发酵过程的生物学基础精选PPT.ppt

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1、关于发酵过程的生物学基础第1页,讲稿共106张,创作于星期日本章的教学内容第一节发酵过程与微生物第二节微生物的营养与培养基的设计(自学复习)第三节微生物的生长模式及其动力学(自学复习)第四节环境对微生物的影响(自学复习)第五节代谢产物的代谢调控第六节微生物代谢产物的过量产生第2页,讲稿共106张,创作于星期日第一节第一节第一节第一节 发酵过程与微生物发酵过程与微生物发酵过程与微生物发酵过程与微生物 o.微生物的概念(自学复习)o.微生物的种类(自学复习)o.微生物的特点(自学复习)o.微生物与发酵第3页,讲稿共106张,创作于星期日一、微生物的概念o微生物(Microorganism,micr

2、obe)o是指一大类形体微小、结构简单的低等生物的总称。第4页,讲稿共106张,创作于星期日微生物的概念三个要点:小:观察借助光镜;测量单位为微米或纳米;简:简单多细胞;单细胞;无细胞结构低:进化程度低,为原始的生命形式;第5页,讲稿共106张,创作于星期日1.微生物小的直观感觉真核细胞型原核细胞型电镜微生物的相对大小肉眼光学显微镜可见范围病毒微生物的概念第6页,讲稿共106张,创作于星期日2.微生物的 细胞类型真核细胞的主要特征:有核膜,核仁,染色体;有细胞器;核糖体为80S;微生物的概念第7页,讲稿共106张,创作于星期日微生物的细胞类型原核细胞的主要特征:无核膜、核仁、染色体,仅有裸露的

3、DNA链形成的核区域,称核质体;无细胞器;核糖体为70S;微生物的概念第8页,讲稿共106张,创作于星期日二、微生物的种类2、真核生物 真菌(霉菌、酵母菌等)、原生动物、单细胞藻类;3、非细胞生物 病毒、类病毒、拟病毒、朊病毒等;1、原核生物 细菌、放线菌、衣原体 支原体、立克次氏体、蓝细菌;第9页,讲稿共106张,创作于星期日各种“视野”下的细菌光镜暗视野荧光透射电镜超薄切片冷冻切片扫描电镜DNA蛋白质复合物微生物的种类第10页,讲稿共106张,创作于星期日电镜下的微生物曲霉阿米巴草履虫酵母菌微生物的种类第11页,讲稿共106张,创作于星期日放线菌的的形态第12页,讲稿共106张,创作于星期

4、日1.1.细菌细菌(Bacterium)Bacterium)(1)形态)形态球形杆形弧形螺旋形发酵工业常用微生物的形态特征第13页,讲稿共106张,创作于星期日1.细菌(Bacterium)Bacterium)(1)形态球形杆形弧形螺旋形发酵工业常用微生物的形态特征第14页,讲稿共106张,创作于星期日(2)结构基本结构:细胞壁;细胞膜;细胞质;核质体;特殊结构:荚膜;芽孢;鞭毛;发酵工业常用微生物的形态特征第15页,讲稿共106张,创作于星期日(3)培养特征固体培养基上:菌落(colony):指微生物细胞在一定条件下,在固体培养基表面形成的肉眼可见的微生物群体。若来自一个细胞,则为纯培养或称

5、克隆(clone)。菌苔(lawn):大量细菌的菌落连成一片。发酵工业常用微生物的形态特征第16页,讲稿共106张,创作于星期日液体培养基上 均匀混浊;沉淀生长;表面生长。(3)培养特征发酵工业常用微生物的形态特征第17页,讲稿共106张,创作于星期日(2)结构o典型结构:细胞壁;细胞膜;细胞核;液泡;线粒体;内质网;核糖体;微体;微丝;内含物发酵工业常用微生物的形态特征第18页,讲稿共106张,创作于星期日三.霉菌形态发酵工业常用微生物的形态特征第19页,讲稿共106张,创作于星期日四、微生物的特点o体积小;o种类多;o分布广;o繁殖快;o便于培养;o容易发生变异;o在生产中不易受时间、季节

6、、地区的限制第20页,讲稿共106张,创作于星期日五、微生物与发酵o发酵工程是以微生物的生命活动为中心的o微生物的生物学性状和发酵条件决定了其相应产物的生成o工业上用的全部微生物都称为工业微生物,工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌o由于发酵工程本身的发展以及基因工程正在进入发酵过程,病毒、藻类等其它微生物也正在逐步地变为工业生产菌。第21页,讲稿共106张,创作于星期日第五节 微生物的代谢调节在生物进化过程中,微生物细胞形成了愈来愈完善的代谢调节机制,在代谢繁殖过程中,能量的利用以及对细胞生长繁殖过程中所需的各种物质的形成是非常合理和经济的,细胞经常处于平衡生长状态,不会有

