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1、双氢青蒿素对前列腺癌裸鼠种植瘤生长及VEGF表达的影响李庆春高小玲石之虎邹 聪罗子国（重庆医科大学电镜室，重庆400016）摘要目的：研究双氢青蒿素（DHA）对前列腺癌PC-3细胞裸鼠种植瘤的 抑制作用及对VEGF表达的影响，并探讨其作用机制。方法：采用人前列腺癌PC-3细胞建立裸鼠种植瘤模型，20只模型鼠随机分为对照组、溶剂组、DHA大剂量组及DHA小剂量组，经13天干预后，计算抑瘤率；光镜及电镜观察肿瘤组织形态学表现，免疫组织化学法检测VEGF的表达水平，体视学分析肿瘤微血管密度（MVD）。结果：DHA大小剂量组抑瘤率分别为69.221%和63.186%,肿瘤组织内凋亡细胞明显增多，可见典
2、型的凋亡小体；免疫组化结果显示，DHA大小剂量组VEGF表达及MVD均低于对照组（pV0.05）。结论：DHA具有较 强的抗肿瘤作用，其机制与下调凋亡相关基因VEGF有关。关键词双氢青蒿素；前列腺癌；凋亡；VEGF；微血管密度中图分类号R284.1;R979.1【文献标识码】A【文章编号】The effects of dihydroartemisininon transplanted prostate cancer in nude mice and expression ofVEGFLI Qing-chun, GAO Xiao-lin, SHI Zhi-hu, ZOU Cong ,LUO Zi
3、-guo*(Laboratory of Electron Microscope, Chongqing Medical University, Chongqing400016, China)Abstract Objective:To study the inhibitory effects of dihydroartemisinin(DHA) on the growth of transplanted human prostate cancer PC-3 cells in nude mice and the expression level of VEGF and explore the und
4、erlying action mechanism of DHA. Methods: Prostate cancer PC-3 cells were transplanted into 20 nude mice to establish the solid tumor mode. These nude mice were randomly divided into 4 groups with 5 mice in each group: control group , solvent group, large dose DHA group and low dose DHA group. The t
5、umor growth inhibition rate was calculated on day 13 after drug administration;Pathornorphism changes of PC-3 cells were observed by light microscope(LM) and transmission electron microscope(TEM) after administration of DHA. The protein expression of VEGF was tested by immunohistochemical method;通讯作
6、者罗子国，Tel: , E-mail: o作者简介李庆春，男，医师，主要从事前列腺癌的研究，发表相关文章1篇，Tel:, E-mail :。 Micro-vasvulor density(MVD) was analysed by stereological method. Results: The tumor growth inhibition rates of large dose DHA group and low dose DHA group were 69.221% and 63.186%; Apoptotic cells were significantly increased an
7、d TEM examination revealed that the scattered apoptotic bodies were observed in tumor tissues of DHA groups; Immunohistochemical examination revealed that the protein expression of VEGF was decreased in DHA groups (p 0.05 ) ; MVD was significantly decreased in DHA groups (p 0.05) . Conclusion: These
