《第12章分子发光分析.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第12章分子发光分析.ppt（54页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、12.1 12.1 分子发光分析概述分子发光分析概述12.2 12.2 荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理12.3 12.3 荧光和磷光分析仪荧光和磷光分析仪 12.4 12.4 荧光和磷光分析法的特点与应用荧光和磷光分析法的特点与应用12.5 12.5 化学发光分析化学发光分析 第第1212章章 分子发光分析分子发光分析 (Molecular Luminescence Analysis)(Molecular Luminescence Analysis)n n某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基
2、态跃迁某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，在返回基态过程中，以光辐射的形式释到激发态，在返回基态过程中，以光辐射的形式释到激发态，在返回基态过程中，以光辐射的形式释到激发态，在返回基态过程中，以光辐射的形式释放能量，这种现象称为放能量，这种现象称为放能量，这种现象称为放能量，这种现象称为分子发光分子发光分子发光分子发光，在此基础上建立，在此基础上建立，在此基础上建立，在此基础上建立起来的分析方法为起来的分析方法为起来的分析方法为起来的分析方法为分子发光分析法。分子发光分析法。分子发光分析法。分子发光分析法。较高激发态较高激发态较高激发态较高激发态基基基基 态态态态吸收能吸收能
3、吸收能吸收能量受激量受激量受激量受激光辐射光辐射光辐射光辐射退激退激退激退激分子在分子在退激退激过程中以光辐射形式释放能量过程中以光辐射形式释放能量12.1 12.1 分子发光分析概述分子发光分析概述n n根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为：同分为：光致发光光致发光光致发光光致发光：以：以：以：以光源光源光源光源来激发而发光来激发而发光来激发而发光来激发而发光 化学发光化学发光化学发光化学发光：以：以：以：以化学反应能化学反应能化学反应能化学反应能激发而发光激发而发光激发而发光激发而发光化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法
4、 本章对本章对本章对本章对分子荧光分析分子荧光分析分子荧光分析分子荧光分析、磷光分析磷光分析磷光分析磷光分析和和和和化学发光分析化学发光分析化学发光分析化学发光分析这三种分子发光分析法进行讨论。这三种分子发光分析法进行讨论。这三种分子发光分析法进行讨论。这三种分子发光分析法进行讨论。荧光荧光荧光荧光荧光分析法荧光分析法荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光磷光磷光分析法磷光分析法磷光分析法磷光分析法一、荧光和磷光的产生一、荧光和磷光的产生1.1.分子能级与电子激发态的多重度分子能级与电子激发态的多重度 分子能级比原子能级复杂；每个电子能级中包含分子能级比原子能级复杂；每个电子能级中包含分子能级比原子
5、能级复杂；每个电子能级中包含分子能级比原子能级复杂；每个电子能级中包含一系列的振动能级和转动能级。一系列的振动能级和转动能级。一系列的振动能级和转动能级。一系列的振动能级和转动能级。电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1M=2S+1，S S为电子自旋量为电子自旋量为电子自旋量为电子自旋量子数的代数和子数的代数和子数的代数和子数的代数和(0(0或或或或1)1)，因此，因此，因此，因此M=1M=1（激发单重态激发单重态激发单重态激发单重态S S）或）或）或）或M=3M=3（激发三重态激发三重态激发三重态激发三重态T T）。）。）。）。平行自旋比
6、成对自旋平行自旋比成对自旋平行自旋比成对自旋平行自旋比成对自旋稳定稳定稳定稳定(洪特规则洪特规则洪特规则洪特规则)，三重态能级比相，三重态能级比相，三重态能级比相，三重态能级比相应单重态应单重态应单重态应单重态能级低能级低能级低能级低；大多数有机分子的基态处于单重态。；大多数有机分子的基态处于单重态。；大多数有机分子的基态处于单重态。；大多数有机分子的基态处于单重态。12.2 12.2 荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃系间窜跃 内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量 2 1 3 外转换外转换 2T2内转换内转换振动弛豫振