7、代谢产物的积累。第22页,讲稿共106张,创作于星期日现代发酵工业要研究的主要内容就是通过改变培养条件和遗传特性,使微生物的代谢途径改变或代谢调节失控而获得某一发酵产物的过量产生。其方法大体可分为两类:n改变产生菌的基因型而改变代谢途径;n改变控制代谢速率,即影响基因型的表达。第23页,讲稿共106张,创作于星期日代谢调节代谢调节(regulation of metablism)是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。v酶量的调节v酶活性的调节第24页,讲稿共106张,创作于星期日微生物代谢的控制微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制,

8、以期按照人们的愿望按照人们的愿望,生产有用的微生物制品。第25页,讲稿共106张,创作于星期日代谢调节的方式酶合成的调节酶活性的调节方式初级代谢的调节次级代谢的调节第26页,讲稿共106张,创作于星期日一、代谢调节方式细胞透性的调节代谢途径区域化代谢流向的调控代谢速度的调控第27页,讲稿共106张,创作于星期日1,细胞透性的调节细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌,从而影响到细胞内代谢的变化。细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式,由它控制着营养物质的吸收和产物分泌。代谢调节方式第28页,讲稿共106张,创作于星期日o例如,大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌吸收乳糖是由渗透酶和环状A

9、MP(cAMP)协同控制来完成的。cAMP的浓度是由腺苷酸环化酶(AC)的活性控制的,也就是说,乳糖的吸收受渗透酶和AMP环化酶的控制,调节蛋白通过磷酸化的形式和腺苷酸环化酶(AC)或渗透酶结合,分别使腺苷酸环化酶活化或使渗透酶失活。当有葡萄糖时,乳糖的渗透酶以无活性状态存在,而腺苷酸环化酶也以非活性状态存在。代谢调节方式第29页,讲稿共106张,创作于星期日2,代谢途径区域化原核微生物细胞结构虽然简单,但也划分出不同的区域,对于某一代谢途径有关的酶系则集中某一区域,以保证这一代谢途径的酶促反应顺利进行,避免了其他途径的干扰。n例如呼吸的酶系集中在细胞质膜上;而与蛋白质合成有关的酶系则位于核蛋

10、白体上;分解大分子的水解酶,在革兰氏阴性菌里是位于壁膜间隙中,而革兰氏阳性菌则将这些水解酶类,分泌于胞外。代谢调节方式第30页,讲稿共106张,创作于星期日在真核微生物细胞里,各种酶系被细胞器隔离分布。v如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上;蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上;DNA合成的某些酶位于细胞核里。代谢调节方式第31页,讲稿共106张,创作于星期日细胞具有复杂的膜结构使其代谢活动只能在特定的部位上进行,即代谢活动是区域化的,其实质是控制酶与底物接触,使各个反应有序地进行。代谢调节方式第32页,讲稿共106张,创作于星期日线粒体线粒体:丙酮酸氧化丙酮酸氧化;三羧酸循三羧酸循环环;-氧化

11、氧化;呼吸链电子传递呼吸链电子传递;氧化磷酸化氧化磷酸化细胞质细胞质:酵解酵解;磷戊糖磷戊糖途径途径;糖原合成糖原合成;脂肪脂肪酸合成酸合成;细胞核细胞核:核酸合成核酸合成内质网内质网:蛋白质合成蛋白质合成;磷磷脂合成脂合成酶酶定定位位的的区区域域化化第33页,讲稿共106张,创作于星期日3,代谢流向的调控微生物在不同条件下可以通过控制各代谢途径中某个酶促反应的速率来控制代谢物的流向,从而保持机体代谢的平衡。它包括两种形式v由一个关键酶控制的可逆反应v由两种酶控制的逆单向反应代谢调节方式第34页,讲稿共106张,创作于星期日o由一个关键酶控制的可逆反应由一个关键酶控制的可逆反应同一个酶可以通过

12、不同辅基(或辅酶)控制代谢物的流向。n例如,谷氨酸脱氢酶以NADP+为辅酶时,主要是催化谷氨酸的合成,当以NAD+为辅酶时,则催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通过不同的辅基来控制代谢物的流向。代谢调节方式第35页,讲稿共106张,创作于星期日o由两种酶控制的逆单向反应由两种酶控制的逆单向反应逆单向反应是在生物体代谢的关键部位的某些反应,它是由两种各自不同的酶来催化的。即在一个“可逆”反应中,其中一种酶催化正反应,而另一种酶则催化逆反应。n例如,葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖是由己糖激酶催化的,而其逆反应则是由6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的,逆反

13、应则由1,6-二磷酸果糖酯酶催化。代谢调节方式第36页,讲稿共106张,创作于星期日4,代谢速度的调控在不可逆反应中,微生物通过调节酶的活性和酶量来控制代谢物的流量。微生物在不同条件下能按照需要,通过激活或抑制原有酶的活性或通过诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代谢速度,使之高度经济有效地利用能量和原料进行生长繁殖。代谢调节方式第37页,讲稿共106张,创作于星期日二、酶合成的调节o酶合成的诱导o酶合成的阻遏第38页,讲稿共106张,创作于星期日1,酶合成的诱导酶合成的调节第39页,讲稿共106张,创作于星期日2,酶合成诱导的机制酶合成的调节第40页,讲稿共106张,创作于星期日3,酶合成的阻遏酶