8、 results demonstrated that DHA has stronger inhibitory effects on human prostate cancer cell line PC-3 cells in action mechanism of DHA might be related with downregulating VEGF.Key wordsDihydroartemisinin ; Prostate Cancer; Apoptosis; VEGF; Micro-vasvulor density前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性生殖系统常见的恶
9、性肿瘤。近年来，其 发病率在全球范围内呈上升趋势，美国癌症协会公布的资料显示其死亡率占恶性 肿瘤死亡率的第二位，前列腺癌已成为威胁男性健康的主要疾病川。目前包括 根治性前列腺切除术、放疗、化疗、去势疗法等都存在一定局限性123】。因此寻 求更加安全有效的治疗用药，对改善前列腺癌患者生活质量及提高生存率非常必 要。青蒿素(artemisinin)及其衍生物是一类传统抗疟药，随着抗疟机制的深入研 究，其抗肿瘤作用备受关注，一些学者在青蒿素类药物对白血病等癌细胞增殖抑 制方面进行了一些初步探索，但在前列腺癌方面的研究却鲜有报道，仅EfferthS 61和Posner曾分别报道青蒿琥酯及青蒿素对前列腺
10、癌细胞株及转基因鼠前列腺 癌有抑制作用，但没有对其作用机制进行更深入的研究。本研究采用前列腺癌 PC-3细胞裸鼠种植瘤模型，观察双氢青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)对前歹U腺 癌种植瘤生长的影响，通过检测种植瘤内细胞凋亡、VEGF的表达及微血管密度 (Micro-vasvulor density, MVD),以期探讨 DHA 的抗癌机制。1材料与方法1.1 主要药物、试剂、细胞株及实验动物 DHA由重庆医科大学薛斌博士 馈赠，以少量二甲基亚碉(DMSO)溶解备用。兔抗人VEGF单克隆抗体及免疫 组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。前列腺癌PC-3细胞株购自中 科
11、院上海细胞生物学研究所。46周龄BALB/c雄性裸鼠由北京维通利华实验 动物技术有限公司提供，合格证号：SKXC (京)2002-0003,体重(17.52.3)g, 饲养于重庆医科大学动物中心SPF级动物室。1.2 动物实验及分组 在前期体外实验的基础上进行动物实验，将收集好的 5xl06 cells-mL1的PC-3细胞悬液0.1 mL注入裸鼠右侧腋窝皮下，饲养约10天 左右，肿瘤长至0.50.6 cm直径大小，选取体重及瘤重基本一致的裸鼠20只进 行药物干预。随机分为对照组、溶剂（DMSO）组、DHA200）imolkgT体重组、 DHA100（amol-kg体重组，每组5只，药物治疗采
12、用腹腔注射，隔日一次，第 13天取材。1.3 动物取材及标本处理 将裸鼠断颈，完整剥离瘤体，称重，取0.3 cm厚 的组织片浸泡于4%多聚甲醛中固定24小时，常规处理，石蜡切片，HE染色， 免疫组化SP法（按试剂盒说明操作）检测VEGF的表达水平；同时取1 mn?新 鲜肿瘤组织5块,4%戊二醛预固定4小时，电镜标本常规处理,超薄切片，H-7500 型透射电镜观察并拍照。1.4 图象分析 用Olympus DP70图像采集系统对每个标本的免役组化指标 随机取10个高倍视野（x400）o用北航CM2000B生物医学图像分析系统对所摄 免疫组化照片的阳性产物进行平均光密度值分析，每个标本可获得10个
13、数据， 取均数后再进行统计学处理。1.5 计算微血管密度 MVD计算参照Weidner的方法，并进行改良，先对 每个肿瘤电镜标本头子作半薄切片，甲苯胺蓝染色，选取高血管密度区，即热点, 光镜定位后，制做超薄切片，电镜观察，随机拍摄10个视野（x 2000）,判断标准 为每观察到一个血管内皮细胞记作一根微血管，结果用10个2000倍视野下血管 数目的平均数表示。1.6 统计学处理 所有数据用表示，应用SPSS13.0软件，采用多个均数 间多重比较的一维方差分析及LSD-t检验进行统计分析，以pVO.05为差异有统 计学意义。2结果2.1 DHA对种植瘤生长的影响 各组肿瘤重量（表1）经方差分析结
