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1、第第6 6章章 分子发光分析法分子发光分析法MolecularLuminescenceAnalysis分子荧光光谱法分子荧光光谱法分子磷光光谱法分子磷光光谱法化学发光光谱法化学发光光谱法MolecularfluorescenceMolecularfluorescenceMolecularphosphorescenceMolecularphosphorescenceChemiluminescenceChemiluminescence1本章主要内容本章主要内容分子荧光与磷光光谱法分子荧光与磷光光谱法化学发光光谱法化学发光光谱法荧光与磷光产生的基本原理荧光与磷光产生的基本原理荧光与磷光产生的基本原理
2、荧光与磷光产生的基本原理荧光荧光荧光荧光/磷光与分子结构之间的关系磷光与分子结构之间的关系磷光与分子结构之间的关系磷光与分子结构之间的关系荧光荧光荧光荧光/磷光光谱法的主要参数磷光光谱法的主要参数磷光光谱法的主要参数磷光光谱法的主要参数荧光荧光荧光荧光/磷光的动态和静态猝灭及其特点磷光的动态和静态猝灭及其特点磷光的动态和静态猝灭及其特点磷光的动态和静态猝灭及其特点荧光荧光荧光荧光/磷光光谱仪及其特点磷光光谱仪及其特点磷光光谱仪及其特点磷光光谱仪及其特点化学发光产生的原理、发光反应的类别化学发光产生的原理、发光反应的类别化学发光产生的原理、发光反应的类别化学发光产生的原理、发光反应的类别以及化学
3、发光仪器以及化学发光仪器以及化学发光仪器以及化学发光仪器26-1 6-1 概概 述述一、分子发光分析法的定义某些分子吸收一定能量后，某些分子吸收一定能量后，某些分子吸收一定能量后，某些分子吸收一定能量后，价电子价电子价电子价电子从基态跃从基态跃从基态跃从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为基态，这种现象称为基态，这种现象称为基态，这种现象称为分子发光分子发光分子发光分子发光，在此基础上，在此基础上，在此基础上，在此基础上建立起来的分析方法称为建立起来的分析
4、方法称为建立起来的分析方法称为建立起来的分析方法称为分子发光分析法分子发光分析法分子发光分析法分子发光分析法吸收吸收能量能量辐辐射射光光激激发发基基 态分子态分子激发态分子激发态分子去去激激二、分子发光的类型根据激发能及发光机理不同进行分类根据激发能及发光机理不同进行分类根据激发能及发光机理不同进行分类根据激发能及发光机理不同进行分类分分分分子子子子发发发发光光光光按按激发能激发能源的不同源的不同以以以以光源光源光源光源为激发能为激发能为激发能为激发能按发光机按发光机按发光机按发光机理的不同理的不同理的不同理的不同磷光磷光磷光磷光荧光荧光荧光荧光（以（以（以（以化学反应能化学反应能化学反应能化
5、学反应能为激发能）为激发能）为激发能）为激发能）（以以以以生物体释放的能量生物体释放的能量生物体释放的能量生物体释放的能量为激发能）为激发能）为激发能）为激发能）光致发光光致发光光致发光光致发光化学发光化学发光化学发光化学发光生物发光生物发光生物发光生物发光3三、分子发光分析法的特点1 1、灵敏度高、灵敏度高、灵敏度高、灵敏度高且增加激发光源的光强度，可提高检测的灵敏度且增加激发光源的光强度，可提高检测的灵敏度2 2、选择性好、选择性好、选择性好、选择性好发发荧光和磷光的物质必须能吸收一定能量的光，荧光和磷光的物质必须能吸收一定能量的光，但能吸光的物质不一定都能发荧光和磷光但能吸光的物质不一定
6、都能发荧光和磷光3 3、可、可、可、可供供供供检测的参数多，测定的方法及技术多检测的参数多，测定的方法及技术多检测的参数多，测定的方法及技术多检测的参数多，测定的方法及技术多 （尤其是对荧光而言）（尤其是对荧光而言）（尤其是对荧光而言）（尤其是对荧光而言）4 4、操作与仪器简单、方法快速、重现性好、取样量少、操作与仪器简单、方法快速、重现性好、取样量少、操作与仪器简单、方法快速、重现性好、取样量少、操作与仪器简单、方法快速、重现性好、取样量少、线性范围宽线性范围宽线性范围宽线性范围宽5 5、适用面相对较窄、适用面相对较窄、适用面相对较窄、适用面相对较窄只能用于低浓度的测定、不少物质不能发荧光只
