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1、11第二章发酵过程的生物学基础22本章的教学内容第一节第二节第三节第四节第五节第六节发酵过程与微生物微生物的营养与培养基的设计微生物的生长模式及其动力学环境对微生物的影响代谢产物的代谢调控微生物代谢产物的过量产生33第一节 发酵过程与微生物.微生物与发酵.微生物细胞工厂44一、微生物与发酵 发酵工程是以微生物的生命活动为中心的 微生物的生物学性状和发酵条件决定了其相应产物的生成 工业上用的全部微生物都称为工业微生物，工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌 由于发酵工程本身的发展以及基因工程正在进入发酵过程，病毒、藻类等其它微生物也正在逐步地变为工业生产菌。55二、微生物细胞工厂
2、ADPNAD+ATP NADH NAD+H2O NADHATP氧化C4 CoACO2合成五碳糖(木糖、阿拉伯糖)ADP苯 C3 酮酸 C3 醇C5 糖P聚酮C3 酮粗原料 分解 H2CO2烷酸C4 CoANADP+还原 NAD+C1 酸NADPHNADH NAD+NADH裂解 氧化 转移C3 酮酸 C2 CoA C2 P C2 酸C4 糖PADPNAD+ADPNADHC3 NAD+NADH NAD+NAD+NADH ADP ATP 酸P H2OC6 酸 CO2平台转移 还原 裂解 还原 C4 酸 NAD+C5 酮酸C3 羟酮P C3 二醇 NADH将生物质原料各类组分，高效、定向合成燃料、材料
3、与各类化学品66减压精馏氧化氧化丙烯酸建筑、纺织、包装目前国内需求55万吨，产值88亿生物质生物炼制细胞工厂细胞工厂的生产模式实现One-Pot反应，缩短石油化学品生产的工艺流程，减少原油资源消耗，降低投资成本，减少污染与CO2排放。分离裂化分离分离分离选择性高效性含氧原料手性特征3-羟基丙酸石油77“微生物细胞工厂”概述 所谓“工厂”，就是能够生产或制造某种产品，或者进行某种处理程序的场所。因此,一般意义上的“工厂”应该具备特定的生产线，以及相应的动力等辅助系统，并且需要在一定的管理程序下才能正常运转，尤其重要的是“工厂”的各要素是根据人的意志“设计”进行的，可以根据需求设计生产线及辅助系统
4、等，并调控生产进度。“细胞工厂”也具备相应的组成要素，同样地，对于“细胞工厂”而言，其“可设计性”也是最重要的。这就首先需要了解菌体的遗传操作背景及原有的代谢途径或网络，因此细胞工厂的构建多在遗传背景相对清楚的模式菌的基础上进行。“工厂”组织和调控要素相应的细胞结构或调控要素生产线产物合成/底物降解途径动力等辅助系统胞内能量及辅因子系统管理程序胞内复杂的调节控制系统和对外界调控的响应能力根据需求设计生产线,并调控生产进度在遗传背景相对清楚的模式菌中构建新的代谢途径或进行代谢调控88“微生物细胞工厂”概述99“微生物细胞工厂”概述 野生型的菌株通常不能被称之为细胞工厂，主要是因为：野生型菌株代谢
5、速率和产物积累浓度低;野生型菌株的代谢产物往往是多种产品的混合物，直接用于工业生产时产品分离难度较大;野生型菌株主要依靠自然进化，速度慢，随机性强，不适合用于工业生产;多数微生物底物谱较窄，而生物质成分复杂，难以被一种微生物全部利用。1010复杂原料大量合成定向合成微量合成不能合成木糖阿拉伯糖半乳糖甘露糖葡萄糖(淀粉)产品合成能力精细原料细胞工厂的挑战目前生物炼制的经济竞争力与市场影响力有限原料利用能力葡萄糖浓度(g/L)100木糖时间木糖利用速率:葡萄糖1/4转化率:10-40%微生物产量(g/L)130150时间乙醇谷氨酸柠檬酸丁醇丁二酸乙烯(?)丙烯酸(?)3-羟基丙酸(?)1111出发
6、菌株设计策略细胞工厂的构建细胞工厂高效利用生物质高效生产目的产物遗传修饰代谢分析细胞工厂构建的策略1212细胞工厂的构建 基于基因组序列数据、代谢组分析和通量组计算重构代谢网络，是构建生物炼制细胞工厂的基础。在此基础上，利用计算生物学的方法，整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学所产生的数据，理解微生物对不同的细胞内和环境刺激的应答情况，利用适当的算法解析代谢网络结构，确定其中的关键节点，可以设计出新的代谢工程策略，设法调节代谢流向目标产物产量最大化的方向流动，从而构建高效的细胞工厂。第五节微生物的代谢调节在生物进化过程中，微生物细胞形成了愈来愈完善的代谢调节机制，在代谢繁殖过程中，能量的利用以及
7、对细胞生长繁殖过程中所需的各种物质的形成是非常合理和经济的，细胞经常处于平衡生长状态，不会有代谢产物的积累。13131414现代发酵工业要研究的主要内容就是通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径改变或代谢调节失控而获得某一发酵产物的过量产生。其方法大体可分为两类：改变产生菌的基因型而改变代谢途径；改变控制代谢速率，即影响基因型的表达。1515代谢调节(regulation of metablism）是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。酶量的调节酶活性的调节1616微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制，以期按照人们的愿望，生
