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1、生物化学（第三版）生物化学（第三版）主编主编张洪渊张洪渊万海清万海清参编参编刘文彬刘文彬李永红李永红姚舜姚舜生物化学生物化学生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第十五章第十五章生物化学与新生物技术生物化学与新生物技术 生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清基因组genome基因组是生物体内全部遗传信息的集合一个物种单倍体的一套染色体DNA生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清几个代表物种的基因组大小几个代表物种的基因组大小生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清基因组学genomics发
2、展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，研究生命体（包括人类）全部基因组结构及功能的学科生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清基因组学研究的最终目标基因组学研究的最终目标u获得生物体全部基因组序列获得生物体全部基因组序列u鉴定所有基因的功能鉴定所有基因的功能u明确基因之间的相互作用关系明确基因之间的相互作用关系u阐明基因组的进化规律阐明基因组的进化规律生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清人类基因组计划的科学意义在于：（1）确定人类基因组中约5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。（2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基
3、因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。（3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。（4）研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清（5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性，正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA
4、的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育，因此，了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化，将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。（6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。（7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。（8）研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定
5、、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外，这些遗传信息还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清HistoryoftheHumanGenomeProject1990 Official start of HGP with 3 billion$and a 15 year horizon.1999 Sanger Centre publishes chromosome 222001 Draft Genome published:Celera&Public2003 Completion(almost
6、)of Human GenomeCelera:Craig VenterIntl.Cons:Francis Collins生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清人类基因组计划HGP生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清所有的标记都必须具有多态性由于不能对人类进行“选择性”婚配，而且人类子代个体数量有限、世代寿命较长，呈共显多态性的蛋白质数量不多，等位基因的数量不多。形态标记细胞学标记生化标记DNA分子标记遗传标记生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清物
7、理图物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对（bp，kb，Mb）作为基本测量单位（图距）的基因组图。酵母第三号染色体遗传图酵母第三号染色体遗传图（右）和物理图（左）的比较（右）和物理图（左）的比较生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清策略用机器进行自动测序，一次可读400800个碱基，由于测定的序列长度有一定限制。克隆重叠群法鸟枪法生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清克隆重叠群法克隆重叠群法v 将基因组将基因组DNADNA切割长度为切割长度为0.1Mb0.1Mb1Mb1Mb的大片段，克的大片段，克隆到隆到YACYAC或或BACBAC载体上载体上v
8、 然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列v 再装配、连接成连续的再装配、连接成连续的DNADNA分子。分子。v 这是一种自上而下（这是一种自上而下（up to downup to down）的测序策略的测序策略 v clone-by-clone methodclone-by-clone method生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清鸟枪法将较长的基因片段打断，构建一系列的随机亚克隆，然后测定每个亚克隆的序列，用计算机分析以发现重叠区域，最终对大片段的DNA定序。生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清全基因组鸟枪法测序
9、主要步骤：全基因组鸟枪法测序主要步骤：建立高度随机、插入片段大小为建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。克隆数左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组因组5倍以上。倍以上。高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序序列集合。序列集合。填补缺口。有两种待填补的缺口，一是没有相应模板填补缺口。有两种待填补的缺口，一是没有相应模板DNA的物理的物理缺口，二是有模板缺口，二是有模板DNA但未测序的序列缺口。但未测序的序列
10、缺口。生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清测序技术Sanger双脱氧链终止法Maxam-Gilbert化学修饰法高通量测序技术生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清高通量高通量DNA序列分析技术序列分析技术 人类基因组计划的成功很大程度上得益于有效减少DNA测序成本的技术更新。通过改良测序方法，不断提升其自动化程度，DNA测序的成本降低了100倍，从20世纪70-80年代$10/bp降低到本世纪初$0.1/bp！如果一个熟练的DNA序列分析人员采取早期80年代方法每天测定1000 bp计算，人类基因组（约3109bp）的全序列分析，至少也得需要100名这样的工人花