7、动弛豫因此，电子激发态有：因此，电子激发态有：因此，电子激发态有：因此，电子激发态有：第一、第二、第一、第二、第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态电子激发单重态电子激发单重态 S S S S1 1 1 1，S S S S2 2 2 2，;第一、第二、第一、第二、第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态电子激发三重态电子激发三重态 T T T T1 1 1 1，T T T T2 2 2 2，。激激激激发发发发过过过过程程程程：基基基基态态态态(S(S0 0)激激激激发发发发态态态态(S S1 1、S S2 2激激激激发发发发态态态态振振振振动动动动能能能能级级级级)；
8、去活化过程：去活化过程：去活化过程：去活化过程：激发态激发态激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式(见能见能见能见能级图级图级图级图)。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃系间窜跃 内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量 2 1 3 外转换外转换 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫2.2.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径（荧光、磷光的产生荧光、磷光的产生荧光、磷光的产生荧光、磷光的产生）电电电电子子子子处处处处于于于于激激激激发发发发态态态态是是是是不不不不稳稳稳稳定定定定状状状状态态态态，返返返返
9、回回回回基基基基态态态态时时时时，通通通通过过过过辐辐辐辐射跃迁射跃迁射跃迁射跃迁(发光发光发光发光)和无辐射跃迁等去活化过程失去能量。和无辐射跃迁等去活化过程失去能量。和无辐射跃迁等去活化过程失去能量。和无辐射跃迁等去活化过程失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换系间窜跃振动弛豫无辐射跃迁 以以速率最快，速率最快，速率最快，速率最快，激发态寿命最短激发态寿命最短激发态寿命最短激发态寿命最短的途径占优。的途径占优。的途径占优。的途径占优。荧光荧光荧光荧光：1010-7-710 10-9-9 s,s,第一激发第一激发第一激发第一激发单重态单重态单重态单重态最低振动能级最低振动能级最低振
10、动能级最低振动能级基态；基态；基态；基态；磷光磷光磷光磷光：1010-4-410s10s；第一激发第一激发第一激发第一激发三重态三重态三重态三重态最低振动能级最低振动能级最低振动能级最低振动能级基态。基态。基态。基态。外转换非辐射非辐射能量传递过程能量传递过程：振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫：同一电子能级内同一电子能级内同一电子能级内同一电子能级内以以以以热交换热交换热交换热交换形式由高振动能级形式由高振动能级形式由高振动能级形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。这一失活过程极快（至低振动能级间的跃迁。这一失活过程极快（至低振动能级间的跃迁。这一失活过程极快（至低振动能级间的跃迁。这一失活过
11、程极快（10 10-12-12 s s）。）。）。）。内转换内转换内转换内转换：同一多重态同一多重态同一多重态同一多重态的两个电子能级间的非辐射跃迁过的两个电子能级间的非辐射跃迁过的两个电子能级间的非辐射跃迁过的两个电子能级间的非辐射跃迁过程，如程，如程，如程，如S S2 2S S1 1 ，T T2 2 T T1 1等等等等 系间窜跃系间窜跃系间窜跃系间窜跃：不同多重态不同多重态不同多重态不同多重态有重叠振动能级间非辐射跃迁。有重叠振动能级间非辐射跃迁。有重叠振动能级间非辐射跃迁。有重叠振动能级间非辐射跃迁。如如如如S S1 1 T T1 1等。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋等。改变电子自旋