14、合成的调节第41页,讲稿共106张,创作于星期日4,酶合成阻遏的机制酶合成的调节第42页,讲稿共106张,创作于星期日三、酶活性的调节概概 念念o酶活性调节酶活性调节是指一定数量的酶,通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。影响因素影响因素底物和产物的性质和浓度环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等)其他的酶的存在调节方式调节方式激活已有酶的活性抑制已有酶的活性第43页,讲稿共106张,创作于星期日(一)激活激活:在激活剂的作用下,使原来无活性的酶变成有活性,或使原来活性低的酶提高了活性的现象。代谢调节的激活作用:主要是指代谢物对酶的激活。v前(体)馈激活,指代谢途径中后面

15、的酶促反应,可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。v代谢中间产物的反馈激活,指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用酶活性的调节第44页,讲稿共106张,创作于星期日反馈激活和前(体)馈激活示意图反馈激活和前(体)馈激活示意图AB C D FAB GCDEE+例例1:1:糖代谢途径中丙酮酸积累激活丙酮酸羧化酶,例糖代谢途径中丙酮酸积累激活丙酮酸羧化酶,例2 2:乙酰乙酰CoACoA的积累激活的积累激活PEPPEP羧化酶羧化酶第45页,讲稿共106张,创作于星期日酶酶的的反反馈馈激激活活葡萄糖葡萄糖草酰乙酸草酰乙酸丙酮酸丙酮酸羧化酶羧化酶乙酰乙酰CoA活化活化磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙

16、酮酸拧檬酸拧檬酸-酮戊二酸酮戊二酸1,6-二磷酸果糖二磷酸果糖第46页,讲稿共106张,创作于星期日(二)抑制抑制:由于某些物质的存在,降低酶活性的现象。反馈抑制(feedbackinhibition):反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑制。v无分支代谢途径的调节v有分支代谢途径的调节酶活性的调节第47页,讲稿共106张,创作于星期日1,无分支代谢途径的调节通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活性有抑制作用。酶活性的调节第48页,讲稿共106张,创作于星期日o例如,在大肠杆菌中,由苏氨酸(Thr)合成异亮氨酸(IIeu)时,异亮氨酸对催化反应途

17、径中的第一步反应的苏氨酸脱氨酶(TD)有抑制作用。苏氨酸-酮丁酸异亮氨酸TD酶活性的调节第49页,讲稿共106张,创作于星期日2,有分支代谢途径的调节在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代谢途径中,调节方式较复杂,其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶,同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用,分支代谢的反馈调节方式有多种:v顺序反馈抑制(sequentialfeedbackinhibition)v同工酶的反馈抑制(isoenzymefeedbackinhibition)v协同反馈抑制(concertedfeedbackinhibition)v累积反馈抑制(c

18、umulativefeedbackinhibition)v超相加反馈抑制(cooperativefeedbackinhibition)酶活性的调节第50页,讲稿共106张,创作于星期日(1)顺序反馈抑制sequential feedback inhibition分支代谢途径中的两个末端产物,不能直接抑制途径中的第一个酶,只有当两个末端产物都过量时,才能对途径中的第一个酶有抑制作用。酶活性的调节第51页,讲稿共106张,创作于星期日o例如,枯草杆菌在芳香族氨基酸合成中,色氨酸(Try)抑制邻氨基苯甲酸合成酶(AS),苯丙氨酸(Phe)抑制预苯酸脱水酶(PT),酪氨酸(Tyr)抑制预苯酸脱氢酶(P

19、D),预苯酸和分支酸又部分地抑制7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶(DS)。PEP:磷酸烯醇丙酮酸;E4P:4-磷酸赤藓糖;DAHP:7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸;CA:分支酸;Per:预苯酸;AA:邻氨基苯甲酸;HPPA:对羟基苯丙酮酸;PPA:苯丙酮酸;Tyr:酪氨酸;Try:色氨酸;Phe:苯丙氨酸;I:7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶;II:邻氨基苯甲酸合成酶;III:分支酸变位酶;IV:预苯酸脱氢酶;V:预苯酸脱水酶第52页,讲稿共106张,创作于星期日(2)同工酶的反馈抑制isoenzymefeedbackinhibition同功酶是指能催化同一生化反应,但它们的结构