7、能用于低浓度的测定、不少物质不能发荧光荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法46-2 6-2 分子荧光与磷光分析法分子荧光与磷光分析法一、基本原理1 1、荧光与磷光产生的机理、荧光与磷光产生的机理、荧光与磷光产生的机理、荧光与磷光产生的机理T1isciscVRVRic icS0S1S2VR：振动驰豫振动驰豫ic：内部转换：内部转换isc：系间窜跃：系间窜跃VRic iciscisc吸光吸光吸光吸光吸光吸光吸光吸光荧光荧光荧光荧光磷光磷光磷光磷光VRVR5一、基本原理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理(1)(1)
8、非辐射去激（弛豫）过程非辐射去激（弛豫）过程非辐射去激（弛豫）过程非辐射去激（弛豫）过程 内转换（内转换（内转换（内转换（Internal ConversionInternal Conversion，ic ic）相同的多重态（电子能态）间的转换，如相同的多重态（电子能态）间的转换，如相同的多重态（电子能态）间的转换，如相同的多重态（电子能态）间的转换，如S-SS-S；T-TT-T 系间窜跃（系间窜跃（系间窜跃（系间窜跃（Intersystem ConversionIntersystem Conversion，iscisc ）不同的多重态（电子能态）间的转换，如不同的多重态（电子能态）间的转换，
9、如不同的多重态（电子能态）间的转换，如不同的多重态（电子能态）间的转换，如 S-T S-T 振动驰豫（振动驰豫（振动驰豫（振动驰豫（VibrationalVibrational Relaxation,VR Relaxation,VR）同一电子能态上不同振动能级间的转换同一电子能态上不同振动能级间的转换同一电子能态上不同振动能级间的转换同一电子能态上不同振动能级间的转换6一、基本原理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理（2 2）荧光的产生荧光的产生荧光的产生荧光的产生 当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单
10、重态S S1 1的最低振动能级回到基态的最低振动能级回到基态的最低振动能级回到基态的最低振动能级回到基态S S0 0各各各各 振动能级所产生的光辐射叫振动能级所产生的光辐射叫振动能级所产生的光辐射叫振动能级所产生的光辐射叫荧光荧光荧光荧光 荧光是相同多重态间的荧光是相同多重态间的荧光是相同多重态间的荧光是相同多重态间的允许跃迁允许跃迁允许跃迁允许跃迁，产生速度快（，产生速度快（，产生速度快（，产生速度快（1010-9-91010-6-6s s）又叫快速或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭又叫快速或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭又叫快速或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭又
11、叫快速或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都将经过非辐射弛无论开始电子被激发至什么高能级，它都将经过非辐射弛无论开始电子被激发至什么高能级，它都将经过非辐射弛无论开始电子被激发至什么高能级，它都将经过非辐射弛 豫过程回到豫过程回到豫过程回到豫过程回到S S1 1的最低振动能级上，发射荧光，所以荧光波的最低振动能级上，发射荧光，所以荧光波的最低振动能级上，发射荧光，所以荧光波的最低振动能级上，发射荧光，所以荧光波 长一般大于激发光波长。长一般大于激发光波长。长一般大于激发光波长。长一般大于激发光波长。荧荧荧荧 激激激激基态基态分子分子不同能量不同能量不同
12、能量不同能量的激发的激发的激发的激发单单单单重态重态重态重态VRic第一电子第一电子第一电子第一电子激发激发激发激发单重单重单重单重态态态态的最低的最低的最低的最低振动能级振动能级振动能级振动能级hv2发荧光发荧光发荧光发荧光电子基态电子基态电子基态电子基态单重态单重态单重态单重态的的的的各振动能各振动能各振动能各振动能级级级级hv1光激发光激发停留时间约停留时间约10-9 10-7s允许跃迁允许跃迁允许跃迁允许跃迁允许跃迁允许跃迁允许跃迁允许跃迁7一、基本原理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理（3 3）磷光的产生磷光的产生磷光的产生磷光的产生基态