12、，禁阻跃迁，通过自旋等。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋等。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道偶轨道偶轨道偶轨道偶合进行。合进行。合进行。合进行。外转换：外转换：外转换：外转换：溶液中的激发态分子与溶剂或其他分子之间溶液中的激发态分子与溶剂或其他分子之间溶液中的激发态分子与溶剂或其他分子之间溶液中的激发态分子与溶剂或其他分子之间相相相相互碰撞互碰撞互碰撞互碰撞而失去能量，并以热的形式释放。常发生在第一激发而失去能量，并以热的形式释放。常发生在第一激发而失去能量，并以热的形式释放。常发生在第一激发而失去能量，并以热的形式释放。常发生在第一激发单重态（或三重态）的最低振动能级向基态转换的过程中。
13、单重态（或三重态）的最低振动能级向基态转换的过程中。单重态（或三重态）的最低振动能级向基态转换的过程中。单重态（或三重态）的最低振动能级向基态转换的过程中。外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭猝灭猝灭”。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量 2 1 3 外转换外转换 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫辐射辐射能量传递过程能量传递过程：荧光发射荧光发射荧光发射荧光发射：电子由第一激发电子由第一激发电子由第一激发电子由第一激发单重态单重态单重态单重态的最低振
14、动能级的最低振动能级的最低振动能级的最低振动能级基基基基态态态态(多为多为多为多为 S S1 1 S S0 0跃迁跃迁跃迁跃迁)，1010-7-710 10-9-9 s s内发射波长为内发射波长为内发射波长为内发射波长为 2 2的荧光。的荧光。的荧光。的荧光。通常通常通常通常发射荧光的能量比分子吸收的发射荧光的能量比分子吸收的发射荧光的能量比分子吸收的发射荧光的能量比分子吸收的能量能量能量能量小，波长长；小，波长长；小，波长长；小，波长长；2 2 2 2 1 1 ；光照停止后，光线也随之很快地消失。光照停止后，光线也随之很快地消失。光照停止后，光线也随之很快地消失。光照停止后，光线也随之很快地
15、消失。磷光发射磷光发射磷光发射磷光发射：电子由第一激发电子由第一激发电子由第一激发电子由第一激发三重态三重态三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级的最低振动能级的最低振动能级基基基基态态态态(T T1 1 S S0 0跃迁跃迁跃迁跃迁)产生。先发生从激发单重态产生。先发生从激发单重态产生。先发生从激发单重态产生。先发生从激发单重态S S1 1振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫内转移内转移内转移内转移系间跨越系间跨越系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫 T T1 1的最低振动能级。的最低振动能级。的最低振动能级。的最低振动能级。发光速度很慢：发光速度很慢：发光速度很慢：发光速度很慢：
16、1010-4-4100 s 100 s；光照停止后，可持续一光照停止后，可持续一光照停止后，可持续一光照停止后，可持续一段时间；磷光的波长更长：段时间；磷光的波长更长：段时间；磷光的波长更长：段时间；磷光的波长更长：磷磷磷磷 荧荧荧荧 激激激激 。因此，荧光是单重因此，荧光是单重因此，荧光是单重因此，荧光是单重-单重态的跃迁产生；磷光是三重单重态的跃迁产生；磷光是三重单重态的跃迁产生；磷光是三重单重态的跃迁产生；磷光是三重-单重的跃迁产生。单重的跃迁产生。单重的跃迁产生。单重的跃迁产生。发射光谱（荧光或磷光光谱）发射光谱（荧光或磷光光谱）发射光谱（荧光或磷光光谱）发射光谱（荧光或磷光光谱）固固
17、固固定定定定激激激激发发发发光光光光的的的的强强强强度度度度和和和和波波波波长长长长(选选选选最最最最大大大大激激激激发发发发波波波波长长长长),),化化化化合合合合物物物物发射的荧光发射的荧光发射的荧光发射的荧光(或磷光或磷光或磷光或磷光)强度与发射光波长关系曲线强度与发射光波长关系曲线强度与发射光波长关系曲线强度与发射光波长关系曲线。二、激发光谱和发射光谱二、激发光谱和发射光谱 激发光谱激发光谱激发光谱激发光谱 固固固固定定定定测测测测量量量量波波波波长长长长(选选选选最最最最大大大大发发发发射射射射波波波波长长长长)，化化化化合合合合物物物物发发发发射射射射的的的的荧荧荧荧光光光光(磷磷
18、磷磷光光光光)强强强强度度度度与与与与照照照照射射射射光光光光波波波波长长长长的的的的关关关关系系系系曲线。曲线。曲线。曲线。两两两两种种种种光光光光谱谱谱谱可可可可用用用用于于于于签签签签别别别别荧荧荧荧光光光光（磷磷磷磷光光光光）物物物物质质质质，亦亦亦亦可可可可作作作作为为为为进进进进行行行行荧荧荧荧光光光光（磷光）物质定量分析时选择合适激发波长和测定波长的依据。（磷光）物质定量分析时选择合适激发波长和测定波长的依据。（磷光）物质定量分析时选择合适激发波长和测定波长的依据。（磷光）物质定量分析时选择合适激发波长和测定波长的依据。荧光光谱的基本特征荧光光谱的基本特征a.Stokesa.St