20、稍有不同,可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。其特点是:途径中第一个反应被两个不同的酶所催化,一个酶被H抑制,另一个酶被G抑制。只有当H和G同时过量才能完全阻止A转变为B。第53页,讲稿共106张,创作于星期日o例如,大肠杆菌以天门冬氨酸为前体合成苏氨酸(Thr)、异亮氨酸(Ileu)、甲硫氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)的代谢途径中有三种天门冬氨酸激酶的同功酶(AKI、AKII和AKIII)和两种高丝氨酸脱氢酶的同功酶(HSDHI和HSDHII)。其中AKI和HSDHI受到苏氨酸、异亮氨酸的反馈抑制和阻遏,AKII和HSDHII受甲硫氨酸的反馈抑制和阻遏;AKIII受赖氨酸的反馈抑制和阻遏。

21、第54页,讲稿共106张,创作于星期日(3)协同反馈抑制concertedfeedbackinhibition在分支代谢系统中,几种末端产物同时都过量,才对途径中的第一个酶具有抑制作用,如果末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。第55页,讲稿共106张,创作于星期日o例如,荚膜红假单胞菌中天门冬氨酸族氨基酸生物合成途径中,天门冬氨酸激酶(AK)是受末端产物赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。第56页,讲稿共106张,创作于星期日(4)累积反馈抑制cumulativefeedbackinhibition在分支代谢途径中各种末端产物单独过量时,它们各自能对途径中的第一个反应的酶仅产生较小的抑制

22、作用。一种末端产物单独过量并不影响其它末端产物的形成,只有当几种末端产物同时过量时,才对途径中的第一个酶产生较大的抑制。酶活性的调节第57页,讲稿共106张,创作于星期日o例如,大肠杆菌谷氨酰胺合成酶(GS)活性的调节是一个典型的累积反馈调节的例子。谷氨酰胺由谷氨酸、铵和ATP合成。谷氨酰胺中的酰胺基是色氨酸、组氨酸、氨基甲酰磷酸、6-磷酸葡萄糖胺、CTP、AMP、GMP等化合物生物合成过程中的氮源。谷氨酰胺合成酶被谷氨酰胺代谢的每种末端产物以及丙氨酸和甘氨酸所累积抑制。谷氨酰胺合成酶对这些抑制物中的每一种末端产物均有特异的结合部位。当上述8种末端产物同时过量都与酶结合时,谷氨酰胺合成酶的活性

23、将受到最大的抑制。第58页,讲稿共106张,创作于星期日(5)超相加反馈抑制cooperativefeedbackinhibition超相加反馈抑制是一种既不同于协同反馈抑制又不同于累积反馈抑制。对一个分支代谢途径中,几种末端产物单独过量时,仅产生对共同途径的第一个酶部分的抑制。如果每种末端产物都过量时,其抑制作用则超过各种末端产物单独过量时抑制的总和。酶活性的调节第59页,讲稿共106张,创作于星期日o例如,在嘌呤核苷酸的生物合成途径中,催化第一步反应的酶,5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的酰胺基转移酶,可被各种嘌呤核苷酸产物(如AMP、GMP)所抑制。例如,一定量的GMP或AMP仅能抑

24、制5-磷酸核糖-1-焦磷酸酰胺基转移酶活力的10,而当二者混合时,则可抑制其酶活力的50。因为这些嘌呤核苷酸与5-磷酸核糖-1-焦磷酸并无结构相似性,又因该酶是一种调节酶,GMP和AMP可能分别结合在该酶的不同部位上。第60页,讲稿共106张,创作于星期日5.酶活性调节的分子机制解释酶活性调节机制的理论:v别构调节理论(其核心是酶分子构象的改变)v酶分子的化学修饰理论(其核心是酶分子结构的改变)。酶活性的调节第61页,讲稿共106张,创作于星期日四、初级代谢的调节RegulationofPrimaryMetabolism产能代谢的调节:能荷调节(EnergyChargeRegulation)核

25、蛋白体合成的调节(RegulationofRibosomeSynthesis)氨基酸、核苷酸合成代谢的调节(Regulationofaminoacidsandnucleotidemetabolism)第62页,讲稿共106张,创作于星期日能荷调节(EnergyChargeRegulation)o能荷:能荷:即指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度o能荷的大小与细胞中ATP、ADP和AMP的相对含量有关。当细胞中全部腺苷酸均以ATP形式存在时,则能荷最大,为100%,即能荷为满载。当全部以AMP形式存在时,则能荷最小,为零。当全部以ADP形式存在时,能荷居中,为5

26、0%。若三者并存时,能荷则随三者含量的比例不同而表现不同的百分值。第63页,讲稿共106张,创作于星期日能荷调节(EnergyChargeRegulation)o研究证明,细胞中能荷高时,抑制了ATP的生成,但促进了ATP的利用,也就是说,高能荷可促进分解代谢,并抑制合成代谢。相反,低能荷则促进合成代谢,抑制分解代谢。o能荷调节是通过ATP、ADP和AMP分子对某些酶分子进行变构调节进行的。例如糖酵解中,磷酸果糖激酶是一个关键酶,它受ATP的强烈抑制,但受ADP和AMP促进。丙酮酸激酶也是如此。在三羧酸环中,丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和-酮戊二酸脱氢酶等,都受ATP的抑制和AD