11、上100年的时间才能完成。而2000年代的高通量测序仪可达到月测序1-6 Mbp！生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第二代测序技术“Next Generation”Roche 454：Pyrosequencing Solexa/Illumina：cyclical base addition ABI SOLiD：sequencing by ligation生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清Illumina/Solexa Genome Analyzer2000 Mb/runApplied Biosystems ABI 3730XL1 Mb/day Roche/4
12、54 Genome Sequencer FLX100 Mb/runApplied BiosystemsSOLiD3000 Mb/run生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清功能基因组学功能基因组学 在完成一个生物体全部基因组测序的基础上，详尽分析基因在完成一个生物体全部基因组测序的基础上，详尽分析基因组的序列，鉴定基因组全部基因的功能，描述各个基因的表组的序列，鉴定基因组全部基因的功能，描述各个基因的表达和调控模式。达和调控模式。转录组学转录组学研究某一特殊功能状态的细胞全套研究某一特殊功能状态的细胞全套RNA的类型的类型与拷贝
13、数；比较不同功能状态下与拷贝数；比较不同功能状态下RNA表达的变化，搜寻与功表达的变化，搜寻与功能状态变化紧密相关的重要基因群。此研究领域的常用技术能状态变化紧密相关的重要基因群。此研究领域的常用技术是生物芯片技术。是生物芯片技术。蛋白质组学蛋白质组学指蛋白质组研究领域，即研究某一特定状态的指蛋白质组研究领域，即研究某一特定状态的细胞全套蛋白质表达谱。此研究领域常用技术有蛋白质双向细胞全套蛋白质表达谱。此研究领域常用技术有蛋白质双向电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清转录组转录组指一个细胞内的一套指一个细胞内的
14、一套RNA转录物，包含了某一转录物，包含了某一环境条件、某一生命阶段、某一生理或病理（功能）状环境条件、某一生命阶段、某一生理或病理（功能）状态下，生命体的细胞或组织所表达的基因种类和水平。态下，生命体的细胞或组织所表达的基因种类和水平。mRNA小小RNA：miRNA、siRNA蛋白质组蛋白质组指一个细胞内的全套蛋白质，即研究某一特定指一个细胞内的全套蛋白质，即研究某一特定状态的细胞全套蛋白质表达谱。此研究领域常用技术有状态的细胞全套蛋白质表达谱。此研究领域常用技术有蛋白质双向电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。蛋白质双向电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。与基因组不同的是，转录组、蛋白质组的定义
15、中包含了与基因组不同的是，转录组、蛋白质组的定义中包含了时间和空间的限定。时间和空间的限定。生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清转录组学基本研究方法Real-time PCR基于杂交的转录组学方法基因芯片基于测序的转录组学方法EST全长cDNA文库SAGE第二代测序技术生物信息学分析：基因表达聚类生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清生物芯片在载体材料上，以大规模阵列的形式排布了不同的蛋白质或核酸等生物分子，形成可与目的靶分子相互作用，并进行反应的固相表面。生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清DNA芯片通过微阵列(Microarray)技术将高密度
16、DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的DNA检测基因组芯片表达芯片生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清芯片载体玻璃片、硅片、尼龙膜、凝胶、金属对载体进行化学修饰，活化试剂通过化学反应在载体表面键合上活性基团，以便与配基结合，形成具有生物活性的亲和表面，用于固定蛋白质和核酸活化试剂：EDC、NHS活性基团：氨基、环氧化物、巯基、醛基生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清基因芯片的探针基因芯片的探针寡核苷酸寡核苷酸OligocDNA：PCR产物产物 生物化学生物化学主
17、编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清SpottedMicroarrayscDNA ArraysOligo Arrays InSituOligoSynthesisPhotosynthesisPlanersurfaceMicrofluidicschipE-fieldsynthesisIntegratedChipsIntegrateduF,microarrayanddetectionchipswithPCR,fluorescenceore-detectionMicrofluidicsPlasticsCeramics SiliconOther materials不同的生物芯片技术平台不同的生物芯片技术平
18、台点样芯片原位合成芯片微流体芯片整合型芯片生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清点样芯片点样芯片非接触式非接触式接触式接触式预先合成好的探针通过预先合成好的探针通过类似于喷墨打印机的技类似于喷墨打印机的技术喷射到玻璃基片表面，术喷射到玻璃基片表面，或者用针头点在片基上。或者用针头点在片基上。生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清原位合成激光照排技术光源遮蔽板芯片生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGA Mas
19、k 1AAAAA探针合成探针合成生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGC Mask 2CCCCCCAAAAA探针合成探针合成生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清A 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGG Mask 3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC探针合成探针合成完成的芯片完成的芯片生物化学生物化学主编主
20、编 张洪渊张洪渊 万海清万海清L LT TL LL LL LC CL LL LL LL LL LL LL LL LA AC CT TT TT TA AC CC CC CC CC CC CG GC CC CG GA AT TA AT TC CA AT TC CA AT TC CG GA AC CG GA AA AC CT TA AC CT TA AG GC CA AG GC CT TT TO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PL LT TL LL LL LC CL LL LL LL LL L