8、产有用的微生物制品。1717代谢调节的方式酶合成的调节酶活性的调节方式初级代谢的调节次级代谢的调节1818一、代谢调节方式细胞透性的调节代谢途径区域化代谢流向的调控代谢速度的调控19191，细胞透性的调节细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式，由它控制着营养物质的吸收和产物分泌。代谢调节方式2020 例如，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌吸收乳糖是由渗透酶和环状AMP(cAMP)协同控制来完成的。cAMP的浓度是由腺苷酸环化酶(AC)的活性控制的，也就是说，乳糖的吸收受渗透酶和AMP环化酶的控制，调节蛋白通过磷酸化的
9、形式和腺苷酸环化酶（AC）或渗透酶结合，分别使腺苷酸环化酶活化或使渗透酶失活。当有葡萄糖时，乳糖的渗透酶以无活性状态存在，而腺苷酸环化酶也以非活性状态存在。代谢调节方式2121BrnEBrnFBrnQ代谢调节方式L-异亮氨酸的膜渗透情况22222，代谢途径区域化原核微生物细胞结构虽然简单，但也划分出不同的区域，对于某一代谢途径有关的酶系则集中某一区域，以保证这一代谢途径的酶促反应顺利进行，避免了其他途径的干扰。例如呼吸的酶系集中在细胞质膜上；而与蛋白质合成有关的酶系则位于核蛋白体上；分解大分子的水解酶，在革兰氏阴性菌里是位于壁膜间隙中，而革兰氏阳性菌则将这些水解酶类，分泌于胞外。代谢调节方式2
10、323在真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布。如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上；蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上；DNA合成的某些酶位于细胞核里。代谢调节方式2424细胞具有复杂的膜结构使其代谢活动只能在特定的部位上进行，即代谢活动是区域化的，其实质是控制酶与底物接触，使各个反应有序地进行。代谢调节方式2525糖途径;糖原合成;脂肪酸合成;细胞核:核酸合成线粒体:丙酮酸氧化;三羧酸循环;-氧化;呼吸链电子传递;氧化磷酸化内质网:蛋白质合成;磷脂合成酶定位的区域化代谢调节方式细胞质:酵解;磷戊26263，代谢流向的调控微生物在不同条件下可以通过控制各代谢途径中某个酶促反应的速率来控制
11、代谢物的流向，从而保持机体代谢的平衡。它包括两种形式由一个关键酶控制的可逆反应由两种酶控制的逆单向反应代谢调节方式2727 由一个关键酶控制的可逆反应 同一个酶可以通过不同辅基(或辅酶)控制代谢物的流向。例如，谷氨酸脱氢酶以NADP+为辅酶时，主要是催化谷氨酸的合成，当以NAD+为辅酶时，则催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通过不同的辅基来控制代谢物的流向。代谢调节方式2828 由两种酶控制的逆单向反应 逆单向反应是在生物体代谢的关键部位的某些反应，它是由两种各自不同的酶来催化的。即在一个“可逆”反应中，其中一种酶催化正反应，而另一种酶则催化逆反应。例如，葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖是由己糖激酶催
12、化的，而其逆反应则是由6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。6-磷酸果糖转化为1，6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的，逆反应则由1，6-二磷酸果糖酯酶催化。代谢调节方式29294，代谢速度的调控在不可逆反应中，微生物通过调节酶的活性和酶量来控制代谢物的流量。微生物在不同条件下能按照需要，通过激活或抑制原有酶的活性或通过诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代谢速度，使之高度经济有效地利用能量和原料进行生长繁殖。代谢调节方式3030二、酶合成的调节 酶合成的诱导 酶合成的阻遏31311，酶合成的诱导酶合成的调节32322，酶合成诱导的机制酶合成的调节33333，酶合成的阻遏酶合成的调节34344，酶合成阻遏的机制
13、酶合成的调节3535三、酶活性的调节概 念酶活性调节是指一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。影响因素底物和产物的性质和浓度环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等)其他的酶的存在调节方式激活已有酶的活性抑制已有酶的活性（一）激活激活：在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。代谢调节的激活作用：主要是指代谢物对酶的激活。前（体）馈激活，指代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代谢中间产物的反馈激活，指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用3636酶活性的调节A B G3737CDE+E