27、P的促进。呼吸链的氧化磷酸化速度同样受ATP抑制和ADP促进。第64页,讲稿共106张,创作于星期日五、次级代谢的调节RegulationofSecondaryMetabolism初级代谢对次级代谢的调节碳代谢物的调节作用氮代谢物的调节作用磷酸盐的调节作用次级代谢中的诱导作用及产物的反馈作用次级代谢中细胞膜透性调节第65页,讲稿共106张,创作于星期日初级代谢对次级代谢的调节o许多次级代谢产物的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的,所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的,次级代谢途径并不是独立的,而是与初级代谢途径有密切关系的。因此次级代谢必然会受到初级代谢的调节。o例如青霉素的合

28、成会受到赖氨酸的强烈抑制,而赖氨酸合成的前体a-氨基己二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用,并能刺激青霉素的合成。这是因为a-氨基己二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。如果赖氨酸过量,它就会抑制这个反应途径中的第一个酶,减少a-氨基己二酸的产量,从而进一步影响青霉素的合成。第66页,讲稿共106张,创作于星期日碳源代谢产物的调节碳源代谢产物的调节o碳分解代谢产物调节指能迅速被利用的碳源(葡萄糖)或其分解代谢产物,对其他代谢中的酶(包括分解酶和合成酶)的调节。分为分解产物阻遏和抑制两种。o葡萄糖是菌体生长良好的碳源和能源,但对青霉素、头孢菌素、卡那霉素、新霉素、丝裂霉素等都有明显降低产量的作用。第67页

29、,讲稿共106张,创作于星期日氮代谢物的调节作用o在次级代谢中,氮分解代谢产物调节,即被迅速利用的氮源(氨)抑制作用于含底物的酶(蛋白酶、硝酸盐还原酶、酰胺酶、脲酶、组氨酸酶)的合成。在次级代谢中,其阻遏作用也确实存在。在抗生素生产中使用黄豆饼粉就是由于它缓慢分解成有阻遏作用的氨基酸和氨,防止或减弱氮分解代谢产物阻遏作用的结果。第68页,讲稿共106张,创作于星期日磷酸盐的调节磷酸盐的调节o磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分,还是调节抗生素生物合成的重要参数。其机制按效应剂说有直接作用,即磷酸盐自身影响抗生素合成,和间接作用,即磷酸盐调节胞内其他效应剂(如ATP、腺苷酸能量负荷和cAMP

30、),进而影响抗生素合成。o已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大环内酯等32种抗生素的合成产生阻抑作用。第69页,讲稿共106张,创作于星期日细胞膜透性的调节细胞膜透性的调节o外界物质的吸收或代谢产物的分泌都需经细胞膜的运输,如发生障碍,则胞内合成代谢物不能分泌出来,影响发酵产物收获,或胞外营养物不能进入胞内,也影响产物合成,使产量下降。o如在青霉素发酵中,产生菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。如果输入硫化物能力增加,硫源供应允足,合成青霉素的量就增多。第70页,讲稿共106张,创作于星期日第六节 微生物代谢产物的过量产生o提高初级代谢产物产量的方法o提高次级代谢产物

31、产量的方法o高浓度微生物的培养第71页,讲稿共106张,创作于星期日一、提高初级代谢产物产量的方法1,使用诱导物o水解酶类大都属诱导酶类,因此向培养基中加入诱导物就会增加胞外酶的产量。如加入槐糖(1,2-D-葡二糖)诱导木霉菌的纤维素酶的生成,木糖诱导半纤维素酶和葡萄糖异构酶的生成等。o诱导物的浓度过高及能被迅速利用时,会发生酶合成的阻遏,这在纤维二糖对纤维素酶的产生,木二糖对半纤维素酶产生中都己观察到,这也是使用诱导物时应予注意的。第72页,讲稿共106张,创作于星期日2,除去诱导物选育组成型产生菌o在发酵工业中,要选择到一种廉价、高效的诱导物是不容易的,分批限量加入诱导物在工艺上也多不便,

32、更为有效的方法是改变菌株的遗传特性,除去对诱导物的需要,即选育组成型突变株。o通过诱变处理,使调节基因发生突变,不产生有活性的阻遏蛋白,或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合,都可达到此目的。提高初级代谢产物产量的方法第73页,讲稿共106张,创作于星期日o设计选育组成型突变株的方法的原则是创造一种利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件,造成对组成型的选择优势以及适当的识别两类菌落的方法,从而把产生的组成型突变株选择出来。n连续培养法n交替培养法o在平板上识别组成型突变株的方法:透明圈、变色圈。提高初级代谢产物产量的方法第74页,讲稿共106张,创作于星期日3,降低分解代谢产物浓