13、基态分子分子不同能量不同能量不同能量不同能量的激发的激发的激发的激发单单单单重态重态重态重态第一电子第一电子第一电子第一电子激发激发激发激发三重三重三重三重态态态态的最低的最低的最低的最低振动能级振动能级振动能级振动能级hv2发荧光发荧光发荧光发荧光电子基态电子基态电子基态电子基态单重态单重态单重态单重态的的的的各振动能各振动能各振动能各振动能级级级级hv1光激发光激发VR和和icisc允可许跃迁允可许跃迁允可许跃迁允可许跃迁禁阻跃迁禁阻跃迁禁阻跃迁禁阻跃迁 当受激电子到达当受激电子到达当受激电子到达当受激电子到达S S1 1后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到
14、后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到 T T1 1各能级，再经振动驰豫到各能级，再经振动驰豫到各能级，再经振动驰豫到各能级，再经振动驰豫到 T T1 1最低振动能级，从最低振动能级，从最低振动能级，从最低振动能级，从T T1 1最低最低最低最低 振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光磷光磷光磷光 从从从从T T1 1 S S0 0要改变电子自旋，属于要改变电子自旋，属于要改变电子自旋，属于要改变电子自旋，属于禁阻跃迁，禁阻跃迁，禁
15、阻跃迁，禁阻跃迁，发光速度慢发光速度慢发光速度慢发光速度慢 （约（约（约（约1010-4-4 10s 10s），光照停止后，磷光仍可持续一段时间），光照停止后，磷光仍可持续一段时间），光照停止后，磷光仍可持续一段时间），光照停止后，磷光仍可持续一段时间 分子非辐射弛豫的能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子非辐射弛豫的能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子非辐射弛豫的能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子非辐射弛豫的能量埙耗大，所以磷光的波长更长 磷磷磷磷 荧荧荧荧 激激激激 停留时间约停留时间约10-4 10s8一、基本原理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理荧光与磷光产生的机理
16、2 2、荧光与磷光的比较、荧光与磷光的比较、荧光与磷光的比较、荧光与磷光的比较荧光荧光：S1S0；为许可跃迁；为许可跃迁磷光磷光：T1S0；为禁阻跃迁；为禁阻跃迁磷光的寿命（平均为磷光的寿命（平均为10-2s）比荧光的寿命（平均为比荧光的寿命（平均为10-8s）长）长磷光的波长比荧光波长长；磷光的波长比荧光波长长；溶液中很少观察到磷光溶液中很少观察到磷光激发光谱激发光谱荧光光谱荧光光谱磷光光谱磷光光谱9二、荧光与磷光的基本参数与测定1 1、激发与发射光谱、激发与发射光谱、激发与发射光谱、激发与发射光谱（1 1）激发光谱）激发光谱）激发光谱）激发光谱在发射光波长不变的情况下，物质的荧光在发射光波
17、长不变的情况下，物质的荧光/磷光强度随激发磷光强度随激发光波长的变化曲线光波长的变化曲线（2 2）发射光谱）发射光谱）发射光谱）发射光谱 (荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱/磷光光谱磷光光谱磷光光谱磷光光谱)在固定激发光波长下，物质的荧光在固定激发光波长下，物质的荧光/磷光强度随发射光波磷光强度随发射光波长的变化曲线长的变化曲线 磷磷磷磷 荧荧荧荧 激激激激 溶液状态下，一般有：溶液状态下，一般有：荧光荧光-激发激发=磷光磷光-激发激发=Stokes位移位移10二、荧光与磷光的基本参数与测定激发与发射光谱激发与发射光谱激发与发射光谱激发与发射光谱（3 3）荧光）荧光）荧光）荧光/磷光激发与发射
18、光谱的特点磷光激发与发射光谱的特点磷光激发与发射光谱的特点磷光激发与发射光谱的特点u 激发与发射光谱具有激发与发射光谱具有镜像关系镜像关系u发射光谱的形状与激发光波长无关发射光谱的形状与激发光波长无关萘的乙醇溶液的激发与荧光发射光谱萘的乙醇溶液的激发与荧光发射光谱u荧光的最大发射波长与最大激发荧光的最大发射波长与最大激发 波长要长波长要长,即最大发射波长与最即最大发射波长与最 大激发波长之间存在大激发波长之间存在Stokes位移位移S1S0iscT1不同激发波长下，喹啉的荧光发射光谱不同激发波长下，喹啉的荧光发射光谱 ex=352nm ex=362nm ex=372nm11二、荧光与磷光的基本