19、okesa.Stokesa.Stokes位移位移位移位移 在在在在溶溶溶溶液液液液的的的的荧荧荧荧光光光光光光光光谱谱谱谱中中中中，荧荧荧荧光光光光波波波波长长长长总总总总是是是是大大大大于于于于激激激激发发发发光光光光的的的的波波波波长的现象。振动弛豫等消耗了能量。长的现象。振动弛豫等消耗了能量。长的现象。振动弛豫等消耗了能量。长的现象。振动弛豫等消耗了能量。b b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电电电电子子子子跃跃跃跃迁迁迁迁到到到到不不不不同同同同激激激激发发发发态态态态能能能能级级级级，吸吸吸吸收收收收
20、不不不不同同同同波波波波长长长长的的的的能能能能量量量量(如如如如能能能能级级级级图图图图 2 2,1 1)，产产产产生生生生不不不不同同同同吸吸吸吸收收收收带带带带，但但但但均均均均回回回回到到到到第第第第一一一一激激激激发发发发单单单单重重重重态态态态的的的的最最最最低低低低振振振振动动动动能能能能级级级级再再再再跃跃跃跃迁迁迁迁回回回回到到到到基基基基态态态态，产产产产生生生生波波波波长长长长一一一一定的荧光定的荧光定的荧光定的荧光(如如如如 2 2)。c c.镜像规则镜像规则镜像规则镜像规则 通通通通常常常常荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射光光光光谱谱谱谱与与与与它它它它的的的的吸吸吸
21、吸收收收收光光光光谱谱谱谱（与与与与激激激激发发发发光光光光谱谱谱谱形形形形状一样）成镜像对称关系。状一样）成镜像对称关系。状一样）成镜像对称关系。状一样）成镜像对称关系。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃系间窜跃 内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量 2 1 3 外转换外转换 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫镜像规则的解释:基基基基态态态态上上上上的的的的各各各各振振振振动动动动能能能能级级级级分分分分布布布布与与与与第第第第一一一一激激激激发发发发态态态态上上上上的的的的各各各各振动能级分布类似。振动能级分布类似。振动能级分布类似。振动能级分布类似。2002
22、50300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱 三、荧光效率三、荧光效率 分子能发射荧光取决于两条件：分子能发射荧光取决于两条件：分子能发射荧光取决于两条件：分子能发射荧光取决于两条件：（1 1）具有合适的结构，能吸收激发光；）具有合适的结构，能吸收激发光；）具有合适的结构，能吸收激发光；）具有合适的结构，能吸收激发光；（2 2）具有一定的荧光效率（荧光量子产率）。）具有一定的荧光效率（荧光量子产率）。）具有一定的荧光效率（荧光量子产率）。）具有一定的荧光效率（荧光量子产率）。荧光量子产率（荧光量子产率（荧光量
23、子产率（荧光量子产率（）：）：）：）：通通通通常常常常小小小小于于于于1 1 1 1，在在在在0.10.10.10.11 1 1 1时时时时具具具具有有有有分分分分析析析析应应应应用用用用价价价价值值值值。荧荧荧荧光光光光量量量量子子子子产产产产率率率率低低低低，是是是是由由由由于于于于激激激激发发发发态态态态分分分分子子子子释释释释放放放放激激激激发发发发能能能能过过过过程程程程中中中中除除除除了了了了荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射外外外外，还还还还存存存存在在在在多多多多种种种种非非非非辐辐辐辐射射射射跃跃跃跃迁迁迁迁与与与与之之之之竞竞竞竞争争争争，而而而而这这这这些些些些非非非非辐辐
24、辐辐射射射射过过过过程程程程不不不不仅仅仅仅与与与与分分分分子结构有关，还与所处的环境密切相关子结构有关，还与所处的环境密切相关子结构有关，还与所处的环境密切相关子结构有关，还与所处的环境密切相关。四、荧光与分子结构的关系四、荧光与分子结构的关系 荧荧荧荧光光光光素素素素和和和和酚酚酚酚酞酞酞酞结结结结构构构构相相相相似似似似，荧荧荧荧光光光光素素素素有有有有很很很很强强强强的的的的荧荧荧荧光光光光，酚酚酚酚酞酞酞酞却却却却没没没没有。为什么？有。为什么？有。为什么？有。为什么？（1 1 1 1）具具具具有有有有共共共共轭轭轭轭双双双双键键键键体体体体系系系系的的的的分分分分子子子子：*荧荧荧