33、度,减少阻遏的发生o高分子的多糖类、蛋白质等的分解代谢产物(如能被迅速利用的单糖、氨基酸以及脂肪酸、磷酸盐等)都会阻遏分解其聚合物的水解酶类的生成。因此用限量流加这类物质或改用难以被水解的底物的方法,都可减少阻遏作用的发生,而获得较高的酶产量。提高初级代谢产物产量的方法第75页,讲稿共106张,创作于星期日4,解除分解代谢阻遏筛选抗分解代谢阻遏突变株o从遗传学角度来考虑,如调节基因发生突变,使产生的阻遏蛋白失活;不能与末端分解代谢产物结合,或操纵基因发生突变使阻遏蛋白不能与其结合,都能获得抗分解代谢阻遏的突变株。前者为隐性突变,后者为显性突变,都能由此导致酶的过量产生。提高初级代谢产物产量的方

34、法第76页,讲稿共106张,创作于星期日o可以直接以末端代谢产物为底物来筛选抗阻遏突变株,如以葡萄糖、甘油为碳源筛选纤维系酶抗阻遏突变株。o更多地是利用选育结构类似物抗性菌株的方法。选育结构类似物抗性菌株的方法所依据的机制是:结构类似物由于在分子结构上与分解代谢的未端产物相类似,因此、它也能与阻遏蛋白相结合,如调节基因发生突变而使阻遏蛋白不能与结构类似物结合,即出现抗性菌株。由于分子结构上的类似,这种抗性菌株产生的阻遏蛋白也不能与正常的分解代谢产物相结合,即同时也具有对相应的分解代谢产物阻遏作用的抗性,而能导致相应酶类的过量生产。提高初级代谢产物产量的方法第77页,讲稿共106张,创作于星期日

35、结构类似物及代谢末端产物提高初级代谢产物产量的方法第78页,讲稿共106张,创作于星期日5,解除反馈抑制筛选抗反馈抑制突变株o选育对末端产物有抗性的突变株n如天冬氨酸激酶是赖氨酸生物合成途径中的调节酶,由黄色短杆菌分离到对赖氨酸的类似物(2-氨基半胱氨酸)有抗性的突变株,它对天冬氨酸激酶的反馈抑制不敏感,赖氨酸的产量可达57mgm1。o选育营养缺陷型n如谷氨酸经过乙酰谷氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸而合成精氨酸。选育精氨酸缺陷型,就能得到瓜氨酸的过量生产。提高初级代谢产物产量的方法第79页,讲稿共106张,创作于星期日6,防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株o选育双重营养缺陷型;o可在培养液中加

36、入适量结构类似物,以防止抗结构类似物的高产菌株的回复突变株的增殖;o利用高产株和回复突变株对抗生素敏感性的不同,加适量抗生素防止回复株增殖;o负变菌株的回复突变株可用来提高代谢产物的过量产生。提高初级代谢产物产量的方法第80页,讲稿共106张,创作于星期日7,改变细胞膜的通透性o微生物细胞吸收作为代谢所需要的底物和离子是依靠定位在细胞膜上的主动输送系统来进行,与产能代谢过程相偶联。输送系统有高度的专一性,这主要取决于其蛋白质的组成,即透性酶。o细胞内形成的代谢产物排出细胞时,也与细胞膜的结构有关。当控制物理、化学条件或者筛选细胞膜、细胞壁结构组成的突变株以改进物质的进出速率。影响代谢过程时,都

37、有可能造成代谢产物的过量生产。提高初级代谢产物产量的方法第81页,讲稿共106张,创作于星期日8,筛选抗生素抗性突变株o抗生素种类繁多,其抑制微生物代谢的机制各不相同,一些主要抗生素的作用机制已比较清楚。筛选抗生素抗性突变体,也能取得由此而改变代谢调节,获得过量生产的结果。n衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的生成。枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的-淀粉酶的产量较亲株提高了5倍(分泌机制改变的结果)n抗利福平的蜡状芽抱杆菌的无芽孢突变株的-淀粉酶产量提高了7倍(芽孢形成的延迟利于-淀粉酶的形成,而抗利福平的突变株往往失去了形成芽抱的能力)提高初级代谢产物产量的方法第82页,讲稿共106张,创作于星期日9,选

38、育条件抗性突变株o因环境不同,能表现为“野生型”菌株的特性和突变型菌株特性的突变被称为条件抗性突变或称为条件致死突变。其中温度敏感型突变常被用于提高代谢产物的产量。n适于在中温条件下(如37C左右)生长的细菌,经诱变后可得到在较低温度下生长而在较高温度(如37C以上)不能生长的突变株,即温度敏感型突变株。这是由于某一酶蛋白结构改变后,在高温条件下活力丧失的缘故。如此酶为蛋白质、核苷合成途径上的酶,则此突变株在高温条件下的表型就是营养缺陷型。提高初级代谢产物产量的方法第83页,讲稿共106张,创作于星期日10,调节生长速率o在酶的诱导合成研究中发现,一些物质具有诱导效应及难被利用;与其只能维持较

