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1、质粒质粒DNADNA的小量提取及检测的小量提取及检测 把有用目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb 不等，为双链、闭合、环状DNA 分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活（自杀质粒 oriR6K/p
2、ir,oriTs）。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F 质粒(又称F 因子或性质粒)、R 质粒(抗药性因子)和Col 质粒(产大肠杆菌素因子)，以及产某些限制性内切酶与修饰酶等。质粒在细胞内的复制一般有两种类型质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型紧密控制型(Stringent control)(Stringent control)和和松驰控制型松驰控制型(Relaxed control)(Relaxed control)。前者。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含
3、有它也不能复制，通常每个细胞内只含有1 1 个或几个质粒分个或几个质粒分子，如子，如F F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20 20 个以上，如个以上，如Col Col E1 E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素氯霉素时，细胞内蛋时，细胞内蛋白质合成、染色体白质合成、染色体DNA DNA 复制和细胞分裂均受到抑制，紧复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松驰型质粒继续复制，质粒拷贝数密型质粒复制停止，而松驰型质粒继续复制，质粒拷贝
4、数可由原来可由原来20 20 多个扩增至多个扩增至1000-3000 1000-3000 个，此时质粒个，此时质粒DNA DNA 占总占总DNA DNA 的含量可由原来的的含量可由原来的2%2%增加至增加至40-50%40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当质粒占优势，而在另
5、一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性（Incompatibility)Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。定地共存于同一宿主细胞中。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位
6、点的多克隆位点序列（MCS），并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb 之间，如PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和pBluescript（简称pBS）等。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。T
7、7 promoter 311-327T7 transcription start 310T7 Tag coding sequence 207-239Multiple cloning sites(BamH I-Xho I)158-203HisTag coding sequence 140-157T7 terminator 26-72lacI coding sequence 714-1793pBR322 origin 3227bla coding sequence 3988-4845f1 origin 4977-5432从细菌中分离质粒从细菌中分离质粒DNA DNA 的方法都包括的方法都包括3 3
8、 个基本步骤：培养个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNADNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠(SDS)(SDS)可使细胞膜裂解，细菌染色体可使细胞膜裂解，细菌染色体DNA DNA 会缠绕附着在细胞碎会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体片上，同时由于细菌染色体DNA DNA 比质粒大得多，易受机比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体当用
9、强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA DNA 变性变性,而共价闭合环状而共价闭合环状DNA(CovalentlyDNA(Covalently closed circular DNA closed circular DNA，简，简称称cccDNAcccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体时，线状染色体DNA DNA 片段难以复性，而是与变性的蛋白片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA DNA 双链又恢复原状，双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于
10、液相中。重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。w 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。w 几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA DNA 外，还会产外，还会产生其它形式的质粒生其它形式的质粒DNADNA。如果质粒。如果质粒DNA DN
11、A 两条链中两条链中有一条链发生一处或多处断裂有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(OpenDNA(Open circular DNA circular DNA，简称，简称 ocDNAocDNA)；如果质；如果质粒粒DNA DNA 的两条链在同一处断裂，则形成线状的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(LinearDNA(Linear DNA)DNA)。当提取的质粒。当提取的质粒DNA DNA 电泳时，电泳时，同一质粒同一质粒DNA DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环其超螺旋形式的
12、泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。和线状分子的泳动速度快。材料、设备及试剂一、材料一、材料 含含pUC19 pUC19 的的E.coli DH5E.coli DH5菌株，菌株，1.5ml 1.5ml 塑料离塑料离心管心管(又称又称eppendorfeppendorf 管管),),离心管架。离心管架。二、设备二、设备 微量取液器微量取液器(20l(20l，200l200l，1000l)1000l)，台式高速台式高速离心机，恒温振荡摇床，离心机，恒温振荡摇床，涡旋振荡器，涡旋振荡器，电泳仪，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置等。琼脂糖平板电泳装置等。三、试剂 1、LB 液体培养基(Luria-Ber