14、果显示, 对照组及溶剂组瘤重明显大于DHA治疗组,DHA两个剂量组与对照组比较差别 均有统计学意义（p0.05）,两个剂量组之间比较差别无统计学意义，溶剂组与 对照组比较差别也无统计学意义；肿瘤生长抑制率=（对照组平均瘤重-实验组平 均瘤重）/对照组平均瘤重X 100%,可见（表1）大小剂量组抑瘤率均高于溶剂组（p0.05）o2.2 肿瘤病理组织学表现种植瘤大体形态为球形结节状，剖面呈鱼肉状,对照组及溶剂组瘤体积明显大于DHA治疗组，瘤体边界清晰，易剥离。HE染 色见对照组肿瘤细胞分布均匀，细胞大小一致，胞质胞核清楚；DHA处理后细 胞分布不均，大小不等，细胞皱缩有突起，可见染色质致密、浓缩、
15、核碎裂等凋 亡特征。透射电镜观察肿瘤细胞排列稀疏，无典型细胞间连接，细胞间可见结缔组织 及毛细血管填充。对照组，PC-3细胞直径8141nm大小，呈圆形或椭圆形，较 规则，细胞表面有微绒毛，细胞核较大，核仁明显（12个），常染色质丰富， 胞浆呈均匀中等的电子密度，散在分布有粗面内质网和线粒体，并含有丰富的游 离多聚核糖体，可见核分裂相（图a）。DHA两个剂量组可见数量不等、程度不 同的凋亡细胞；早期凋亡细胞表现为细胞基质电子密度变深，细胞核异染色质边 集，线粒体内室肿胀，崎模糊不清，可见微丝微管断裂现象；晚期凋亡细胞基质 进一步浓缩，电子密度更深，染色质逐渐凝聚成新月状附于核膜周边，细胞核固
16、缩呈均一的致密物，进而断裂为大小不一的片段，并碎裂成许多小块，直至形成 许多大小不等的凋亡小体；凋亡小体内核碎片可有可无，膜完整，线粒体固缩（图 b）o对照组肿瘤细胞间可见较多毛细血管穿行（图c）；肿瘤经DHA处理后，可 见毛细血管内皮细胞染色质边集，部分核膜破损，染色质分散成若干小块，核仁 消失，细胞周边可见含有染色质团块及细胞质成分的凋亡小体（图d）。2.3 VEGF的表达：VEGF蛋白反应产物为棕色，位于细胞浆（图e、f）。对 照组，细胞膜及细胞浆内呈深棕色，DHA大小剂量组胞浆内反应产物颜色较浅, 所有图片经图像体视分析后平均光密度值见（表1）, DHA两个不同剂量组的平 均光密度值与
17、对照组比较差异均有统计学意义（P0.05）, DHA两个不同剂量组 之间平均光密度值差异无统计学意义，溶剂组与对照组之间平均光密度值无统计 学意义。2.4 肿瘤微血管密度（MVD） DHA大小剂量组MVD分别为0.26及0.44, 与对照组1.2相比，差异均有统计学意义（PQ05）； DHA两个剂量组之间比较差 异无统计学意义，溶剂组与对照组比较差异无统计学意义（表1）。表1各组药物处理对种植瘤生长、蛋白表达及微血管密度的影响（=5用土s）Tabale 1 The effects of different drug on the transplantation tumor growth ,ex
18、pressions of VEGF as well as MVD组别肿瘤重量g抑瘤率%VEGF蛋白微血管密度图a：对照组肿瘤细胞。(透射电镜 X 8000,bar=2p m) Fig a: Cancer cells of control group. (TEM X8000,bar=2pm)小剂量0.416+0.186#63.186#0.069+0.020*#0.440*#大剂量0.348+0.12 P#69.221#0.0680.023*#0.260 *#溶剂组1.0920.6113.3630.191 0.0321.020对照组1.1300.53200.1760.0161.200图a：对照组肿
19、瘤细胞。(透射电镜 X 8000,bar=2p m) Fig a: Cancer cells of control group. (TEM X8000,bar=2pm)图b： DHA组肿瘤细胞凋亡。(透射电镜 x 15000,bar= 1pm)Fig b: Apoptosis cancer cells of DHA group. (TEM X 15000,bar= 1pm)图c：对照组血管内皮细胞。(透射电镜 X 10000,bar=2Mm)Fig c:Vascular endothelial cells of control group.(TEM X 10000,bar=2pm)图d： DH
20、A组血管内皮细胞凋亡(透射电镜 X 8000,bar=2pm)Fig d: Apoptosis vascular endothelial cells(TEM X8000,bar=2pm)图e：对照组VEGF表达。(SP 法 X400,bar=50|jm)Fig e: VEGF expresion of Control group.图f： DHA组VEGF表达。(SP 法x400,bar=50|jm)Fig f: VEGF expresion of DHA group.*： VS control group, P0.05. #： VS solvent group, P0.05.(SPX400,b