14、A B C D F+反馈激活和前（体）馈激活示意图+例1：糖代谢途径中丙酮酸积累激活丙酮酸羧化酶例2：乙酰CoA的积累激活PEP羧化酶3838酶的反馈激活葡萄糖丙酮酸乙酰CoA活化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸-酮戊二酸拧檬酸1，6-二磷酸果糖（二）抑制抑制：由于某些物质的存在，降低酶活性的现象。反馈抑制（feedback inhibition）：反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑 制。无分支代谢途径的调节有分支代谢途径的调节3939酶活性的调节1，无分支代谢途径的调节4040通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活性有抑制作用。酶活性的调节41
15、41-酮丁酸异亮氨酸用。TD苏氨酸酶活性的调节 例如，在大肠杆菌中，由苏氨酸(Thr)合成异亮氨酸(IIeu)时，异亮氨酸对催化反应途径中的第一步反应的苏氨酸脱氨酶(TD)有抑制作42422，有分支代谢途径的调节在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代谢途径中，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用，分支代谢的反馈调节方式有多种:顺序反馈抑制（sequential feedback inhibition）同工酶的反馈抑制（isoenzyme feedback inhibition）协同反馈抑制（conce
16、rted feedback inhibition）累积反馈抑制（cumulative feedback inhibition）超相加反馈抑制（cooperative feedback inhibition）酶活性的调节（1）顺序反馈抑制sequential feedback inhibition分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制途径中的第一个酶，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶有抑制作用。4343酶活性的调节4444例如，枯草杆菌在芳香族氨基酸合成中，色氨酸(Try)抑制邻氨基苯甲酸合成酶(AS)，苯丙氨酸(Phe)抑制预苯酸脱水酶(PT)，酪氨酸(Tyr)抑制预I：
17、7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶；II：邻氨基苯甲酸合成酶苯酸脱氢酶(PD)，预苯酸和分支酸又部分地抑制7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶(DS)。PDASPTPEP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：4-磷酸赤藓糖；DAHP：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸；CA：分支酸；Per：预苯酸；AA：邻氨基苯甲酸；HPPA：对羟基苯丙酮酸；PPA：苯丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Try：色氨酸；Phe：苯丙氨酸；4545（2）同工酶的反馈抑制isoenzyme feedback inhibition同功酶是指能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。其特点是：途径中第
18、一个反应被两个不同的酶所催化，一个酶被H抑制，另一个酶被G抑制。只有当H和G同时过量才能完全阻止A转变为B。4646例如，大肠杆菌以天门冬氨酸为前体合成苏氨酸(Thr)、异亮氨酸(Ileu)、甲硫氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)的代谢途径中有三种天门冬氨酸激酶的同功酶(AKI、AKII和AKIII)和两种高丝氨酸脱氢酶的同功酶(HSDHI和HSDHII)。其中AKI和HSDHI受到苏氨酸、异亮氨酸的反馈抑制和阻遏，AKII和HSDHII受甲硫氨酸的反馈抑制和阻遏；AKIII受赖氨酸的反馈抑制和阻遏。4747（3）协同反馈抑制concerted feedback inhibition在分支代谢系