39、低的生长速率有关。而起阻遏作用的物质则都是易被迅速利用和能维持高的生长速率。估计这是因为诱导、阻遏的发生都与产能代谢有关而造成的。因此,改变培养条件如温度、供氧量等以控制生长速率,也能获得一定效果。n里氏木霉纤维素酶的大量合成是在菌体大量形成时,如控制它的比生长速率近于零,则能在一较长时间内持续合成纤维素酶并获得高产。提高初级代谢产物产量的方法第84页,讲稿共106张,创作于星期日11,加入酶的竞争性抑制剂o生物化学上把底物和抑制剂与酶相结合时呈现的互相排斥现象称为竞争性抑制,即酶与抑制剂结合后就不能与底物相结合,反之亦然。n葡萄糖经不完全氧化(酵解)生成丙酮酸,脱羧生成乙酰辅酶A,进入TCA

40、循环。乙酰辅酶A与草酰乙酸经柠檬酸合成酶催化,把乙酰基由乙酰辅酶A转移至草酰乙酸而成为柠檬酸。柠檬酸又因乌头酸酶的存在而和它的异构体顺乌头酸、异柠檬酸呈平衡。单氟乙酸在微生物细胞内可转变为单氟柠檬酸,此酸与乌头酸酶有竞争性抑制,因此,向培养基中加入单氟乙酸可导致柠檬酸的积累,减少异柠檬酸的生成。由此,筛选不能利用柠檬酸或对单氟乙酸敏感的突变袜,都达到了提高柠檬酸产量和减少异柠檬酸生成的结果。这些突变株的乌头酸酶的活力都比较低。提高初级代谢产物产量的方法第85页,讲稿共106张,创作于星期日二、提高次级代谢产物产量的方法1,次级代谢物合成的特点,次级代谢物合成的特点o次级代谢物合成过程远较初级代

41、谢产物复杂;o次级代谢产物则需要复杂的营养条件;o在分批培养条件下,次级代谢产物一般都是在菌体生长的峰值出现后才大量合成。第86页,讲稿共106张,创作于星期日2,常用的提高次级代谢产物产量的方法提高次级代谢产物产量的方法1,补加前体类似物o在合成途径已基本清楚的条件下,向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的有效方法。n如青霉素G的生产中,苯乙酰-CoA是限速性因子,补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。o次级代谢产物形成中并不是所有前体类似物都是限制性因子。加入前体提高产量的效果更取决于总体代谢的调节水平。前体物质本身是否易于得到等。这都是在生产应用中需综合考虑的。第87页,讲稿共10

42、6张,创作于星期日提高次级代谢产物产量的方法2,加入诱导物o把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中会增加产量。n如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素C,加入巴比妥可提高利福霉素产量等。但在工业生产中还未普遍应用此技术,而只是在选择培养基组成时给以考虑。第88页,讲稿共106张,创作于星期日3,防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生o青霉素发酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以减少碳分解阻遏的发生,是一项很有效的提高产量的方法。o使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源,葡萄糖与麦芽糖、葡萄糖与蔗糖、葡萄糖与淀粉混合碳源的利用,也都能减少碳分解阻遏的发生。o加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡

43、萄糖的利用速度减缓,可增加金霉素的产量。提高次级代谢产物产量的方法第89页,讲稿共106张,创作于星期日4,防止氮代谢阻遏的发生o避免使用高浓度的铵盐做氮源以防止氮代谢阻遏的发生,是抗生素发酵工业生产中比较成熟的经验。在抗生素产生期如补加氮源则会造成发酵逆转,返回生长期,抗生素的产量会大为减少。o使用亚适量(对菌体生长)的磷酸盐,亦是抗生素发酵工业中遵循的原则之一。o为防止氮、磷分解阻遏的发生,应选用黄豆饼粉、蛋白胨类物质为主要原料,而尽量少用易被迅速利用的无机氮源。提高次级代谢产物产量的方法第90页,讲稿共106张,创作于星期日5,筛选耐前体或前体类似物的突变株o加入前体有提高次级产物产量的

44、效果;但过量对菌体又会有毒。筛选对前体抗性的突变株以减少或消除前体的反馈阻遏,从而可获得高产。n如抗苯乙酸的青霉突变株,其青霉素的产量会增加。n半胱氨酸、缬氨酸是-内酰胺类抗生素的前体,筛选上述氨基酸的结构类似物,三氟亮氨酸、D-缬氨酸的抗性菌株,其-内酰胺类抗生素产量会提高。提高次级代谢产物产量的方法第91页,讲稿共106张,创作于星期日6,选育抗抗生素突变株o链霉素、氯霉素、金霉素筹多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。一株高产抗生素产生菌,必然应具备对自身所分泌的抗生素的抗性。筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株产量有数倍增加的实验室结果

