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1、 预防兽医学实验预防兽医学实验 兽医微生物学和免疫学实验兽医微生物学和免疫学实验 实验七实验七 凝集试验凝集试验 实验七、凝集试验实验七、凝集试验 一、实验目的一、实验目的 1、掌握平板凝集试验和试管凝集试验、掌握平板凝集试验和试管凝集试验的的原理原理及及操作方法操作方法。2、熟悉、熟悉凝集价概念凝集价概念及实验结果及实验结果判定方判定方法法。实验七、凝集试验实验七、凝集试验 二、实验原理二、实验原理 颗粒性抗原颗粒性抗原（完整的病原微生物或（完整的病原微生物或红细胞等）与红细胞等）与相应抗体相应抗体结合，在有结合，在有电解电解质质存在的条件下，经过一定时间，出现存在的条件下，经过一定时间，出
2、现肉眼可见的凝集小块肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。可可分为分为直接凝集反应直接凝集反应和和间接凝集间接凝集反应两类。反应两类。实验七、凝集试验实验七、凝集试验 直接凝集反应：直接凝集反应：颗粒状抗原（如细菌、红颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。分分为玻片法和试管法。玻片法是一种定性试验方法，为玻片法和试管法。玻片法是一种定性试验方法，该该法简便快速，一般用于菌种分型、测定人类红细胞的法简便快速，一般用于菌种分型、测定人类红细胞的ABO血
3、型等。血型等。试管法是一种定量试验的经典方法。试管法是一种定量试验的经典方法。间接凝集反应：间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。在有电介质表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。在有电介质存在的适宜条件下，即可发生凝集，存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反称为间接凝集反应应。该方法敏感性比直接凝集反应高。该方法敏感性比直接凝集反应高。实验七、凝集试验实验七、凝集试验 三、实验准备三、实验准备 1、器材、器材 恒温培养箱、移液器（恒温培养
4、箱、移液器（100L、1000L），玻板，载玻，玻板，载玻片，小试管，试管架，片，小试管，试管架，牙签或火柴棒，记号笔，酒精灯。牙签或火柴棒，记号笔，酒精灯。2、试剂、试剂 (1)布鲁氏菌病布鲁氏菌病虎红平板凝集抗原虎红平板凝集抗原 (2)布鲁氏菌病布鲁氏菌病试管凝集抗原试管凝集抗原 (3)布鲁氏菌标准阳、布鲁氏菌标准阳、阴性及待检血清阴性及待检血清 (4)鸡白痢平板凝集抗原鸡白痢平板凝集抗原 (5)鸡白痢标准阳、阴性血清及待检鸡全血鸡白痢标准阳、阴性血清及待检鸡全血 (6)0.5%石炭酸生理盐水石炭酸生理盐水等等 实验七、凝集试验实验七、凝集试验 四、实验内容及方法四、实验内容及方法（一）（
5、一）鸡白痢鸡白痢全血平板凝集试验全血平板凝集试验 参照农业部参照农业部 鸡伤寒和鸡白痢诊断技术鸡伤寒和鸡白痢诊断技术(NY/T 536-2017)。（二）布鲁氏菌病（二）布鲁氏菌病虎红平板凝集虎红平板凝集试验试验（RBPT）中华人民共和国中华人民共和国卫生行业标准卫生行业标准-布鲁氏菌病诊断（布鲁氏菌病诊断（WS 269WS 269-20192019）GB/T 18646GB/T 18646-2018 2018 动物布鲁氏菌病诊断技术动物布鲁氏菌病诊断技术 （三）布鲁氏菌病（三）布鲁氏菌病试管凝集试管凝集试验试验（SAT）实验七、凝集试验实验七、凝集试验 引自鸟伦吉如嘎等，畜牧与饲料科学，引自
6、鸟伦吉如嘎等，畜牧与饲料科学，2006年，第年，第2期。期。引自饶国利，引自饶国利，2014年，年，4（8）RBPT和和SAT检测方法阳性率有偏差。检测方法阳性率有偏差。实验七、凝集试验实验七、凝集试验 四、实验内容及方法四、实验内容及方法 （一）（一）鸡白痢全血平板凝集试验鸡白痢全血平板凝集试验 1、方法、方法 先在载玻片中间加鸡白痢先在载玻片中间加鸡白痢抗原抗原1滴滴(30微升微升)+等量的鸡全血等量的鸡全血 牙签混匀牙签混匀，2分钟后观察分钟后观察 2、判定、判定 在在5分钟之内判定结果，分钟之内判定结果，出现凝集现象的为阳出现凝集现象的为阳性，性，特征为特征为液体透明液体透明，抗原凝集