19、统中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，如果末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。4848 例如，荚膜红假单胞菌中天门冬氨酸族氨基酸生物合成途径中，天门冬氨酸激酶(AK)是受末端产物赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。（4）累积反馈抑制cumulative feedback inhibition在分支代谢途径中各种末端产物单独过量时，它们各自能对途径中的第一个反应的酶仅产生较小的抑制作用。一种末端产物单独过量并不影响其它末端产物的形成，只有当几种末端产物同时过量时，才对途径中的第一个酶产生较大的抑制。4949酶活性的调节50例如，大肠杆菌谷氨酰胺合成酶(GS)活性的
20、调节是一个典型的累积反馈调节的例子。谷氨酰胺由谷氨酸、铵和ATP合成。谷氨酰胺中的酰胺基是色氨酸、组氨酸、氨基甲酰磷酸、6-磷酸葡萄糖胺、CTP、AMP、GMP等化合物生物合成过程中的氮源。谷氨酰胺合成酶被谷氨酰胺代谢的每种末端产物以及丙氨酸和甘氨酸所累积抑制。谷氨酰胺合成酶对这些抑制物中的每一种末端产物均有特异的结合部位。当上述8种末端产物同时过量都与酶结合时，谷氨酰胺合成酶的活性将受到最大的抑制。50（5）超相加反馈抑制cooperative feedback inhibition超相加反馈抑制是一种既不同于协同反馈抑制又不同于累积反馈抑制。对一个分支代谢途径中，几种末端产物单独过量时，仅
21、产生对共同途径的第一个酶部分的抑制。如果每种末端产物都过量时，其抑制作用则超过各种末端产物单独过量时抑制的总和。5151酶活性的调节52例如，在嘌呤核苷酸的生物合成途径中，催化第一步反应的酶，5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的酰胺基转移酶，可被各种嘌呤核苷酸产物(如AMP、GMP)所抑制。例如，一定量的GMP或AMP仅能抑制5-磷酸核糖-1-焦磷酸酰胺基转移酶活力的10，而当二者混合时，则可抑制其酶活力的50。因为这些嘌呤核苷酸与5-磷酸核糖-1-焦磷酸并无结构相似性，又因该酶是一种调节酶，GMP和AMP可能分别结合在该酶的不同部位上。5253535，酶活性调节的分子机制解释酶活性调节机制
22、的理论：别构调节理论(其核心是酶分子构象的改变)酶分子的化学修饰理论(其核心是酶分子结构的改变)。酶活性的调节5454四、初级代谢的调节Regulation of Primary Metabolism产能代谢的调节：能荷调节(Energy ChargeRegulation)核蛋白体合成的调节（Regulation of RibosomeSynthesis）氨基酸、核苷酸合成代谢的调节（Regulation ofamino acids and nucleotide metabolism）5555能荷调节(Energy Charge Regulation)能荷：即指细胞中ATP、ADP、AMP系统
23、中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度 能荷的大小与细胞中ATP、ADP和AMP的相对含量有关。当细胞中全部腺苷酸均以ATP形式存在时，则能荷最大，为100%，即能荷为满载。当全部以AMP形式存在时，则能荷最小，为零。当全部以ADP形式存在时，能荷居中，为50%。若三者并存时，能荷则随三者含量的比例不同而表现不同的百分值。5656能荷调节(Energy Charge Regulation)研究证明，细胞中能荷高时，抑制了ATP的生成，但促进了ATP的利用，也就是说，高能荷可促进分解代谢，并抑制合成代谢。相反，低能荷则促进合成代谢，抑制分解代谢。能荷调节是通过ATP、ADP和AMP分子对某些酶分子
24、进行变构调节进行的。例如糖酵解中，磷酸果糖激酶是一个关键酶，它受ATP的强烈抑制，但受ADP和AMP促进。丙酮酸激酶也是如此。在三羧酸循环中，丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和-酮戊二酸脱氢酶等，都受ATP的抑制和ADP的促进。呼吸链的氧化磷酸化速度同样受ATP抑制和ADP促进。5757五、次级代谢的调节Regulation of SecondaryMetabolism初级代谢对次级代谢的调节碳代谢物的调节作用氮代谢物的调节作用磷酸盐的调节作用次级代谢中的诱导作用及产物的反馈作用次级代谢中细胞膜透性调节5858初级代谢对次级代谢的调节 许多次级代谢产物的基本结构是由少数几种初级代谢产
25、物构成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切关系的。因此次级代谢必然会受到初级代谢的调节。例如青霉素的合成会受到赖氨酸的强烈抑制，而赖氨酸合成的前体-氨基己二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用，并能刺激青霉素的合成。这是因为-氨基己二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。如果赖氨酸过量，它就会抑制这个反应途径中的第一个酶，减少 -氨基己二酸的产量，从而进一步影响青霉素的合成。5959碳源代谢产物的调节 碳分解代谢产物调节指能迅速被利用的碳源(葡萄糖)或其分解代谢产物，对其他代谢中的酶(包括分解酶和合成酶)的调节。分为分解产物阻遏和抑制两种。