45、已有不少报道。提高次级代谢产物产量的方法第92页,讲稿共106张,创作于星期日7,筛选营养缺陷型的回复突变株o次级代谢产物都来自初级代谢产物,因此其营养缺陷型的产量一般都很低,但其回复突变型中却有不少获得高产的例子,其机制尚不清楚,估计是次级代谢产物或其前体合成的反馈抑制被解除。在金霉素产生菌选育中,运用此方法曾获得高产菌株。提高次级代谢产物产量的方法第93页,讲稿共106张,创作于星期日8,抗毒性突变株的选育o重金属离子、羟胺类物质对-内酰胺类抗生素产生菌有毒,但与抗生素相结合可解毒。选择适当浓度的此类毒性物质使其恰好抑制产生菌生长,在此条件下能生长的菌株,应为抗生素类物质过量产生的突变株。

46、曾由头孢霉素C对重金属离子的抗性突变株中选育到高产菌株。提高次级代谢产物产量的方法第94页,讲稿共106张,创作于星期日o以上主要是从微生物的代谢调节机制出发探讨获得代谢产物过量生产的方法。但是,微生物代谢产物特别是次级产物形成的途径和调节控制机制是相当复杂的,研究得比较清楚的只是少数。因此,上述方法的应用往往也是经验性的。o在生产实践中为提高微生物产品产量和品质经常使用的方法是诱变后随机筛选和发酵条件的优化。近年来运用遗传工程的方法以获得代谢产物的过量生产是很活跃的研究领域。第95页,讲稿共106张,创作于星期日三、高浓度微生物的培养o1,为什么要采用高浓度微生物的培养?o微生物液体发酵大都

47、采用分批培养,这种培养方式的缺点是:发酵液中最终细胞浓度不高。如果通过改进工艺技术,使发酵液中微生物细胞增殖到很高的浓度,那么,高浓度的细胞将会产生高浓度的发酵产物,这样就可以大大提高发酵设备的利用率,降低生产成本。基于这种目的,人们开始研究微生物高细胞浓度的培养技术。采用高细胞浓度培养技术,发酵液中菌体浓度比分批式培养可高10倍以上。n例如用高细胞浓度连续培养技术,培养大肠杆菌HBl01(pPAKS2),可得到95gL的菌体。用同样的方法培养酒精酵母可得到219gL的菌体。而一般用分批法培养酵母和细菌,得到的菌体浓度仅为10gL左右。第96页,讲稿共106张,创作于星期日2,高细胞浓度培养技

48、术的原理:采用一定的工艺技术,保证微生物生长的适宜条件,延长微生物的指数增殖过程,从而得到高浓度的细胞。3,高细胞浓度培养技术的优点v可大大提高发酵设备的利用率v节省能源第97页,讲稿共106张,创作于星期日4,高浓度细胞培养的方法流加培养高细胞浓度连续培养菌体循环利用等高浓度微生物的培养第98页,讲稿共106张,创作于星期日(1)流加培养优优 点点o实现对发酵过程的控制,如控制代谢途径、菌体比生长速率等o无需增添设备o解除底物抑制o解除分解代谢阻遏o解除葡萄糖效应高浓度微生物的培养第99页,讲稿共106张,创作于星期日流加培养的控制方式无反馈控制v恒速流加v变速流加v指数流加高浓度微生物的培

49、养第100页,讲稿共106张,创作于星期日反馈控制DO-恒定控制pH-恒定控制CO2生成速率控制细胞浓度控制底物浓度控制高浓度微生物的培养第101页,讲稿共106张,创作于星期日(2)高浓度细胞连续培养原原 理理o无菌培养基以一定速度连续补入发酵液,同时采用离心。膜过滤等方法,回收排出液中的细胞,使之重新进入发酵液中,这样微生物就可以在发酵液中高浓度地积累。高浓度的细胞产生大量的发酵产物,这些产物随排出液排出进入提取过程,同时对细胞生长起抑制作用的代谢产物也被排出。高浓度微生物的培养第102页,讲稿共106张,创作于星期日除去抑制物质的方法透析培养萃取发酵过滤培养高浓度微生物的培养第103页,

50、讲稿共106张,创作于星期日(3)菌体循环利用这种方法大致过程是:待分批发酵终了将菌体与发酵液分离,收集的菌体经去杂菌等处理后返回发酵罐,再加入无菌培养基进行第二批发酵,因发酵液中菌体浓度很高,故发酵时间可大大缩短。第二批发酵终了,进行同样处理,然后再开始第三批发酵;这种技术与前面所述两种技术原理不同,但也能起到缩短发酵时间、提高设备利用率的作用。高浓度微生物的培养第104页,讲稿共106张,创作于星期日(4)高细胞浓度培养中的问题o培养基流加控制与其他条件控制o菌体分离装置的效能o菌种退化高浓度微生物的培养第105页,讲稿共106张,创作于星期日感谢大家观看第106页,讲稿共106张,创作于

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