21、L LL LL LA AC CT TT TT TA AC CC CC CC CC CC CG GC CC CG GA AT TA AT TC CA AT TC CA AT TC CG GA AC CG GA AA AC CT TA AC CT TA AG GC CA AG GC CT TT TO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PL LT TL LL LL LC CL LL LL LL LL LL LL LL LA AC CT TT TT TA AC CC CC CC CC CC CG G
22、C CC CG GA AT TA AT TC CA AT TC CA AT TC CG GA AC CG GA AA AC CT TA AC CT TA AG GC CA AG GC CT TT TO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PFor growth step:one type of monomer is coupled to specific sites deprotected using PGA.Computer generated light irradiation patte
23、rns生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清样本的处理方法按照样本分按照样本分 DNA、RNA、DNA-蛋白复合体按照标记信号分子划分按照标记信号分子划分 荧光染料、生物素、放射性元素按照标记方法分按照标记方法分 cDNA 直接标记(间接标记)、PCR扩增标记、末端标记生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清芯片实验流程1、分离RNA（10g）2、标记3、杂交（预杂交）4、洗片5、扫描6、数据分析生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清Tagged RNA fragments flushed over arrayLaser activation of fl
24、uorescent tagsOptical scanning of hybridization intensities基因芯片的杂交实验基因芯片的杂交实验生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清图像扫描Cy5Cy3生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清差异基因筛选原理：采用cy3/cy5的ratio值对差异基因进行判断，或采用统计方法对差异基因进行统计推断。倍数法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清基因芯片的应用基因表达谱分析基因发现SNP检测药物基因组学微生物菌种鉴定预防医学研究生物化学生物化学主编主编 张洪渊
25、张洪渊 万海清万海清RNA-Seq转录组测序（全转录组鸟枪法测序）：利用深度测序技术对各种类型的转录本进行高通量检测，获得RNA片段在特定样本中的含量生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清定量化可以直接测定每个转录本片段序列、单核苷酸分辨率的准确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题灵敏度高，可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录本可以对任意物种进行全基因组分析，无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析，同时能够检测未知基因，发现新的转录本生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清蛋白质组学蛋白质组
26、：一个细胞（或组织、机体）所表达的全部蛋白质蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学本质是在大规模水平上研究蛋白质特征：表达水平（量）翻译后的修饰（成熟与调控）蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识 生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清蛋白质组学研究范畴蛋白质组学研究范畴蛋白质和蛋白质间相互作用蛋白质和蛋白质间相互作用蛋白质和核酸之间相互作用蛋白质和核酸之间相互作用蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定蛋白质结构分析蛋白质结构分析生理、病理或不同发
27、育状态下蛋白质组表达差异生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异蛋白质信息库蛋白质信息库生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清研究策略与技术两条互补的实验流程基于凝胶的工作流程基于液相色谱的工作流程生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清双向电泳（2D）生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离）然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小）凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图 生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第一向IPG-IEF电泳电泳固相pH梯度等电聚焦（immobil
28、ized pH gradients isoelectric focusing）IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第二向垂直SDS-PAGE电泳SDS-PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、
29、分子筛效应。SDS与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关 垂直电泳生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测染色：1）考马斯亮兰染色法；2）银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5）放射性同位素标记法等生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清2-DE 凝胶蛋白质斑点的分析图像扫描和分析全自动斑点切取系统生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测质谱使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相
30、反的速度色散，使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其分子量MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry）样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清蛋白质芯片将蛋白质固定在固相载体上，通过大分子之间的特异性识别和结合进行检测。酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清蛋白质芯片探针低密度蛋白质芯片：直接点样高密度蛋白质芯片：cDNA文库所产生的几乎所有蛋白质均呈微距阵排列，点样时须用机械手进行生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清应用蛋白质表达谱分析蛋白质与蛋白质的相互作用DNA蛋白质、RNA蛋白质的相互作用筛选药物作用的蛋白靶点药物筛选