26、葡萄糖是菌体生长良好的碳源和能源，但对青霉素、头孢菌素、卡那霉素、新霉素、丝裂霉素等都有明显降低产量的作用。6060氮代谢物的调节作用 在次级代谢中，氮分解代谢产物调节，即被迅速利用的氮源(氨)抑制作用于含底物的酶(蛋白酶、硝酸盐还原酶、酰胺酶、脲酶、组氨酸酶)的合成。在次级代谢中，其阻遏作用也确实存在。在抗生素生产中使用黄豆饼粉就是由于它缓慢分解成有阻遏作用的氨基酸和氨，防止或减弱氮分解代谢产物阻遏作用的结果。6161磷酸盐的调节 磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节抗生素生物合成的重要参数。其机制按效应剂说有直接作用，即磷酸盐自身影响抗生素合成，和间接作用，即磷酸盐调节胞内其
27、他效应剂(如ATP、腺苷酸能量负荷和cAMP)，进而影响抗生素合成。已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大环内酯等32种抗生素的合成产生阻抑作用。6262细胞膜透性的调节 外界物质的吸收或代谢产物的分泌都需经细胞膜的运输，如发生障碍，则胞内合成代谢物不能分泌出来，影响发酵产物收获，或胞外营养物不能进入胞内，也影响产物合成，使产量下降。如在青霉素发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。如果输入硫化物能力增加，硫源供应允足，合成青霉素的量就增多。6363第六节微生物代谢产物的过量产生提高初级代谢产物产量的方法提高次级代谢产物产量的方法高浓度微生物的培养代谢工程系统生
28、物学6464一、提高初级代谢产物产量的方法1，使用诱导物 水解酶类大都属诱导酶类，因此向培养基中加入诱导物就会增加胞外酶的产量。如加入槐糖(1，2-D-葡二糖)诱导木霉菌的纤维素酶的生成，木糖诱导半纤维素酶和葡萄糖异构酶的生成等。诱导物的浓度过高及能被迅速利用时，会发生酶合成的阻遏，这在纤维二糖对纤维素酶的产生，木二糖对半纤维素酶产生中都己观察到，这也是使用诱导物时应予注意的。65652，除去诱导物选育组成型产生菌 在发酵工业中，要选择到一种廉价、高效的诱导物是不容易的，分批限量加入诱导物在工艺上也多不便，更为有效的方法是改变菌株的遗传特性，除去对诱导物的需要，即选育组成型突变株。通过诱变处理
29、，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，都可达到此目的。提高初级代谢产物产量的方法6666 设计选育组成型突变株的方法的原则是创造一种利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型的选择优势以及适当的识别两类菌落的方法，从而把产生的组成型突变株选择出来。连续培养法 交替培养法 在平板上识别组成型突变株的方法：透明圈、变色圈。提高初级代谢产物产量的方法67673，降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生 高分子的多糖类、蛋白质等的分解代谢产物(如能被迅速利用的单糖、氨基酸以及脂肪酸、磷酸盐等)都会阻遏分解其聚合物的水解酶类的生成。因此
30、用限量流加这类物质或改用难以被水解的底物的方法，都可减少阻遏作用的发生，而获得较高的产量。提高初级代谢产物产量的方法68684，解除分解代谢阻遏筛选抗分解代谢阻遏突变株 从遗传学角度来考虑，如调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白失活；不能与末端分解代谢产物结合，或操纵基因发生突变使阻遏蛋白不能与其结合，都能获得抗分解代谢阻遏的突变株。前者为隐性突变，后者为显性突变，都能由此导致酶的过量产生，加速代谢产物合成速度。提高初级代谢产物产量的方法6969 可以直接以末端代谢产物为底物来筛选抗阻遏突变株，如以葡萄糖、甘油为碳源筛选纤维系酶抗阻遏突变株。更多地是利用选育结构类似物抗性菌株的方法。选育结构类似
31、物抗性菌株的方法所依据的机制是：结构类似物由于在分子结构上与分解代谢的未端产物相类似，因此、它也能与阻遏蛋白相结合，如调节基因发生突变而使阻遏蛋白不能与结构类似物结合，即出现抗性菌株。由于分子结构上的类似，这种抗性菌株产生的阻遏蛋白也不能与正常的分解代谢产物相结合，即同时也具有对相应的分解代谢产物阻遏作用的抗性，而能导致相应酶类的过量合成。提高初级代谢产物产量的方法7070结构类似物及代谢末端产物提高初级代谢产物产量的方法71715，解除反馈抑制筛选抗反馈抑制突变株 选育对末端产物有抗性的突变株 如天冬氨酸激酶是赖氨酸生物合成途径中的调节酶，由黄色短杆菌分离到对赖氨酸的类似物(2-氨基半胱氨酸