25、荧光光光光效效效效率率率率高高高高。共共共共轭轭轭轭双双双双键键键键结结结结构构构构有有有有利利利利于于于于发发发发荧荧荧荧光光光光。共共共共轭轭轭轭度度度度高高高高，荧荧荧荧光光光光效效效效率率率率高高高高并并并并产产产产生生生生红红红红移移移移。因因因因此此此此，绝绝绝绝大大大大多多多多数数数数能能能能发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的物物物物质质质质为为为为含含含含有有有有芳芳芳芳香香香香环或杂环的化合物。环或杂环的化合物。环或杂环的化合物。环或杂环的化合物。（2 2 2 2）刚性平面结构刚性平面结构刚性平面结构刚性平面结构：可降低分子振动，减少了系间窜跃至三：可降低分子振动，减少了系间窜
26、跃至三：可降低分子振动，减少了系间窜跃至三：可降低分子振动，减少了系间窜跃至三重态及碰撞去活的可能性，有很强的荧光。重态及碰撞去活的可能性，有很强的荧光。重态及碰撞去活的可能性，有很强的荧光。重态及碰撞去活的可能性，有很强的荧光。（3 3 3 3）取代基的影响取代基的影响取代基的影响取代基的影响：取代基的影响分成三类：取代基的影响分成三类：n n增强荧光的取代基增强荧光的取代基增强荧光的取代基增强荧光的取代基 :-OH-OH、-OR-OR、-CN-CN、-NR-NR2 2等等等等给电给电给电给电子子子子基团。由于基团的基团。由于基团的基团。由于基团的基团。由于基团的 n n 电子云与苯环上的电
27、子云与苯环上的电子云与苯环上的电子云与苯环上的 轨道平轨道平轨道平轨道平行，行，行，行，p-p-共轭作用，扩大了共轭体系，使荧光波长长共轭作用，扩大了共轭体系，使荧光波长长共轭作用，扩大了共轭体系，使荧光波长长共轭作用，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强。移，荧光强度增强。移，荧光强度增强。移，荧光强度增强。n n减弱荧光的取代基：减弱荧光的取代基：减弱荧光的取代基：减弱荧光的取代基：-COOH-COOH、-NO-NO2 2 、-COOR-COOR、-NONO、-SH-SH 吸电子吸电子吸电子吸电子基团，使荧光强度减弱。基团，使荧光强度减弱。基团，使荧光强度减弱。基团，使荧光强度减弱
28、。芳环上被芳环上被芳环上被芳环上被F F、ClCl、BrBr、I I 取代后，使取代后，使取代后，使取代后，使系间窜跃加强系间窜跃加强系间窜跃加强系间窜跃加强，磷，磷，磷，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为减弱，磷光相应增强，这种效应为减弱，磷光相应增强，这种效应为减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应重原子效应重原子效应重原子效应。n n影响不明显的取代基影响不明显的取代基影响不明显的取代基影响不明显的取代基
29、：-NH-NH3 3+、-SO-SO3 3HH等等等等(1)(1)荧光定量关系式荧光定量关系式n n用强度为用强度为用强度为用强度为I I0 0的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质时，透过光为时，透过光为时，透过光为时，透过光为I It t，并并并并产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光I If f 。n nI If f=I Ia a=（I I0 0-I-It t ）I Ia a为为为为吸收的辐射强度吸收的辐射强度吸收的辐射强度吸收的辐射强度I I0 0为入射光强度为入射光强度为入射光强度为入射光强度荧光池I
30、 I0 0I It t I If f 荧光强度检测器n n I If f=（I I0 0-I-I0 01010-A-A ）=I I0 0 （1 1-10-10-A-A ）I It t=I I0 01010-A-A将上式展开五、荧光定量分析原理五、荧光定量分析原理当当当当A A0.020.02时，方括号中其它各项与第一项相比时，方括号中其它各项与第一项相比时，方括号中其它各项与第一项相比时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化可忽略不计，上式简化可忽略不计，上式简化可忽略不计，上式简化n n I If f=2.3 =2.3 I I0 0A A =2.3 I I0 0 bcbc当入射光