13、tani)：蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract)5 g，NaCl 10 g 2、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成 50mg/ml 水溶液,-20保存备用。3、溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。高压灭菌15 分钟,储存于4冰箱。4、溶液：0.2 mol/L NaOH，1 SDS。5、溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L，Ac-5mol/L。
14、6.NH4Ac 7.5M 7.70%无水乙醇 8、RNA 酶A 母液：将RNA 酶A 溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5),15mmol/L NaCl 中，配成10mg/ml的溶液，于100加热15 分钟,使混有的DNA 酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20。9、TE 缓冲液：10 mmo/L TrisCl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4冰箱中。10、电泳所用试剂：（1）TAE 缓冲液(50)：（2）上样缓冲液(6)：0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。实实实实 验验验验 流流流流 程程程程质
15、粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA的提取的提取的提取的提取接含接含接含接含pUC18pUC18pUC18pUC18的的的的E.coliE.coliE.coliE.coli单菌落于单菌落于单菌落于单菌落于2 2 2 2ml LB Ampml LB Ampml LB Ampml LB Amp+液体培养基中液体培养基中液体培养基中液体培养基中373737370 0 0 0C C C C，190rpm190rpm190rpm190rpm振荡培养过夜（振荡培养过夜（振荡培养过夜（振荡培养过夜（OD=1.0OD=1.0OD=1.0OD=1.0）用用用用1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml离心管取离
16、心管取离心管取离心管取1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml菌液，菌液，菌液，菌液，12000rpm12000rpm12000rpm12000rpm、离心、离心、离心、离心1min1min1min1min，弃上清弃上清弃上清弃上清,将管倒置于纸上将管倒置于纸上将管倒置于纸上将管倒置于纸上,使液体流尽使液体流尽使液体流尽使液体流尽加加加加100uL100uL100uL100uL预冷的溶液预冷的溶液预冷的溶液预冷的溶液I I I I悬浮菌体悬浮菌体悬浮菌体悬浮菌体（需剧烈振荡）（需剧烈振荡）（需剧烈振荡）（需剧烈振荡）加入加入加入加入200uL200uL200uL200uL溶液溶液溶液溶液III
17、IIIII（现配现用），温和颠倒（现配现用），温和颠倒（现配现用），温和颠倒（现配现用），温和颠倒eppendorfeppendorfeppendorfeppendorf 管数次管数次管数次管数次,以混匀内容物以混匀内容物以混匀内容物以混匀内容物（溶液变清澈透明）（溶液变清澈透明）（溶液变清澈透明）（溶液变清澈透明）加入加入加入加入150uL150uL150uL150uL预冷的溶液预冷的溶液预冷的溶液预冷的溶液IIIIIIIIIIII，温和颠倒温和颠倒温和颠倒温和颠倒eppendorfeppendorfeppendorfeppendorf 管数次管数次管数次管数次,使沉淀混匀使沉淀混匀使沉淀混
18、匀使沉淀混匀，冰上静置冰上静置冰上静置冰上静置5min5min5min5min质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA复性复性复性复性（明显的白色沉淀）明显的白色沉淀）明显的白色沉淀）明显的白色沉淀）加一滴氯仿，加一滴氯仿，加一滴氯仿，加一滴氯仿，12000rpm12000rpm12000rpm12000rpm，4 4 4 4 离心离心离心离心5min5min5min5min取上清液移入干净取上清液移入干净取上清液移入干净取上清液移入干净eppendorfeppendorfeppendorfeppendorf 管中管中管中管中,加加加加250ul250ul250ul250ul NH4Ac NH
19、4Ac NH4Ac NH4Ac，混匀，混匀，混匀，混匀，12000rpm12000rpm12000rpm12000rpm，4 4 4 4 离心离心离心离心5min5min5min5min取上清液移入干净取上清液移入干净取上清液移入干净取上清液移入干净eppendorfeppendorfeppendorfeppendorf 管中管中管中管中,加加加加1ml 1ml 1ml 1ml 无水乙醇混匀，无水乙醇混匀，无水乙醇混匀，无水乙醇混匀，-20202020度度度度 20min20min20min20min沉淀沉淀沉淀沉淀DNADNADNADNA12000rpm12000rpm12000rpm120
20、00rpm，4 4 4 4 离心离心离心离心10min10min10min10min小心弃去上清，将管口敞开倒置于纸上使所有液体流出小心弃去上清，将管口敞开倒置于纸上使所有液体流出小心弃去上清，将管口敞开倒置于纸上使所有液体流出小心弃去上清，将管口敞开倒置于纸上使所有液体流出,加入加入加入加入1ml 701ml 701ml 701ml 70乙醇洗沉淀一次，沉淀超净台中风干乙醇洗沉淀一次，沉淀超净台中风干乙醇洗沉淀一次，沉淀超净台中风干乙醇洗沉淀一次，沉淀超净台中风干将沉淀溶于将沉淀溶于将沉淀溶于将沉淀溶于2 2 2 20l TE 0l TE 0l TE 0l TE 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液(p
21、H8.0(pH8.0(pH8.0(pH8.0，含，含，含，含20g/ml RNaseA)20g/ml RNaseA)20g/ml RNaseA)20g/ml RNaseA)中，储于中，储于中，储于中，储于-20-20-20-20冰箱中冰箱中冰箱中冰箱中 注意注意 1.1.提取过程应尽量保持低温。提取过程应尽量保持低温。2.2.提取质粒提取质粒DNA DNA 过程中除去蛋白很重要过程中除去蛋白很重要,采用酚采用酚/氯仿去除蛋氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽要将蛋白尽量除干净需多次抽提。提。3.3.沉淀沉淀DNA DNA 通常使用冰乙醇通常使用
22、冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使在低温条件下放置时间稍长可使DNA DNA 沉淀完全。沉淀沉淀完全。沉淀DNA DNA 也可用异丙醇也可用异丙醇(一般使用一般使用0.6V0.6V体体积积),),且沉淀完全且沉淀完全,速度快速度快,但常把盐沉淀下来但常把盐沉淀下来,所以多数还是所以多数还是用乙醇。用乙醇。质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA的电泳鉴定的电泳鉴定的电泳鉴定的电泳鉴定0.75%0.75%0.75%0.75%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 (用用用用 TAE bufferTAE bufferTAE bufferTAE buffer配配配配)1xTAE 1xTAE 1xTAE 1xTAE 1uL1uL1uL1uL质粒质粒质粒质粒DNA +1uL 10 xloading DNA +1uL 10 xloading DNA +1uL 10 xloading DNA +1uL 10 xloading 5 5 5 5伏伏伏伏/cm/cm/cm/cm恒压电泳，恒压电泳，恒压电泳，恒压电泳，45min45min45min45min结果用凝胶成像仪分析照相结果用凝胶成像仪分析照相结果用凝胶成像仪分析照相结果用凝胶成像仪分析照相