32、)有抗性的突变株，它对天冬氨酸激酶的反馈抑制不敏感，赖氨酸的产量可达57mgm1。提高初级代谢产物产量的方法72726，防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株 选育双重营养缺陷型；可在培养液中加入适量结构类似物，以防止抗结构类似物的高产菌株的回复突变株的增殖；利用高产株和回复突变株对抗生素敏感性的不同，加适量抗生素防止回复株增殖；负变菌株的回复突变株可用来提高代谢产物的过量产生。提高初级代谢产物产量的方法73737，改变细胞膜的通透性 微生物细胞吸收作为代谢所需要的底物和离子是依靠定位在细胞膜上的主动输送系统来进行，与产能代谢过程相偶联。输送系统有高度的专一性，这主要取决于其蛋白质的组成
33、，即透性酶。细胞内形成的代谢产物排出细胞时，也与细胞膜的结构有关。当控制物理、化学条件或者筛选细胞膜、细胞壁结构组成的突变株以改进物质的进出速率。影响代谢过程时，都有可能造成代谢产物的过量生产。提高初级代谢产物产量的方法74748，筛选抗生素抗性突变株 抗生素种类繁多，其抑制微生物代谢的机制各不相同，一些主要抗生素的作用机制已比较清楚。筛选抗生素抗性突变体，也能取得由此而改变代谢调节，获得过量生产的结果。衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的生成。枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的-淀粉酶的产量较亲株提高了5倍（分泌机制改变的结果）抗利福平的蜡状芽孢杆菌的无芽孢突变株的-淀粉酶产量提高了7倍（芽孢形成的延迟利于
34、-淀粉酶的形成，而抗利福平的突变株往往失去了形成芽孢的能力）提高初级代谢产物产量的方法75759，选育条件抗性突变株 因环境不同，能表现为“野生型”菌株的特性和突变型菌株特性的突变被称为条件抗性突变或称为条件致死突变。其中温度敏感型突变常被用于提高代谢产物的产量。适于在中温条件下(如37C左右)生长的细菌，经诱变后可得到在较低温度下生长而在较高温度(如37C以上)不能生长的突变株，即温度敏感型突变株。这是由于某一酶蛋白结构改变后，在高温条件下活力丧失的缘故。如此酶为蛋白质、核苷合成途径上的酶，则此突变株在高温条件下的表型就是营养缺陷型。提高初级代谢产物产量的方法767610，调节生长速率 在酶
35、的诱导合成研究中发现，一些物质具有诱导效应及难被利用；与其只能维持较低的生长速率有关。而起阻遏作用的物质则都是易被迅速利用和能维持高的生长速率。估计这是因为诱导、阻遏的发生都与产能代谢有关而造成的。因此，改变培养条件如温度、供氧量等以控制生长速率，也能获得一定效果。里氏木霉纤维素酶的大量合成是在菌体大量形成后，如控制它的比生长速率近于零，则能在一较长时间内持续合成纤维素酶并获得高产。提高初级代谢产物产量的方法777711，加入酶的竞争性抑制剂 生物化学上把底物和抑制剂与酶相结合时呈现的互相排斥现象称为竞争性抑制，即酶与抑制剂结合后就不能与底物相结合，反之亦然。葡萄糖经不完全氧化(酵解)生成丙酮
36、酸，脱羧生成乙酰辅酶A，进入TCA循环。乙酰辅酶A与草酰乙酸经柠檬酸合成酶催化，把乙酰基由乙酰辅酶A转移至草酰乙酸而成为柠檬酸。柠檬酸又因乌头酸酶的存在而和它的异构体顺乌头酸、异柠檬酸呈平衡。单氟乙酸在微生物细胞内可转变为单氟柠檬酸，此酸与乌头酸酶有竞争性抑制，因此，向培养基中加入单氟乙酸可导致柠檬酸的积累，减少异柠檬酸的生成。由此，筛选不能利用柠檬酸或对单氟乙酸敏感的突变袜，都达到了提高柠檬酸产量和减少异柠檬酸生成的结果。这些突变株的乌头酸酶的活力都比较低。提高初级代谢产物产量的方法7878二、提高次级代谢产物产量的方法1，次级代谢物合成的特点次级代谢物合成过程远较初级代谢产物复杂；次级代谢
37、产物需要复杂的营养条件；在分批培养条件下，次级代谢产物一般都是在菌体生长的峰值出现后才大量合成。79792，常用的提高次级代谢产物产量的方法提高次级代谢产物产量的方法1，补加前体类似物 在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的有效方法。如青霉素G的生产中，苯乙酰-CoA是限速性因子，补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。次级代谢产物形成中并不是所有前体类似物都是限制性因子。加入前体提高产量的效果更取决于总体代谢的调节水平。前体物质本身是否易于得到等。这都是在生产应用中需综合考虑的。8080提高次级代谢产物产量的方法2，加入诱导物 把一些对次级代谢产物产生有诱导