19、参数与测定2 2、荧光及磷光的寿命、荧光及磷光的寿命、荧光及磷光的寿命、荧光及磷光的寿命（）返回基态前，分子耽搁在激发态（对于返回基态前，分子耽搁在激发态（对于荧光为荧光为S1激发激发态态；对于；对于磷光为磷光为T1激发态激发态）上的平均时间）上的平均时间荧光发射过程的速率常数（荧光发射过程的速率常数（kf）磷光发射过程的速率常数（磷光发射过程的速率常数（kp）对于荧光：对于荧光：对于荧光：对于荧光：S1S0为许可跃迁，为许可跃迁，kf较大，较大，较小，一般较小，一般较小，一般较小，一般为为10-8s左右左右 对于磷光：对于磷光：对于磷光：对于磷光：T1S0为禁阻跃迁，为禁阻跃迁，kp较小，较
20、小，较大，一般较大，一般较大，一般较大，一般为为10-2s左右左右各种非辐射弛豫过程各种非辐射弛豫过程的速率常数的总和的速率常数的总和（1 1）荧光及磷光寿命荧光及磷光寿命荧光及磷光寿命荧光及磷光寿命（）的定义）的定义）的定义）的定义12二、荧光与磷光的基本参数与测定荧光及磷光的寿命荧光及磷光的寿命荧光及磷光的寿命荧光及磷光的寿命（）一些荧光体的荧光寿命一些荧光体的荧光寿命荧光体荧光体荧光寿命（荧光寿命（ns）人血清蛋白人血清蛋白4.1细胞色素细胞色素C3.5球蛋白球蛋白3.0异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素4.5丹磺酰氯丹磺酰氯14铕螯合物铕螯合物103-10613二、荧光与磷光的基本参数与测定
21、荧光及磷光的寿命荧光及磷光的寿命荧光及磷光的寿命荧光及磷光的寿命（）测定原理：测定原理：测定原理：测定原理：荧光强度的衰减满足：荧光强度的衰减满足：荧光强度的衰减满足：荧光强度的衰减满足：t=0时的荧光强度时的荧光强度t=t时的荧光强度时的荧光强度即：测定方法：测定方法：测定方法：测定方法：脉冲法脉冲法相相调制法调制法（2 2）荧光及磷光寿命荧光及磷光寿命荧光及磷光寿命荧光及磷光寿命（）的测定）的测定）的测定）的测定143 3、荧光及磷光量子产率（、荧光及磷光量子产率（、荧光及磷光量子产率（、荧光及磷光量子产率（）荧光荧光/磷光体所发射的荧光磷光体所发射的荧光/磷光的光子数与所吸收的光磷光的光
22、子数与所吸收的光子数的比值子数的比值（1 1）量子产率量子产率量子产率量子产率（）的定义）的定义）的定义）的定义荧光用荧光用 f 表示表示磷光用磷光用 p 表示表示 对于荧光：对于荧光：对于荧光：对于荧光：对于磷光：对于磷光：对于磷光：对于磷光：二、荧光与磷光的基本参数与测定从从S1到到T1系间窜系间窜跃的量子产率跃的量子产率从从T1到到S0非辐非辐射弛豫过程的射弛豫过程的速率常数速率常数衡量物质发射荧光衡量物质发射荧光衡量物质发射荧光衡量物质发射荧光/磷磷磷磷 光能力的重要参数光能力的重要参数光能力的重要参数光能力的重要参数15荧光及磷光量子产率荧光及磷光量子产率荧光及磷光量子产率荧光及磷光
23、量子产率（2 2）量子产率量子产率量子产率量子产率（）的测定）的测定）的测定）的测定二、荧光与磷光的基本参数与测定比较法比较法比较法比较法待测待测物荧光物荧光/磷光磷光量子产率量子产率参比物荧光参比物荧光/磷光磷光量子产率量子产率参比物的积分参比物的积分荧光荧光/磷光强度磷光强度待测物的积分荧光待测物的积分荧光/磷光强度磷光强度参比物在激发波参比物在激发波长下的吸光度长下的吸光度待测物在激发波待测物在激发波长下的吸光度长下的吸光度测定荧光量子产率常用参比物：测定荧光量子产率常用参比物：测定荧光量子产率常用参比物：测定荧光量子产率常用参比物：硫酸奎宁，其硫酸奎宁，其硫酸奎宁，其硫酸奎宁，其 f
24、f=0.55=0.5516二、荧光与磷光的基本参数与测定4 4、荧光、荧光、荧光、荧光/磷光强度及其与溶液浓度的关系磷光强度及其与溶液浓度的关系磷光强度及其与溶液浓度的关系磷光强度及其与溶液浓度的关系当当 bc 0.05时时在低浓度时，荧光强度与物质浓度呈线性关系在低浓度时，荧光强度与物质浓度呈线性关系在低浓度时，荧光强度与物质浓度呈线性关系在低浓度时，荧光强度与物质浓度呈线性关系荧光光谱法进行定量分析的理论依据（1 1）荧光强度（）荧光强度（）荧光强度（）荧光强度（I If f）与溶液浓度的关系）与溶液浓度的关系）与溶液浓度的关系）与溶液浓度的关系（低浓度时适用）（低浓度时适用）（低浓度时适