7、成颗粒状；，抗原凝集成颗粒状；不出现不出现凝集现象为阴性，凝集现象为阴性，液体仍均匀液体仍均匀混浊混浊。实验七、凝集试验实验七、凝集试验 鸡白痢平板凝集试验结果：鸡白痢平板凝集试验结果：阳性阳性 阴性阴性 实验七、凝集试验实验七、凝集试验 （二）布鲁氏菌病（二）布鲁氏菌病虎红平板凝集虎红平板凝集试验试验 1、定性试验、定性试验 在洁净玻璃板上加在洁净玻璃板上加布鲁氏菌病虎红平板抗原布鲁氏菌病虎红平板抗原30微微升升，再加，再加待检血清待检血清30微升微升，牙签混匀，牙签混匀，4分钟内判分钟内判定结果定结果，在阴、阳性血清对照成立的条件下，在阴、阳性血清对照成立的条件下，出现肉出现肉眼可见凝集者
8、判为阳性眼可见凝集者判为阳性，不出现肉眼可见凝集者判为，不出现肉眼可见凝集者判为阴性。阴性。实验七、凝集试验实验七、凝集试验 布鲁氏菌病平板凝集试验结果：布鲁氏菌病平板凝集试验结果：阴性阴性 阳性阳性 实验七、凝集试验实验七、凝集试验 （二）布鲁氏菌病（二）布鲁氏菌病虎红平板凝集虎红平板凝集试验试验 试剂名称试剂名称 第第1 1格格 第第2 2格格 第第3 3格格 第第4 4格格 阴性对照阴性对照 1 1、平板抗原、平板抗原 0.030.03 0.030.03 0.030.03 0.030.03 0.030.03 2 2、被检血清、被检血清 0.080.08 0.040.04 0.020.02
9、 0.010.01 阴性血清阴性血清 血清稀释倍数血清稀释倍数 1:251:25 1:501:50 1:1001:100 1:2001:200 2、定量试验、定量试验 按表加入各物，用牙签从第按表加入各物，用牙签从第4格开始混匀，再到第格开始混匀，再到第3格、格、第第2格、第格、第1格依次混匀。格依次混匀。5分钟内判定结果（分钟内判定结果（+以上）。以上）。单位单位:mL 实验七、凝集试验实验七、凝集试验 布病平板凝集反应结果布病平板凝集反应结果(1:25)+(1:50)+(1:100)+(1:200)+阴性对照阴性对照 实验七、凝集试验实验七、凝集试验 （三）布（三）布鲁鲁氏菌病氏菌病试管凝
10、集试管凝集试验试验 1、常量法：、常量法：单位单位:mL 试验号试验号 1 2 3 41 2 3 4 5 5 对照对照 稀释倍数稀释倍数 1:25 1:50 1:100 1:2001:25 1:50 1:100 1:200 抗原抗原 阳性血清阳性血清 阴性血清阴性血清 生理盐水生理盐水 被检血清被检血清 试管抗原试管抗原 0.92 0.5 0.5 0.50.92 0.5 0.5 0.5 0.08 0.5 0.5 0.5 0.08 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
11、0.50.5 0.5 0.5 各管加完后震荡，将其各管加完后震荡，将其置置37恒温箱作用恒温箱作用18-24小时，观小时，观察结果。察结果。结果判定结果判定 +弃弃 参照最新国标：参照最新国标：GB/T 18646GB/T 18646-2018 2018 动物布鲁氏菌病诊断技术动物布鲁氏菌病诊断技术 实验七、凝集试验实验七、凝集试验（三）布鲁氏菌病（三）布鲁氏菌病试管凝集试管凝集试验试验 2、微量法：、微量法：用用96孔微量反应板进行试验孔微量反应板进行试验 方法方法：（1）第第1孔加孔加184 L稀释液，第稀释液，第2孔孔-4孔各加孔各加100 L稀稀释液；释液；（2）用微量移液器取）用微量
