DNADNA分子中特异性位点、并分子中特异性位点、并进行切割磷酸二酯键的酶，不具外切酶的活性。进行切割磷酸二酯键的酶，不具外切酶的活性。10.10.互补筛选法属于：互补筛选法属于：（C C）pUCpUC系列等质粒上有系列等质粒上有LacZLacZ基因片段，基因片段，LacZLacZ基因片段编码基因片段编码-半乳糖半乳糖苷酶的氨基端片段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型苷酶的氨基端片段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷半乳糖苷酶基因内互补，形成完整的酶基因内互补，形成完整的-半乳糖苷酶。此酶分解
49、半乳糖苷酶。此酶分解X-GelX-Gel，产生蓝，产生蓝色菌落。色菌落。LacZLacZ基因片段内有多克隆位点，插入外源基因后不能合成完基因片段内有多克隆位点，插入外源基因后不能合成完整的整的-半乳糖苷酶来分解半乳糖苷酶来分解 X-GelX-Gel，产生白色菌落。此法既为，产生白色菌落。此法既为互补筛互补筛选法，属于标志补救筛选。选法，属于标志补救筛选。11.11.下列哪项不适合作下列哪项不适合作cDNAcDNA文库探针文库探针 （B B）cDNAcDNA 是成熟是成熟mRNAmRNA经逆转得到的互补经逆转得到的互补DNADNA，已经切除，已经切除了内含子，用内含子做成的探针是不能进行检测的。
50、了内含子，用内含子做成的探针是不能进行检测的。12.12.重组重组DNA技术常用的限制性内切核酸酶为技术常用的限制性内切核酸酶为:（B)B)型限制酶能识别双链型限制酶能识别双链DNA的特异序列并在该序列的特异序列并在该序列内将内将DNA切断。基因工程操作中常用切断。基因工程操作中常用型限制性内切酶。型限制性内切酶。13.13.下列哪种染料不是核酸电泳的染色剂下列哪种染料不是核酸电泳的染色剂 （C C）考马斯亮蓝，三苯基甲烷，分子中含偏酸性基团考马斯亮蓝，三苯基甲烷，分子中含偏酸性基团与蛋白质碱性基团结合，可作为蛋白质染料，一般不做与蛋白质碱性基团结合，可作为蛋白质染料，一般不做核酸电泳的染色剂