25、用）（低浓度时适用）17二、荧光与磷光的基本参数与测定荧光荧光荧光荧光/磷光强度与溶液浓度的关系磷光强度与溶液浓度的关系磷光强度与溶液浓度的关系磷光强度与溶液浓度的关系磷光光谱法定量分析的理论依据磷光光谱法定量分析的理论依据（2 2）磷光强度（）磷光强度（）磷光强度（）磷光强度（I Ip p）与溶液浓度的关系）与溶液浓度的关系）与溶液浓度的关系）与溶液浓度的关系当当 bc 0.90 0.9020三、荧光/磷光与分子结构的关系（3）取代基的影响）取代基的影响 给电子取代基给电子取代基给电子取代基给电子取代基v 使荧光强度增加，荧光波长红移使荧光强度增加，荧光波长红移如如如如-NR-NR2 2、-
26、OH-OH、-OR-OR、-CN-CN等等等等v 具有给电子取代基的荧光体的荧光易于受溶剂的影响具有给电子取代基的荧光体的荧光易于受溶剂的影响 吸电子取代基吸电子取代基吸电子取代基吸电子取代基 如如如如-NO-NO2 2、-CO-CO-、-N-N N N+等等等等v 使荧光强度下降，荧光波长红移使荧光强度下降，荧光波长红移v 具有吸电子取代基的荧光体的荧光也易于受溶剂的影响具有吸电子取代基的荧光体的荧光也易于受溶剂的影响 重原子取代基重原子取代基重原子取代基重原子取代基如如如如-Br-Br、-I-I、多个、多个、多个、多个-ClClv 使荧光强度下降，磷光增强使荧光强度下降，磷光增强分子结构对
27、荧光分子结构对荧光分子结构对荧光分子结构对荧光/磷光的影响磷光的影响磷光的影响磷光的影响21三、荧光/磷光与分子结构的关系22三、荧光/磷光与分子结构的关系（4）价电子跃迁类型的影响）价电子跃迁类型的影响 通常：通常：通常：通常：*-跃迁产生强跃迁产生强跃迁产生强跃迁产生强荧光荧光荧光荧光。*-n-n跃迁产生弱荧光、强跃迁产生弱荧光、强跃迁产生弱荧光、强跃迁产生弱荧光、强磷光磷光磷光磷光不含杂原子不含杂原子的芳环化合物一般是（的芳环化合物一般是（-*）激发态；）激发态；含杂原子含杂原子的芳环化合物一般是（的芳环化合物一般是（n-*）激发态；）激发态；强荧光体必须具备的条件强荧光体必须具备的条件
28、强荧光体必须具备的条件强荧光体必须具备的条件大的共轭大的共轭大的共轭大的共轭 键体系（芳环结构）；键体系（芳环结构）；键体系（芳环结构）；键体系（芳环结构）；平面刚性结构；给电平面刚性结构；给电平面刚性结构；给电平面刚性结构；给电子基团子基团子基团子基团取代取代取代取代；价电子跃迁属于；价电子跃迁属于；价电子跃迁属于；价电子跃迁属于 -*跃迁跃迁跃迁跃迁分子结构对荧光分子结构对荧光分子结构对荧光分子结构对荧光/磷光的影响磷光的影响磷光的影响磷光的影响强磷光体必须具备的条件强磷光体必须具备的条件强磷光体必须具备的条件强磷光体必须具备的条件大的共轭大的共轭大的共轭大的共轭 键体系（芳环结构）；键体
29、系（芳环结构）；键体系（芳环结构）；键体系（芳环结构）；平面刚性结构；重原平面刚性结构；重原平面刚性结构；重原平面刚性结构；重原子取代；价电子跃迁属于子取代；价电子跃迁属于子取代；价电子跃迁属于子取代；价电子跃迁属于n-n-n-n-*跃迁跃迁跃迁跃迁23四、影响分子发光的环境因素1 1、溶剂的影响、溶剂的影响、溶剂的影响、溶剂的影响（2 2）含有重原子的溶剂，由于重原子效应，增加了系间窜）含有重原子的溶剂，由于重原子效应，增加了系间窜 跃，使荧光减弱，磷光增强。跃，使荧光减弱，磷光增强。（1 1）随溶剂介电常数增大，荧光波长红移，荧光效率增大）随溶剂介电常数增大，荧光波长红移，荧光效率增大 基
30、态分子与激发态分子具有不同的偶极基态分子与激发态分子具有不同的偶极基态分子与激发态分子具有不同的偶极基态分子与激发态分子具有不同的偶极矩，因此当分子从基态跃迁到激发态时，矩，因此当分子从基态跃迁到激发态时，矩，因此当分子从基态跃迁到激发态时，矩，因此当分子从基态跃迁到激发态时，会引起周围溶剂分子中电子的重排和溶会引起周围溶剂分子中电子的重排和溶会引起周围溶剂分子中电子的重排和溶会引起周围溶剂分子中电子的重排和溶剂分子围绕激发态溶质分子偶极的重新剂分子围绕激发态溶质分子偶极的重新剂分子围绕激发态溶质分子偶极的重新剂分子围绕激发态溶质分子偶极的重新定向，这个过程称为定向，这个过程称为定向，这个过程
31、称为定向，这个过程称为溶剂松弛溶剂松弛溶剂松弛溶剂松弛。在溶剂。在溶剂。在溶剂。在溶剂松弛过程中，能量有所降低，因而导致松弛过程中，能量有所降低，因而导致松弛过程中，能量有所降低，因而导致松弛过程中，能量有所降低，因而导致发射光谱向长波位移发射光谱向长波位移发射光谱向长波位移发射光谱向长波位移n n *极性溶剂中极性溶剂中n n *非非极性溶剂中极性溶剂中（3 3）溶剂与荧）溶剂与荧/磷光体形成氢键影响发光光谱的波长与强度磷光体形成氢键影响发光光谱的波长与强度24四、影响分子发光的环境因素2 2、介质酸碱性的影响、介质酸碱性的影响、介质酸碱性的影响、介质酸碱性的影响无无无无荧光荧光荧光荧光-H