31、强度、试样池长度不变时，当入射光强度、试样池长度不变时，当入射光强度、试样池长度不变时，当入射光强度、试样池长度不变时，对一给定对一给定对一给定对一给定稀溶液，稀溶液，稀溶液，稀溶液，I I0 0、和和和和b b为常数，合并为为常数，合并为为常数，合并为为常数，合并为KK If=KC 定量分析依据定量分析依据定量分析依据定量分析依据n n浓度低时，荧光强度与物质浓度呈线形关系，浓度低时，荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC。n n浓度高时，浓度高时，If与与C不呈线形关系（有时不呈线形关系（有时C增增大，大，If反而降低）。因为公式反而降低）。因为公式 中后面影中后面影响，且有时发生荧光猝
32、灭效应或自吸效应。响，且有时发生荧光猝灭效应或自吸效应。溶剂的影响溶剂的影响溶剂的影响溶剂的影响 一般来说，溶剂的一般来说，溶剂的一般来说，溶剂的一般来说，溶剂的极性增强极性增强极性增强极性增强，荧光波长长，荧光波长长，荧光波长长，荧光波长长移，移，移，移，荧光强度增大荧光强度增大荧光强度增大荧光强度增大。温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升
33、高显著增大非辐射跃迁随温度升高显著增大非辐射跃迁随温度升高显著增大非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光。大多数荧光。大多数荧光。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。度减弱。度减弱。度减弱。温度对磷光影响更大。温度对磷光影响更大。温度对磷光影响更大。温度对磷光影响更大。（2 2）环境对荧光强度的影响）环境对荧光强度的影响 pHpH的影响的影响的影响的影响n n大多数含有大多数含有大多数含有大多数含有酸性或碱性基团酸性或碱性基团酸性或碱性基团酸性或碱性基
34、团的芳香族化合物的荧的芳香族化合物的荧的芳香族化合物的荧的芳香族化合物的荧光性质受溶液光性质受溶液光性质受溶液光性质受溶液pHpH的影响很大。的影响很大。的影响很大。的影响很大。因为，因为，因为，因为，共轭酸碱对共轭酸碱对共轭酸碱对共轭酸碱对往往是具有不同荧光性质往往是具有不同荧光性质往往是具有不同荧光性质往往是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。例：例：苯酚苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无荧光无荧光n n但但但
35、但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光分子形式无荧光，离子化后显荧光分子形式无荧光，离子化后显荧光分子形式无荧光，离子化后显荧光例：例：例：例：苯酚苯酚苯酚苯酚有荧光有荧光有荧光有荧光无荧光无荧光无荧光无荧光n n可能测得由溶剂产生的可能测得由溶剂产生的可能测得由溶剂产生的可能测得由溶剂产生的散射光散射光散射光散射光（包括瑞利、拉曼散射）。（包括瑞利、拉曼散射）。（包括瑞利、拉曼散射）。（包括瑞利、拉曼散射）。n n溶质散射光有可能与
36、荧光光谱溶质散射光有可能与荧光光谱溶质散射光有可能与荧光光谱溶质散射光有可能与荧光光谱重叠重叠重叠重叠产生较严重的干扰（产生较严重的干扰（产生较严重的干扰（产生较严重的干扰（改改改改变激发光的波长变激发光的波长变激发光的波长变激发光的波长可避免）。可避免）。可避免）。可避免）。激发光照射的影响激发光照射的影响激发光照射的影响激发光照射的影响n n在激发光的照射下，有些荧光物质的稀溶液容易发生在激发光的照射下，有些荧光物质的稀溶液容易发生在激发光的照射下，有些荧光物质的稀溶液容易发生在激发光的照射下，有些荧光物质的稀溶液容易发生光分光分光分光分解解解解，引起荧光强度的急剧降低。，引起荧光强度的急
37、剧降低。，引起荧光强度的急剧降低。，引起荧光强度的急剧降低。采用采用采用采用强度较低强度较低强度较低强度较低的激发光，同时的激发光，同时的激发光，同时的激发光，同时缩短测定时间缩短测定时间缩短测定时间缩短测定时间，可减少，可减少，可减少，可减少荧光物质的分解和由此引起的测量误差。荧光物质的分解和由此引起的测量误差。荧光物质的分解和由此引起的测量误差。荧光物质的分解和由此引起的测量误差。各种散射光的影响各种散射光的影响各种散射光的影响各种散射光的影响 n n荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引荧光物质