12、移液器取受检血清受检血清16 L加入到第加入到第1孔，混匀。孔，混匀。（3）从第）从第1孔吸取孔吸取100 L混合液到第混合液到第2孔，混匀；如此孔，混匀；如此倍比倍比稀释稀释到第到第4孔，从第孔，从第4孔弃去混合液孔弃去混合液100 L。（4）分别取稀释的布病试管抗原，每孔各）分别取稀释的布病试管抗原，每孔各加加100 L，混匀。，混匀。（5）用塑料膜）用塑料膜封口封口后，置后，置湿盒于湿盒于37度温箱中度温箱中18-24h后观察结后观察结果。果。实验七、凝集试验实验七、凝集试验+:100%菌体凝集，菌体凝集，液体液体透明度好，透明度好，管底有大量伞状沉淀。管底有大量伞状沉淀。+：75%菌体
13、凝集，菌体凝集，液体液体透明较好透明较好，管底有中量伞状沉淀。，管底有中量伞状沉淀。+：50%菌体凝集菌体凝集，液体，液体半透明半透明，管底有少量伞状沉淀。，管底有少量伞状沉淀。+：25%菌体凝集菌体凝集，液体，液体较混浊，透明度差，较混浊，透明度差，管底沉淀物少。管底沉淀物少。-：阴性，液体均匀阴性，液体均匀混浊，不透明混浊，不透明，管底无凝集沉淀，管底无凝集沉淀 3、结果判定：、结果判定：+实验七、凝集试验实验七、凝集试验 （1）试验成立条件：）试验成立条件：阴性血清对照阴性血清对照和和抗原对照抗原对照不出现凝集，不出现凝集，阳性血清阳性血清的凝集价达到其标准效价滴度，则证明试验成立，的凝
14、集价达到其标准效价滴度，则证明试验成立，可以判定。否则，试验应重做。可以判定。否则，试验应重做。（2）凝集价：凝集价：以出现“以出现“+”以上凝集的最高血清稀释倍数以上凝集的最高血清稀释倍数为凝集价。为凝集价。人人和和大家畜（牛、马、骆驼大家畜（牛、马、骆驼）凝集价）凝集价1：100以上为阳性，以上为阳性，1：50为可疑。为可疑。猪、羊、狗猪、羊、狗等小家畜等小家畜1：50以上为阳性，以上为阳性，1：25为可疑。为可疑。可疑的半个月后重检，仍可疑，按具体情况而定可疑的半个月后重检，仍可疑，按具体情况而定。3、结果判定：、结果判定：实验七、凝集试验实验七、凝集试验 布病试管凝集反应结果：布病试管
15、凝集反应结果：+1：25 抗原抗原 对照对照+1：50+1：100-1：200 1 2 3 4 5 判读结果：判读结果：稀释倍数：稀释倍数：凝集价为凝集价为1：50 实验七、凝集试验实验七、凝集试验 五、注意事项五、注意事项 1、每次试验、每次试验应设标准阳性、阴性作为对照，并在应设标准阳性、阴性作为对照，并在对照成立的前提下判定结果。对照成立的前提下判定结果。2、抗原保存在抗原保存在28，用前置室温，用前置室温3060min，使，使用前摇匀，用前摇匀，如出现摇不散的凝块，不得使用。如出现摇不散的凝块，不得使用。3、被检血清必须新鲜，被检血清必须新鲜，无明显的溶血和腐败现象。无明显的溶血和腐败
16、现象。4、平板凝集反应在室温下，最好、平板凝集反应在室温下，最好35min内内记录结记录结果，如反应温度偏低，可于果，如反应温度偏低，可于58min内判定。内判定。实验七、凝集试验实验七、凝集试验 5、平板凝集反应适用于普查初筛平板凝集反应适用于普查初筛，筛选出的阳性反，筛选出的阳性反应血清，需做试管凝集试验，应血清，需做试管凝集试验，以试管凝集的结果以试管凝集的结果为被检血清的最终判定。为被检血清的最终判定。6、结果判为可疑时，隔结果判为可疑时，隔23周后采血重做。周后采血重做。阳性畜阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既对同群中既无临床症状又无凝集
17、反应阳性者，马、猪重检仍无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性。为阳性。实验七、凝集试验实验七、凝集试验 六、思考题六、思考题 1、影响凝集试验结果的因素主要有哪些、影响凝集试验结果的因素主要有哪些?2、凝集试验中为什么要设、凝集试验中为什么要设阴阴性、性、阳阳性血性血清清对照对照及抗原对照？及抗原对照？3、凝集试验在动物疫病诊断和净化方面、凝集试验在动物疫病诊断和净化方面有哪些有哪些实际意义。实际意义。实验七、凝集试验实验七、凝集试验 实验要求实验要求 1、以组为单位进行实验，、以组为单位进行实验，明天下午明天下午4：00到实验室观察凝集试验结果。到实验室观察凝集试验结果。2、观察、记录试验结果，完成实验报告及、观察、记录试验结果，完成实验报告及思考题。思考题。