32、+pH6.4-7.4蓝色荧光蓝色荧光蓝色荧光蓝色荧光+H+pH4.8-3.4蓝色荧光蓝色荧光蓝色荧光蓝色荧光无无无无荧光荧光荧光荧光l带有酸性或碱性官 能团的荧光体的荧 光与溶液的pH有关。l pH值改变了这些 荧光体的存在形 态，从而改变了 荧光光谱25四、影响分子发光的环境因素3 3、温度及黏度的影响、温度及黏度的影响、温度及黏度的影响、温度及黏度的影响一般规律：一般规律：一般规律：一般规律：l 随介质温度的增加，荧光随介质温度的增加，荧光/磷磷 光强度下降光强度下降l 随介质黏度的增加，荧光随介质黏度的增加，荧光/磷磷 光强度增加光强度增加4 4、有序介质的影响、有序介质的影响、有序介质
33、的影响、有序介质的影响表面活性剂及大环化合物如环糊表面活性剂及大环化合物如环糊表面活性剂及大环化合物如环糊表面活性剂及大环化合物如环糊精、冠醚、杯芳烃等精、冠醚、杯芳烃等精、冠醚、杯芳烃等精、冠醚、杯芳烃等l 一般而言，有序介质的加入使体系的发光强度增加一般而言，有序介质的加入使体系的发光强度增加26五、荧光/磷光的猝灭某种给定荧光某种给定荧光某种给定荧光某种给定荧光/磷光体与溶剂或溶质分子之间发生的磷光体与溶剂或溶质分子之间发生的磷光体与溶剂或溶质分子之间发生的磷光体与溶剂或溶质分子之间发生的导致荧光导致荧光导致荧光导致荧光/磷光强度下降的物理或化学作用过程磷光强度下降的物理或化学作用过程磷
34、光强度下降的物理或化学作用过程磷光强度下降的物理或化学作用过程1 1、荧光、荧光、荧光、荧光/磷光熄灭（猝灭）的定义磷光熄灭（猝灭）的定义磷光熄灭（猝灭）的定义磷光熄灭（猝灭）的定义2 2、猝灭剂的定义、猝灭剂的定义、猝灭剂的定义、猝灭剂的定义与荧光与荧光与荧光与荧光/磷光体作用并导致荧光磷光体作用并导致荧光磷光体作用并导致荧光磷光体作用并导致荧光/磷光强度下降的物质磷光强度下降的物质磷光强度下降的物质磷光强度下降的物质3 3、荧光、荧光、荧光、荧光/磷光猝灭的主要方式（途径）磷光猝灭的主要方式（途径）磷光猝灭的主要方式（途径）磷光猝灭的主要方式（途径）u 动态猝灭（碰撞猝灭）动态猝灭（碰撞猝
35、灭）u 静态猝灭（组成化合物的猝灭）静态猝灭（组成化合物的猝灭）u 能量转移猝灭能量转移猝灭u 氧的熄灭作用氧的熄灭作用u 自猝灭自猝灭 磷光的重要猝灭途径磷光的重要猝灭途径磷光的重要猝灭途径磷光的重要猝灭途径27五、荧光/磷光的猝灭荧光荧光荧光荧光/磷光猝灭的主要方式磷光猝灭的主要方式磷光猝灭的主要方式磷光猝灭的主要方式（1）动态猝灭（碰撞猝灭）：动态猝灭（碰撞猝灭）：发光体的激发态与猝灭剂分子（发光体的激发态与猝灭剂分子（发光体的激发态与猝灭剂分子（发光体的激发态与猝灭剂分子（QQ）之间因发生碰撞而转）之间因发生碰撞而转）之间因发生碰撞而转）之间因发生碰撞而转移能量并导致激发态寿命缩短、荧
36、光移能量并导致激发态寿命缩短、荧光移能量并导致激发态寿命缩短、荧光移能量并导致激发态寿命缩短、荧光/磷光强度下降的过程。磷光强度下降的过程。磷光强度下降的过程。磷光强度下降的过程。M*M*M+hM+h 2 2（发光过程）（发光过程）（发光过程）（发光过程）kfM*M（非辐射去活化过程）非辐射去活化过程）KM*+Q M+Q+热能热能kq（动态猝灭过程）（动态猝灭过程）主要猝灭过程主要猝灭过程主要猝灭过程主要猝灭过程F F0 0、0 0和和和和 0 0分别分别分别分别为为为为无猝灭剂时的无猝灭剂时的无猝灭剂时的无猝灭剂时的发光强度、量子发光强度、量子发光强度、量子发光强度、量子产率和寿命产率和寿命
37、产率和寿命产率和寿命F F、和和和和 分别为分别为分别为分别为有有有有猝灭剂时的发猝灭剂时的发猝灭剂时的发猝灭剂时的发光强度、量子产光强度、量子产光强度、量子产光强度、量子产率和寿命率和寿命率和寿命率和寿命动态猝灭常数（动态猝灭常数（动态猝灭常数（动态猝灭常数（MM与与与与QQ的碰撞常数）的碰撞常数）的碰撞常数）的碰撞常数）Stern-Stern-VolmerVolmer 动态动态动态动态猝灭方程猝灭方程猝灭方程猝灭方程设猝灭剂的浓度为设猝灭剂的浓度为Q28五、荧光/磷光的猝灭荧光荧光荧光荧光/磷光猝灭的主要方式磷光猝灭的主要方式磷光猝灭的主要方式磷光猝灭的主要方式（2）静态猝灭（组成化合物的