38、与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度下降起荧光强度下降起荧光强度下降起荧光强度下降或消失的现象或消失的现象或消失的现象或消失的现象称为称为称为称为荧光猝灭荧光猝灭荧光猝灭荧光猝灭。能引。能引。能引。能引起荧光猝灭的物质称为起荧光猝灭的物质称为起荧光猝灭的物质称为起荧光猝灭的物质称为猝灭剂猝灭剂猝灭剂猝灭剂。n n荧光猝灭的形式有多种。最常见的是荧光猝灭的形式有多种。最常见的是荧光猝灭的形式有多种。最常见的是荧光猝灭的形式有多种。最常见的是碰撞猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭 M+M+激激激激 M*M*M*+Q M*+Q M+Q+M+Q+热（无辐射）热（无辐射）热（无辐射）热（无辐射）另外
39、，某些猝灭剂分子与荧光分子发生作用，另外，某些猝灭剂分子与荧光分子发生作用，另外，某些猝灭剂分子与荧光分子发生作用，另外，某些猝灭剂分子与荧光分子发生作用，形成形成形成形成配合物或发生电子转移配合物或发生电子转移配合物或发生电子转移配合物或发生电子转移反应，也会引起荧光猝灭。反应，也会引起荧光猝灭。反应，也会引起荧光猝灭。反应，也会引起荧光猝灭。荧光猝灭荧光猝灭荧光猝灭荧光猝灭n n任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发激发激发激发光谱光谱光谱光谱和和和和发射发射发射发射光谱。它们是光谱。它们
40、是光谱。它们是光谱。它们是定性分析的基础定性分析的基础定性分析的基础定性分析的基础。n n通常通常通常通常以发射光谱作为定性的依据，以发射光谱作为定性的依据，以发射光谱作为定性的依据，以发射光谱作为定性的依据，若若若若不同物质的不同物质的不同物质的不同物质的发射光谱相似或重叠，激发光谱也可作为定性分发射光谱相似或重叠，激发光谱也可作为定性分发射光谱相似或重叠，激发光谱也可作为定性分发射光谱相似或重叠，激发光谱也可作为定性分析的另一依据。析的另一依据。析的另一依据。析的另一依据。n n最常用的荧光定性方法是最常用的荧光定性方法是最常用的荧光定性方法是最常用的荧光定性方法是比较法比较法比较法比较法
41、：在相同的分析：在相同的分析：在相同的分析：在相同的分析条件下，将待测物的荧光发射光谱或激发光谱与条件下，将待测物的荧光发射光谱或激发光谱与条件下，将待测物的荧光发射光谱或激发光谱与条件下，将待测物的荧光发射光谱或激发光谱与预期化合物的相应光谱进行比较，观察光谱的预期化合物的相应光谱进行比较，观察光谱的预期化合物的相应光谱进行比较，观察光谱的预期化合物的相应光谱进行比较，观察光谱的特特特特征峰波长及形态征峰波长及形态征峰波长及形态征峰波长及形态是否一致，加以判断。是否一致，加以判断。是否一致，加以判断。是否一致，加以判断。六、荧光定性分析六、荧光定性分析 测测测测量量量量荧荧荧荧光光光光的的的
42、的仪仪仪仪器器器器有有有有荧荧荧荧光光光光计计计计和和和和荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计，它它它它们们们们主主主主要要要要由由由由四四四四个个个个部部部部分分分分组组组组成成成成：激激激激发发发发光光光光源源源源、试试试试样样样样池池池池、双双双双单单单单色色色色器器器器系系系系统统统统、检检检检测测测测器器器器。特特特特殊殊殊殊点点点点：有有有有两两两两个个个个单单单单色色色色器器器器，光光光光源源源源与与与与检检检检测测测测器器器器通通通通常常常常成成成成直角。直角。直角。直角。基本流程图：基本流程图：基本流程图：基本流程图：12.3 12.3 荧光和磷光分析仪荧
43、光和磷光分析仪 1 1、光源、光源n n激发光源主要考虑其激发光源主要考虑其激发光源主要考虑其激发光源主要考虑其稳定性和强度稳定性和强度稳定性和强度稳定性和强度，一般要求比，一般要求比，一般要求比，一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度吸收测量中的光源有更大的发射强度吸收测量中的光源有更大的发射强度吸收测量中的光源有更大的发射强度n n滤光片荧光计中，常使用滤光片荧光计中，常使用滤光片荧光计中，常使用滤光片荧光计中，常使用高压汞灯高压汞灯高压汞灯高压汞灯；荧光分光光；荧光分光光；荧光分光光；荧光分光光度计中常用度计中常用度计中常用度计中常用氙弧灯氙弧灯氙弧灯氙弧灯利用汞蒸气放电发光的利用汞
44、蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射365 nm365 nm365 nm365 nm、405 nm405 nm405 nm405 nm、436 nm 436 nm 436 nm 436 nm 三条谱线三条谱线三条谱线三条谱线以以以以365 nm 365 nm 365 nm 365 nm 的谱线最强的谱线最强的谱线最强的谱线最强应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射源，可发射源，可发射250250250250800nm800nm800nm800nm很强的连续光源
