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1、关于实验一质粒的提取现在学习的是第1页，共27页l 实验目的l 实验原理 l 实验仪器、材料与试剂 l 实验步骤 l 实验结果及讨论 现在学习的是第2页，共27页实验目的实验目的l了解碱法提取质粒的原理；了解碱法提取质粒的原理；l掌握碱法提取质粒的方法；掌握碱法提取质粒的方法；l掌握掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。琼脂糖电泳的原理和方法。现在学习的是第3页，共27页实验原理实验原理l质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室分子。碱裂解法提取质粒是实验
2、室常用的方法。常用的方法。l这种方法是根据共价闭合环状质粒这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与与线性染色体线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离在拓扑学上的差异来分离它们。它们。现在学习的是第4页，共27页结构的三大要素：结构的三大要素：l 多克隆位点l 选择标记（耐药性，LacZ）l 独立的复制单位种类：种类：l 质粒l 噬菌体l 酵母人工染色体（YAC）l 反转录病毒载体l 表达载体等现在学习的是第5页，共27页现在学习的是第6页，共27页pET-32a VectorThe pET System is the most powerful system yet developed for
3、the cloning and expression of recombinant proteins in E.coli.现在学习的是第7页，共27页pET-32 cloning/expression region现在学习的是第8页，共27页Vector(pET-32a)Gene fragment(SmPR10)pET-32a-SmPR10现在学习的是第9页，共27页 质粒的分离是利用质粒质粒的分离是利用质粒DNA与染色体与染色体DNA在在变性与复性变性与复性中的差异来达到的中的差异来达到的目的。目的。当菌体在当菌体在NaOH和和SDS溶液溶液(碱性条件碱性条件pH 12.5)中裂解时，蛋白质
4、与中裂解时，蛋白质与DNA发生发生变性，由于变性，由于染色体染色体DNA与质粒与质粒DNA拓朴构型不同拓朴构型不同，染色体，染色体DNA双螺旋结构双螺旋结构解开，而共价闭环质粒解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液pH恢复至中性时恢复至中性时,在高盐浓度的情况下在高盐浓度的情况下，染色体染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质并与蛋白质-SDS复合物等形成沉复合物等形成沉淀；不同的是，淀；不同的是，质粒质粒DNA复性迅
5、速而准确，保持可溶状态复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。用异丙醇或乙用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。4000kb1kb到到200kb现在学习的是第10页，共27页实验仪器、材料与试剂（一）（一）仪器仪器 1.恒温摇床 2.超净工作台 3.高压灭菌锅 4.高速台式离心机 5.微量取液器 现在学习的是第11
6、页，共27页现在学习的是第12页，共27页现在学习的是第13页，共27页现在学习的是第14页，共27页现在学习的是第15页，共27页（二）材料 l大肠杆菌E.coli DH 5含重组质粒lpET-32a-SmPR10现在学习的是第16页，共27页（三）试剂 l 1.LB液体培养基（液体培养基（1L）胰蛋白胨胰蛋白胨 10g 酵母提取物酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至加去离子水至800ml，搅拌，使溶质完全溶解，用，搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节调节pH值至值至7.0，加入去离子水至总体积为，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌升，高压蒸汽灭菌20 分钟。分钟。l
7、LB固体培养基（固体培养基（1L）在上述在上述LB液体培养基（液体培养基（1L）中加入琼脂粉）中加入琼脂粉15g。现在学习的是第17页，共27页2.溶液溶液：葡萄糖（：葡萄糖（50mmol/L）；）；TrisHCl（25mmol/L，pH8.0）；）；EDTA（10mmol/L）3.溶液溶液：NaOH（0.2mol/L）；SDS（1%，新鲜配制），新鲜配制）4.溶液溶液：60ml的的 5mol/L KAC ；11.5ml的冰醋酸的冰醋酸 ；28.5ml H2O溶液溶液I：低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡
8、萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。EDTA的作用是螯和掉的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用酶对质粒分子的降解作用。TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。范围。溶液溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH(pH12)的作用：破坏氢键，使的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。分子变性。溶液溶液III：由由KAc与与H
9、Ac组成，是组成，是pH值为值为5.5的高盐溶液。能中和溶液的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使的碱性，使DNA复性。但是质复性。但是质粒粒DNA与染色体与染色体DNA复性的速度不同。复性的速度不同。K+离子会与离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒粒DNA分离。分离。现在学习的是第18页，共27页5.氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成用无菌水配制成100 mg/m