38、猝灭）：静态猝灭（组成化合物的猝灭）：M+h1无猝灭剂时无猝灭剂时无猝灭剂时无猝灭剂时M*M+h 2（发光过程）（发光过程）M+热热（非辐射去活化过程）（非辐射去活化过程）有猝灭剂（有猝灭剂（有猝灭剂（有猝灭剂（QQ）时时时时猝灭过程猝灭过程猝灭过程猝灭过程发光体的基态与猝灭剂分子（发光体的基态与猝灭剂分子（发光体的基态与猝灭剂分子（发光体的基态与猝灭剂分子（QQ）之间因发生络合反应，生成了）之间因发生络合反应，生成了）之间因发生络合反应，生成了）之间因发生络合反应，生成了在测定光谱区不发光的络合物而导致发光强度下降的过程。在测定光谱区不发光的络合物而导致发光强度下降的过程。在测定光谱区不发光
39、的络合物而导致发光强度下降的过程。在测定光谱区不发光的络合物而导致发光强度下降的过程。M+Q MQ体系中体系中M的总浓度的总浓度M0为：为：M0=M+MQ 无猝灭剂及有猝灭剂存在时的发光强度无猝灭剂及有猝灭剂存在时的发光强度F0及及F的关系为的关系为静态猝灭方程静态猝灭方程静态猝灭方程静态猝灭方程猝灭猝灭猝灭猝灭常数（常数（常数（常数（MQMQ的形成常数）的形成常数）的形成常数）的形成常数）29五、荧光/磷光的猝灭荧光荧光荧光荧光/磷光猝灭的主要方式磷光猝灭的主要方式磷光猝灭的主要方式磷光猝灭的主要方式（3）动态猝灭与静态猝灭的比较动态猝灭与静态猝灭的比较 动态与静态猝灭的猝灭程度都与动态与静
40、态猝灭的猝灭程度都与QQ相关，但当动态与静相关，但当动态与静 态猝灭共存时，猝灭曲线（态猝灭共存时，猝灭曲线（F F0 0/F F对对QQ的曲线）将不是曲的曲线）将不是曲 线，而是一条向线，而是一条向F F0 0/F F方向弯曲的曲线方向弯曲的曲线 动态猝灭与激发过程无关，只影响发射动态猝灭与激发过程无关，只影响发射 光谱；静态猝灭不影响原发射过程，但光谱；静态猝灭不影响原发射过程，但 对吸收（激发）光谱产生影响对吸收（激发）光谱产生影响 动态猝灭使发光体的发光寿命下降；而动态猝灭使发光体的发光寿命下降；而 静态猝灭不改变发光体的发光寿命静态猝灭不改变发光体的发光寿命 动态猝灭和静态猝灭常数都
41、是温度（动态猝灭和静态猝灭常数都是温度（T T）的函数，但是动）的函数，但是动 态猝灭常数（态猝灭常数（K Ksvsv)随随T T 增加而增加；静态猝灭常数（增加而增加；静态猝灭常数（K K）则则 T T 增加而下降增加而下降静态猝灭方程静态猝灭方程静态猝灭方程静态猝灭方程动静态猝灭方程动静态猝灭方程动静态猝灭方程动静态猝灭方程30六、荧光/磷光分析仪器1 1、荧光分析仪器、荧光分析仪器、荧光分析仪器、荧光分析仪器与分子吸收光谱仪的区别与分子吸收光谱仪的区别与分子吸收光谱仪的区别与分子吸收光谱仪的区别有两个单色器，一个有两个单色器，一个有两个单色器，一个有两个单色器，一个为激发单色器，一个为激
42、发单色器，一个为激发单色器，一个为激发单色器，一个为发射单色器为发射单色器为发射单色器为发射单色器光源与检测器处于相光源与检测器处于相光源与检测器处于相光源与检测器处于相互垂直的位置互垂直的位置互垂直的位置互垂直的位置 exex emem31六、荧光/磷光分析仪器荧光分析仪器荧光分析仪器荧光分析仪器荧光分析仪器利用汞蒸气放电利用汞蒸气放电利用汞蒸气放电利用汞蒸气放电发光的光源；发光的光源；发光的光源；发光的光源；发射线主要有发射线主要有发射线主要有发射线主要有365365、405405、436 nm436 nm应用最广泛的应用最广泛的一种光源，可发射一种光源，可发射250800nm很强的很强的
43、连续光源连续光源（1）光源光源氙（氙（氙（氙（XeXe)灯、灯、灯、灯、高压汞（高压汞（高压汞（高压汞（HgHg）灯、灯、灯、灯、激光器激光器激光器激光器发光强度最发光强度最发光强度最发光强度最大的光源；有气大的光源；有气大的光源；有气大的光源；有气体激光器、固体激体激光器、固体激体激光器、固体激体激光器、固体激光器和半导光器和半导光器和半导光器和半导体激光器体激光器体激光器体激光器（2）单色器单色器使用汞灯或白炽灯的荧光计一般使用滤光片作为单色器；使用汞灯或白炽灯的荧光计一般使用滤光片作为单色器；使用汞灯或白炽灯的荧光计一般使用滤光片作为单色器；使用汞灯或白炽灯的荧光计一般使用滤光片作为单色
44、器；其它荧光计一般使用光栅作为单色器其它荧光计一般使用光栅作为单色器其它荧光计一般使用光栅作为单色器其它荧光计一般使用光栅作为单色器（3）样品池样品池四面石英的四面石英的四面石英的四面石英的1cm1cm样品池样品池样品池样品池（4）检测器检测器光电倍增管、二极管阵列检测器和光电倍增管、二极管阵列检测器和光电倍增管、二极管阵列检测器和光电倍增管、二极管阵列检测器和CCDCCD检测器检测器检测器检测器氙灯氙灯氢灯氢灯钨灯钨灯32六、荧光/磷光分析仪器2 2、磷光分析仪器、磷光分析仪器、磷光分析仪器、磷光分析仪器与荧光分析仪基本相似，在荧光计上配上磷光附件（与荧光分析仪基本相似，在荧光计上配上磷光附