45、很强的连续光源很强的连续光源很强的连续光源2 2、单色器、单色器n n荧光计荧光计荧光计荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱；大多数析，不能获得光谱；大多数析，不能获得光谱；大多数析，不能获得光谱；大多数荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计一般采一般采一般采一般采用用用用两个光栅单色器两个光栅单色器两个光栅单色器两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，有较高的分辨率，能扫描图谱，有较高的分辨率，能扫描图谱，有较高的分辨率，能扫描图谱，
46、既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。n n第一单色器作用第一单色器作用第一单色器作用第一单色器作用：选择所需的激发波长：选择所需的激发波长：选择所需的激发波长：选择所需的激发波长 exex ，用于用于用于用于激发试样池内的荧光物质激发试样池内的荧光物质激发试样池内的荧光物质激发试样池内的荧光物质 。n n第二单色器作用第二单色器作用第二单色器作用第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的：滤掉一些杂散光和杂质所发射的：滤掉一些杂散光和杂质所发射的：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用
47、于分离出所需检测的荧光发射波长干扰光，用于分离出所需检测的荧光发射波长干扰光，用于分离出所需检测的荧光发射波长干扰光，用于分离出所需检测的荧光发射波长 emem。3 3、试样池、试样池n n盛放测定溶液，通常是盛放测定溶液，通常是石英材料石英材料的方形或长的方形或长方形池，方形池，四面都透光四面都透光，只能用手拿棱或最上，只能用手拿棱或最上边。边。4 4、检测器、检测器n n把光信号转化成电信号，放大，直接转成荧把光信号转化成电信号，放大，直接转成荧光强度。荧光光度计一般采用光强度。荧光光度计一般采用光电倍增管光电倍增管。磷光分析仪器磷光分析仪器与与与与荧光分析仪器相似，主要差异如下：荧光分析
48、仪器相似，主要差异如下：荧光分析仪器相似，主要差异如下：荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.1.试样室试样室n n试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（77K77K，-196-196）下测定低温下测定低温下测定低温下测定低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）n n室温磷光技术室温磷光技术室温磷光技术室温磷光技术:以固体基质吸附磷光体，增加分子以固体基质吸附磷光体，增加分子以固体基质吸附磷光体，增加分子以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性，提高磷光量子效率
49、。刚性，提高磷光量子效率。刚性，提高磷光量子效率。刚性，提高磷光量子效率。2.2.磷光镜磷光镜n n有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械机械机械机械切光装置切光装置切光装置切光装置磷光镜磷光镜磷光镜磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光区别荧光和磷光。利用荧光区别荧光和磷光。利用荧光区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。即即借借助助于于荧荧光光和和磷磷光光寿寿命命的的差差
50、别别，采采用用磷磷光光镜的装置将荧光隔开。镜的装置将荧光隔开。1.1.荧光和磷光分析法的特点荧光和磷光分析法的特点优点优点优点优点：（1 1 1 1）灵敏度高）灵敏度高）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外比紫外比紫外-可见分光光度法可见分光光度法可见分光光度法可见分光光度法高高高高2 24 4个个个个数量级；为什么？数量级；为什么？数量级；为什么？数量级；为什么？黑黑黑黑背背背背景景景景下下下下检检检检测测测测，通通通通过过过过增增增增加加加加入入入入射射射射光光光光强强强强度度度度或或或或增增增增大大大大荧荧荧荧光光光光或或或或磷磷磷磷光信号的放大倍数可提高灵敏度。光信号的放大倍数可提高灵敏度