38、作用的物质加入发酵培养基中会增加产量。如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素C，加入巴比妥可提高利福霉素产量等。但在工业生产中还未普遍应用此技术，而只是在选择培养基组成时给以考虑。81813，防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生 青霉素发酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以减少碳分解阻遏的发生，是一项很有效的提高产量的方法。使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源，葡萄糖与麦芽糖、葡萄糖与蔗糖、葡萄糖与淀粉混合碳源的利用，也都能减少碳分解阻遏的发生。加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减缓，可增加金霉素的产量。提高次级代谢产物产量的方法82824，防止氮、磷代谢阻遏的发生 避免使用高浓度的铵盐做
39、氮源以防止氮代谢阻遏的发生，是抗生素发酵工业生产中比较成熟的经验。在抗生素产生期如补加氮源则会造成发酵逆转，返回生长期，抗生素的产量会大为减少。使用亚适量(对菌体生长)的磷酸盐，亦是抗生素发酵工业中遵循的原则之一。为防止氮、磷分解阻遏的发生，应选用黄豆饼粉、蛋白胨类物质为主要原料，而尽量少用易被迅速利用的无机氮源。提高次级代谢产物产量的方法83835，筛选耐前体或前体类似物的突变株 加入前体有提高次级产物产量的效果；但过量对菌体又会有毒。筛选对前体育抗性的突变株以减少或消除前体的反馈阻遏，从而可获得高产。如抗苯乙酸的青霉突变株，其青霉素的产量会增加。半胱氨酸、缬氨酸是-内酰胺类抗生素的前体，筛
40、选上述氨基酸的结构类似物，三氟亮氨酸、D-缬氨酸的抗性菌株，其-内酰胺类抗生素产量会提高。提高次级代谢产物产量的方法84846，选育抗抗生素突变株 链霉素、氯霉素、金霉素筹多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。一株高产抗生素产生菌，必然应具备对自身所分泌的抗生素的抗性。筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株产量有数倍增加的实验室结果已有不少报道。提高次级代谢产物产量的方法85857，筛选营养缺陷型的回复突变株 次级代谢产物都来自初级代谢产物，因此其营养缺陷型的产量一般都很低，但其回复突变型中却有不少获得高产的例子，其机制尚不清楚，估计是次级代谢产
41、物或其前体合成的反馈抑制被解除。在金霉素产生菌选育中，运用此方法曾获得高产菌株。提高次级代谢产物产量的方法86868，抗毒性突变株的选育 重金属离子、羟胺类物质对-内酰胺类抗生素产生菌有毒，但与抗生素相结合可解毒。选择适当浓度的此类毒性物质使其恰好抑制产生菌生长，在此条件下能生长的菌株，应为抗生素类物质过量产生的突变株。曾由头孢霉素C对重金属离子的抗性突变株中选育到高产菌株。提高次级代谢产物产量的方法8787 以上主要是从微生物的代谢调节机制出发探讨获得代谢产物过量生产的方法。但是，微生物代谢产物特别是次级产物形成的途径和调节控制机制是相当复杂的，研究得比较清楚的只是少数。因此，上述方法的应用
42、往往也是经验性的。在生产实践中为提高微生物产品产量和品质经常使用的方法是诱变后随机筛选和发酵条件的优化。近年来运用DNA重组的方法以获得代谢产物的过量生产是很活跃的研究领域。8888三、高浓度微生物的培养high cell-density culture 1，为什么要采用高浓度微生物的培养？微生物液体发酵大都采用分批培养，这种培养方式的缺点是：发酵液中最终细胞浓度不高。如果通过改进工艺技术，使发酵液中微生物细胞增殖到很高的浓度，那么，高浓度的细胞将会产生高浓度的发酵产物，这样就可以大大提高发酵设备的利用率，降低生产成本。基于这种目的，人们开始研究微生物高细胞浓度的培养技术。采用高细胞浓度培养技
43、术，发酵液中菌体浓度比分批式培养可高10倍以上。例如用高细胞浓度连续培养技术，培养大肠杆菌HBl01(pPAKS2)，可得到95gL的菌体。用同样的方法培养酒精酵母可得到219gL的菌体。而一般用分批法培养酵母和细菌，得到的菌体浓度仅为10gL左右。89892，高细胞浓度培养技术的原理：采用一定的工艺技术，保证微生物生长的适宜条件，延长微生物的指数增殖过程，从而得到高浓度的细胞。3，高细胞浓度培养技术的优点可大大提高发酵设备的利用率节省能源90904，高浓度细胞培养的方法流加培养高细胞浓度连续培养菌体循环利用等高浓度微生物的培养9191实现对发酵过程的控制，如控制代谢途径、菌体比生长速率等无需
44、增添设备解除底物抑制解除分解代谢阻遏解除葡萄糖效应高浓度微生物的培养（1）流加培养优 点9292流加培养的控制方式无反馈控制恒速流加变速流加指数流加高浓度微生物的培养9393反馈控制DO-恒定控制pH-恒定控制CO2生成速率控制细胞浓度控制底物浓度控制高浓度微生物的培养原理无菌培养基以一定速度连续补入发酵液，同时采用离心。膜过滤等方法，回收排出液中的细胞，使之重新进入发酵液中，这样微生物就可以在发酵液中高浓度地积累。高浓度的细胞产生大量的发酵产物，这些产物随排出液排出进入提取过程，同时对细胞生长起抑制作用的代谢产物也被排出。9494高浓度微生物的培养（2）高浓度细胞连续培养9595除去抑制物质
