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1、实验一实验一 质粒质粒DNADNA的提取、酶切的提取、酶切 及琼脂糖凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳 一一 实验目的实验目的 掌握碱裂解法分离质粒掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。的基本原理和操作要点。了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法的试验方法学习琼脂糖凝胶电泳检测学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术的方法和技术 质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNADNA分子。是染色体外小型（分子。是染色体外小型（1-200kb1-200kb）
2、的共价、闭合、环状的双链的共价、闭合、环状的双链DNADNA分分子（子（cccDNAcccDNA），），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。二二 实验原理实验原理 培养细菌使质粒扩增培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌收集和裂解细菌 分离和纯化质粒分离和纯化质粒DNADNA 共价闭环共价闭环DNADNA（cccDNAcccDNA）线状线状DNADNA（lcDNAlcDNA）开环开环DNADNA（ocDNAocDNA）三个基本步骤三个基本步骤质粒存的形态质粒存的形态 碱裂解法碱裂解法利用宿主菌巨大线状染色体利用宿主菌巨大线状染色体DNADNA与相对较小的闭与相对较小的
3、闭环双链质粒环双链质粒DNADNA的结构的差异来提取质粒的结构的差异来提取质粒DNADNA。碱变性碱变性DNADNA时，线状基因组时，线状基因组DNADNA变性充分而质粒变性充分而质粒DNADNA处于拓处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸中扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸中和），质粒和），质粒DNADNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋状分子，迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋状分子，而难于复性的长链线状的基因组而难于复性的长链线状的基因组DNADNA则与破裂的细胞壁、细菌则与破裂的细胞壁、细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被蛋白相互缠绕成大型复合物，被
4、SDSSDS包盖，当包盖，当K+K+取代取代Na+Na+时这些时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。质粒检测：质粒检测：电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。超螺旋、开环、线型三种构型。吸光值检测：采用分光光度计检测吸光值检测：采用分光光度计检测260nm260nm、280nm280nm波波长吸光值，若吸光值长吸光值，若吸光值260nm/280nm260nm/280nm的比值介于的比值介于1.71.71.91.9之之间，说明质粒质量较好，
5、间，说明质粒质量较好，1.81.8为最佳为最佳，低于，低于1.81.8说明有蛋白说明有蛋白质污染，大于质污染，大于1.81.8说明有说明有RNARNA污染。污染。型酶识别的型酶识别的DNADNA序列一般含有序列一般含有4 46 6个核苷酸。有的在识别个核苷酸。有的在识别顺序的对称轴上对双链顺序的对称轴上对双链DNADNA同时切割产生平末端；有的在识别顺同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末端序的双侧末端DNADNA双链产生粘性末端。双链产生粘性末端。型限制性内切酶需要型限制性内切酶需要Mg2+Mg2+激活，大部分激活，大部分型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或型酶所识别的序列具有反向对称
6、的结构，或称为回文结构。称为回文结构。质粒质粒DNADNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数，可被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切片断。量的酶切片断。本实验采用的本实验采用的EcoREcoR和和HindHind的识别序列和酶切位点分别为的识别序列和酶切位点分别为 GAATTC GAATTC 和和 AAGCTT AAGCTT CTTAAG TTCGAA CTTAAG TTCGAA DNADNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷
7、效应和分子筛效应。在碱性环境下，核酸分子之糖在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNADNA几乎具有等量几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，度下，DNADNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核
8、酸分子本分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。身的大小和构型。DNADNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子。共价闭环超螺分子。共价闭环超螺旋旋DNADNA直线直线DNADNA开环的双链环状开环的双链环状DNADNA。DNADNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNADNA的构象、所加电压、的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的
9、存在、电泳缓冲液的组成。电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间之间接含质粒的单菌落于接含质粒的单菌落于2ml LB Amp+液体培养基中液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜取取2.0mL菌液入菌液入2.0ml的的dorf管中管中 5000rpm、离心离心5min，弃上清，收集菌体弃上清，收集菌体200uL溶液溶液I+I+5uLRNA酶悬浮菌体（酶悬浮菌体（充分混匀充分混匀），冰上静置），冰上静置5min 加入加入400uL溶液溶液IIII（轻轻混匀轻轻混匀），），室温室温静置静置5mi
10、n裂解菌体裂解菌体 加入加入300uL300uL溶液溶液IIIIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置5min5min质粒质粒DNADNA复性复性三三 实验步骤实验步骤 4，10000rpm，离心离心10min，取取700L（注不要吸到沉淀物）上清到一新管（注不要吸到沉淀物）上清到一新管加加700L的的 氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇V:V24:1（混匀），冰上静置（混匀），冰上静置5min 4，10000rpm，离心离心10min，取取500L（注不要吸到沉淀物）上清到一新管（注不要吸到沉淀物）上清到一新管 加加1.0mL无水乙醇（充分混匀），无水乙醇（充分混匀），-20 放置20min
11、4，10000rpm，离心离心10min，弃上清，弃上清 加入加入500L 70%乙醇，将沉淀悬起乙醇，将沉淀悬起 4，5000 r/min离心离心5min，弃上清（用软纸将管内乙醇吸干）即可。，弃上清（用软纸将管内乙醇吸干）即可。取实验一中提取的质粒，向其中加入取实验一中提取的质粒，向其中加入10L10L灭菌的双蒸水使其充分灭菌的双蒸水使其充分溶解，测定其溶解，测定其dsDNAdsDNA浓度。然后按下表进行操作：浓度。然后按下表进行操作：实验组实验组对对照照组组(不做不做）Buffer40Ecol30Hind 30质质粒粒XXddH2O10-X20-X总总体体积积2020 充分混匀后于充分混
12、匀后于3737保温保温2-3h2-3h。（注最终反应体系中质粒浓度至（注最终反应体系中质粒浓度至少达到少达到1.2g/L1.2g/L）三三 实验步骤实验步骤 制胶制胶 1.0 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(50ml)凝胶板的制备凝胶板的制备 小心加入小心加入23lEB，摇匀（，摇匀（污染污染EB吸头，不宜再回收使用吸头，不宜再回收使用）点样点样 样品样品20l，与，与4l溴酚兰混匀溴酚兰混匀 (DNA maker 3l 加入加入10l水与水与4l溴酚兰混匀溴酚兰混匀)电泳电泳稳压稳压 80v，DNA向阳极移动向阳极移动,大约大约50-60min 观察和拍照观察和拍照254nm紫外灯下观察紫外灯下观察 四四 实验结果实验结果 五五 注意事项注意事项 1.1.质粒提取过程必需缓和，不能剧烈振荡。质粒提取过程必需缓和，不能剧烈振荡。2.2.操作过程避免污染，反应体系中各试剂用量准确。操作过程避免污染，反应体系中各试剂用量准确。3.3.EBEB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套!