10、l 溶液，置溶液，置-20冰箱保存备用。冰箱保存备用。6.RNaseA 将将RNA 酶酶 A溶于溶于10 mmol/L Tris.Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，中，配成配成10 mg/ml的浓度，于的浓度，于100加热加热15分钟，缓慢冷却至室分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于温，分装成小份保存于-20。7.酚酚/氯仿氯仿(1:1)，氯仿，氯仿/异戊醇异戊醇(24:1)，乙醇，乙醇，75%乙醇。乙醇。现在学习的是第19页，共27页实验步骤实验步骤 质粒的提取质粒的提取 l 1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入1-2ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml）中，3
11、7振荡培养过夜。l 2.将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，弃上清液。l 3.加入100 l SolutionI，涡旋使细胞充分悬浮。l 4.加入200 l SolutionII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀（注意动作轻），冰上放置5min。l 5.加入150 l SolutionIII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀（注意动作轻），冰上放置5min。现在学习的是第20页，共27页l 6.15,000rpm，离心10min，将上清移至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 l）。l 7.加入等体积酚
12、/氯仿（1:1），颠倒数次混匀（注意动作轻），12,000rpm，4，离心3min，取上清液。l 8.小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀，12,000rpm，4，离心3min，取上清液。现在学习的是第21页，共27页l 9.小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min，4离心，15,000rpm，10min。l 10.弃上清，加1ml 75%乙醇漂洗沉淀，4离心，10,000rpm，5min。l 11.去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真
13、空干燥沉淀。l 12.加入50 l TE buffer，室温振荡溶解质粒DNA。现在学习的是第22页，共27页培养细菌使质粒扩增培养细菌使质粒扩增1.挑取琼脂培养板上的单菌落至挑取琼脂培养板上的单菌落至2ml LB培养液中（含培养液中（含Amp100 g/ml)37摇荡培养过夜。摇荡培养过夜。2.取取1ml菌液转接到一个含有菌液转接到一个含有100 ml LB培养液三角瓶中培养液三角瓶中(含含 Amp100 g/ml）,37摇荡培养过夜。摇荡培养过夜。37振摇过夜振摇过夜37振摇过夜振摇过夜现在学习的是第23页，共27页l Tiangen质粒质粒DNA 小量提取试剂盒（小量提取试剂盒（实际用）
14、实际用）l 操作过程操作过程l 1.柱平衡：向柱平衡：向吸附柱吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入中（吸附柱放入收集管中）加入500 l 的的平衡平衡液液BL，12,000 rpm 离心离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。重新放回收集管中。l 2.将将1-2ml 过夜培养的细菌菌液加入过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中，离心管中，12,000rpm离心离心1分钟，并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤分钟，并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤2，以收集更多细菌，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。菌体。但勿
15、过量，以免影响提取质粒的质量。l 3.加加200 l 溶液溶液P1（用前检查是否已加入（用前检查是否已加入RNase A），重悬细菌体），重悬细菌体沉淀，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。沉淀，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。现在学习的是第24页，共27页l 4.加加200 l 溶液溶液P2，温和地温和地上下翻转上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意不次使菌体充分裂解。注意不要剧烈振动，以防止基因组要剧烈振动，以防止基因组DNA 被打断，注意不要让反应持续超过被打断，注意不要让反应持续超过5 分钟。分钟。l 5.加加300 l 溶液溶液P3，立即，立即轻柔轻柔颠倒离心管颠倒离心管6
16、-8 次，充分混匀，此时次，充分混匀，此时溶液应该出现白色絮状沉淀。溶液应该出现白色絮状沉淀。l 6.12,000rpm离心离心10 分钟。分钟。l 如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。l 7.将步骤将步骤6 离心后得到的离心后得到的上清液上清液转移到转移到吸附柱吸附柱CP3中，中，12,000rpm离心离心30-60秒，并弃去接液管内液体。秒，并弃去接液管内液体。l 8.向吸附柱向吸附柱CP3 内加内加600 l漂洗液漂洗液PW，12,000rpm 离心离心30-60 秒，并秒，并弃去收集管内废液。弃去收集管内废液。
17、l 9.重复重复第第8 步一次。步一次。现在学习的是第25页，共27页l 10.将吸附柱将吸附柱CP3 放入收集管中，放入收集管中，12,000 rpm 离心离心2分钟，目的是将吸附分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。洗液。l 11.将吸附柱将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加40 l洗脱缓冲液洗脱缓冲液EB，室温放置，室温放置2 分钟，分钟，12,000 rpm 离心离心2 分钟，将质分钟，将质粒溶液收集到离心管中。粒溶液收集到离心管中。l 12.提取的质粒提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于用，请保存于-20。现在学习的是第26页，共27页感谢大家观看现在学习的是第27页，共27页