45、的方法透析培养萃取发酵过滤培养高浓度微生物的培养9696（3）菌体循环利用这种方法大致过程是：待分批发酵终了将菌体与发酵液分离，收集的菌体经去杂菌等处理后返回发酵罐，再加入无菌培养基进行第二批发酵，因发酵液中菌体浓度很高，故发酵时间可大大缩短。第二批发酵终了，进行同样处理，然后再开始第三批发酵；这种技术与前面所述两种技术原理不同，但也能起到缩短发酵时间、提高设备利用率的作用。高浓度微生物的培养9797（4）高细胞浓度培养中的问题 培养基流加控制与其他条件控制 菌体分离装置的效能 菌种退化高浓度微生物的培养9898四、代谢工程Metabolic engineering Targeted impr
46、ovement of cellularactivities by manipulation of enzymatic,transport,and regulatory functions ofthe cell with the use of rDNA technology.Jay Bailey 1991.Toward a science of metabolicengineering.Science 252:.16681675基本思想是：根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤，进行遗传操作9999代谢工程：定向改造微生物的自然能力以生产(降解)某种物质为目标的工业生物技术，需要 拓展底物利用能
47、力和范围 引入新的合成途径，或延伸已有途径 减少副产物形成；提高产量、产率和生产强度 改善细胞生理功能传统育种：随机突变，非理性设计代谢工程：定向遗传修饰，理性设计原料代谢工程策略丙酮碳水化合物丁醇C3 酮C6 糖P利用系统生物学手段，发现新C6 糖PC6 糖PC3 醛PC3 羟酮PC3 酮酸C3 酮酸PC4 酸C3 二醇C4 醇C2 P C2 酸C2 醛 C2 醇C5 酮酸C4 CoA100100C4 CoAC2 CoA C6 酸C3酸P的支路途径和调控位点设计新的代谢工程策略 C3 烯酸代谢工程策略碳水化合物原料C3 酮C6 糖PC6 糖PC6 糖PC3 醛PC3 羟酮PC4 醇C2 P
48、C2 酸C2 醛 C2 醇C5 酮酸C4 CoA101101C3 羟酸C3酸PC3 烯酰CoAC4 CoAC3 酮酸 C2 CoA C3 酮酸PC6 酸C4 酸C3 二醇丙烯酸实现代谢途径重构丙酮丁醇遗传修饰出发菌株设计策略高效生产菌株代谢分析代谢工程的基本思路 设计策略是基础 遗传修饰是关键102102103103代谢工程设计 改变代谢流 扩展代谢途径 构建新的代谢途径1041041，改变代谢途径 改变代谢途径是指改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成，以达到提高目标产物的目的。改变代谢途径有各种方法，如加速限速反应、改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法。1
49、05105（1）加速限速反应 最成功的一个例子是头孢霉素C的代谢工程菌的构建。青霉素N是头孢霉素合成的中间体。当用顶头孢霉发酵时，发现了青霉素N的积累，这表明下一步酶反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤。因此克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF，并导入顶头孢中，所得转化子的头孢霉素C产量提高了25，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。头孢霉素C的代谢工程菌的构建-氨基己二酸中间产物克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF青霉素N限速步骤头孢霉素C所得转化子头孢霉素C产量提高了25，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。106106107107（2）改变分支代谢途径流
50、向 是指提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性，在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势，亦可提高目的末端代谢产物的的产量。108108 如：赖氨酸合成，选育解除反馈抑制和缺失高丝氨酸脱氢酶的突变株，提高了赖氨酸的产量。而为了获得苏氨酸的高产菌株，以解除了反馈抑制的赖氨酸产生菌棒状杆菌为宿主，转入高丝氨酸脱氢酶基因，结果使原来不产生苏氨酸的赖氨酸产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L，而苏氨酸产量增加到52g/L，使赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。109109高丝氨酸脱氢酶基因赖氨酸产生菌棒状杆菌 产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L，苏氨酸产量增加到52g/L，赖氨酸产生菌转变成