21、ar=50pm)3讨论(SPX400,bar=50pm)前列腺癌的发病率及死亡率都很高川，目前尚无有效的治疗手段3、叫 因 此，寻求高效低毒的治疗药物已成为当务之急。研究表明肿瘤生长与转移需要大 量毛细血管生成，因此抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡是开发抗肿瘤药物 的新策略。青蒿素类药物的促调亡作用已有一些相关报道，在前列腺癌方面 的研究却较少，而仅有的一些报道也集中在体外实验阶段6、刀，且未对其促凋 亡机制作深入研究。作者应用前列腺癌裸鼠种植瘤模型，研究了 DHA抑制肿瘤 血管生成并诱导PC-3细胞凋亡作用，并对其作用机制进行了初步探讨。本研究透射电镜观察到DHA两个剂量组的肿瘤细胞及血管
22、内皮细胞以核固 缩、线粒体内室肿胀为特征的凋亡现象；免疫组化检测了 VEGF所表达的蛋白, 结果显示经DHA干预后，VEGF在PC-3细胞胞浆内的表达降低，该结果与 Shankar的研究结果极为相似口上由此可见：在一定剂量下，DHA对前列腺癌 PC-3细胞裸鼠种植瘤生长具有抑制作用；DHA可诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡; DHA能有效调控凋亡相关基因VEGF的表达。细胞增殖与凋亡失衡是前列腺癌 发生发展的重要机制，前列腺癌的发生发展与VEGF的表达水平密切相关， 本研究结果充分显示DHA通过抑制种植瘤血管生成能够诱导PC-3细胞及血管 内皮细胞凋亡，其机制可能与下调VEGF表达有关。VEGF是
23、目前已知的作用最强的促血管生成因子之一，通常在多数肿瘤细胞 中都有表达，其与血管生成、肿瘤生长、转移、恶性表现相关，VEGF对微血管 生成及通透性增强起关键性的促进作用口叫肿瘤的血管生成不仅为肿瘤细胞的 生长提供了必需的营养，还可为肿瘤细胞进入循环系统导致远处转移提供通道， 因此，VEGF和MVD的结果可反应肿瘤的生长和转移能力，针对VEGF的靶向 治疗不仅能阻断肿瘤组织内的血管形成，而且也能间接抑制其他血管因子的作用 【。本研究结果表明，经DHA治疗后PC-3细胞中VEGF的表达水平及MVD 值明显低于对照组及溶剂组，且DHA组瘤重也低于对照组及溶剂组。Lee等“引 的研究也证实双氢青蒿素可
24、以下调VEGF的表达，并抑制血管生成、诱导肿瘤 细胞凋亡。由此可见DHA通过下调VEGF,抑制血管生成，使肿瘤组织血供减 少，细胞因缺血缺氧而走向衰亡；同时DHA也可通过诱导血管内皮细胞凋亡， 使MVD降低，肿瘤组织血供进一步减少，最终抑制肿瘤细胞生长。电镜结果显示DHA作用PC-3细胞及血管内皮细胞后线粒形态变化最突出， 结合免疫组化、HE染色、MVD结果，推测DHA可能通过某种机制下调VEGF, 再通过级联反应使Caspase-3活化，而Caspase-3又启动了细胞凋亡程序。另一 方面DHA可抑制微血管生成，使MVD下降，PC-3细胞供血不足，线粒体因细 胞缺血缺氧而发生某种细微变化，导
25、致正常功能丧失，并释放凋亡物质，启动线 粒体调亡途径，最终线粒体外膜破裂、细胞骨架破坏、核蛋白溶解，并形成凋亡 小体。而DHA通过抑制磷脂酰肌醇G3）激酶（phosphatidylinositol 3-kinase ,PI3K） 途径，下调VEGF表达“叫 DHA也可抑制PC-3细胞及血管内皮细胞之间由 VEGF介导的自分泌及旁分泌信号通路，而导致微血管密度降低，并最终诱导血 管内皮细胞凋亡。EfferM*等认为这一凋亡过程属线粒体介导途径，DHA通 过调节凋亡相关基因，激发线粒体释放细胞色素C,同时激活了一系列复杂的凋 亡酶系，最终促发凋亡。同时DHA能够使线粒体膜电位去极化，这将增强电子
26、传递链的功能并提高细胞对药物的敏感性，最终导致线粒体正常功能的丧失，本 研究结果也证实了这一点。本研究中溶剂组与对照组各指标差异均无统计学意义，这说明DMSO对 PC-3细胞生长没有影响；本研究大小剂量组各指标差异虽无统计学意义，但实 验数据显示大剂量DHA对MVD及凋亡相关基因VEGF的影响较大，这可能预 示着小剂量DHA （100|jmolkg-i体重）是动物模型的最佳剂量，而大剂量（200 |umol,kg/体重）可能已进入DHA疗效的平台期。综上所述，DHA对PC-3细胞的影响在细胞水平上表现为抑制细胞增殖并诱 导凋亡，在分子水平上表现为对凋亡相关基因VEGF的有效调控，作者对其确 切
27、机制的研究仍在进行当中，尤其是DHA对其他凋亡相关基因Caspase-2、 Survivin, Bcl-2、Bax等调控的研究，随着研究的不断深入，DHA必将成为治疗 前列腺癌的有效手段。参考文献1 Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2008J. CA Cancer J Clin, 2008, 58 （1）:71 -96.2 Fizazi K, Martinez LA, Sikes CR, et al. The Association of p21(WAF-l/CIPl) withProgression to Androg
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