45、件（与荧光分析仪基本相似，在荧光计上配上磷光附件（与荧光分析仪基本相似，在荧光计上配上磷光附件（磷光磷光磷光磷光镜，镜，镜，镜，包括：包括：包括：包括：低温杜瓦瓶和斩光片低温杜瓦瓶和斩光片低温杜瓦瓶和斩光片低温杜瓦瓶和斩光片）后，即可用于磷光测定）后，即可用于磷光测定）后，即可用于磷光测定）后，即可用于磷光测定（1 1）试样室）试样室）试样室）试样室将试样放在盛将试样放在盛液氮液氮的石英杜瓦的石英杜瓦瓶内，即可用于瓶内，即可用于低温低温磷光测定磷光测定（2 2）磷光镜）磷光镜）磷光镜）磷光镜 当物质当物质同时同时同时同时会发生会发生荧光和磷光时荧光和磷光时荧光和磷光时荧光和磷光时，为在有荧光的
46、体系中测定磷光，为在有荧光的体系中测定磷光，须在激发单色器和样品池间以及须在激发单色器和样品池间以及在样品池和发射单色器间各装一在样品池和发射单色器间各装一个个斩波片斩波片斩波片斩波片，并由一个同步马达带，并由一个同步马达带动，这种装置称作动，这种装置称作磷光镜磷光镜磷光镜磷光镜。33七、荧光的常规测定方法以以荧光激发与发射光谱作为定性参数、荧光强度为定量参数荧光激发与发射光谱作为定性参数、荧光强度为定量参数的荧光方法称为的荧光方法称为常规荧光法常规荧光法分分分分类类类类用于测定自身具有荧光的物质用于测定自身具有荧光的物质用于测定自身具有荧光的物质用于测定自身具有荧光的物质用于无荧光用于无荧光
47、用于无荧光用于无荧光或弱荧光物或弱荧光物或弱荧光物或弱荧光物质的测定质的测定质的测定质的测定通过化学反应使无荧光及弱荧光的物质通过化学反应使无荧光及弱荧光的物质转化为强荧光体进行测定转化为强荧光体进行测定利用无荧光及弱荧光物质对强荧光体的利用无荧光及弱荧光物质对强荧光体的猝灭进行测定猝灭进行测定荧光衍生法：荧光衍生法：荧光衍生法：荧光衍生法：荧光猝灭法荧光猝灭法荧光猝灭法荧光猝灭法敏化荧光法敏化荧光法A+hA+h 1 1A A*A被被激发激发+B B能量能量交换交换B被被激发激发A A+B B*B B+h+h 2 2敏化荧光敏化荧光测定对象测定对象测定对象测定对象直接荧光法：直接荧光法：直接荧
48、光法：直接荧光法：间接荧光法：间接荧光法：间接荧光法：间接荧光法：多组分荧光分析多组分荧光分析多组分荧光分析多组分荧光分析可用常规荧光法测定；可用常规荧光法测定；也可用同步荧光法、导数荧光法、时间分辨荧也可用同步荧光法、导数荧光法、时间分辨荧光法和荧光偏振法等测定光法和荧光偏振法等测定34八、磷光的常规测定方法1 1、低温磷光低温磷光低温磷光低温磷光（1 1 1 1）对溶剂的要求）对溶剂的要求）对溶剂的要求）对溶剂的要求 （2 2 2 2）常用的溶剂）常用的溶剂）常用的溶剂）常用的溶剂用液氮作冷却剂（用液氮作冷却剂（用液氮作冷却剂（用液氮作冷却剂（77K77K77K77K）易提纯且在分析波长区
49、无强吸收和发射易提纯且在分析波长区无强吸收和发射 低温下形成具足够粘度的透明的刚性玻璃体低温下形成具足够粘度的透明的刚性玻璃体 能很好地溶解被分析物能很好地溶解被分析物 EPA乙醇乙醇+异戊烷异戊烷+二乙醚（二乙醚（2+2+5）IEPACH3I+EPA（1+10）乙醇乙醇+甲醇甲醇+C2H5I（16+4+1）35八、磷光的常规测定方法2 2、室温磷光、室温磷光、室温磷光、室温磷光（1 1 1 1）固体基质（固体表面）磷光固体基质（固体表面）磷光固体基质（固体表面）磷光固体基质（固体表面）磷光此法基于测量室温下此法基于测量室温下吸附吸附吸附吸附于固体基质（于固体基质（载体载体载体载体）上的有机）
50、上的有机化合物所发射的磷光。化合物所发射的磷光。能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加刚性，能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加刚性，并减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程并减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程 理想的载体理想的载体理想的载体理想的载体 本身不产生磷光背景。本身不产生磷光背景。常用载体常用载体常用载体常用载体滤纸滤纸滤纸滤纸、纤维素、硅胶、玻璃纤维、溴化钾等、纤维素、硅胶、玻璃纤维、溴化钾等36八、磷光的常规测定方法室温磷光室温磷光室温磷光室温磷光（2 2 2 2）胶束增稳的溶液室温磷光法）胶束增稳的溶液室温磷光法）胶束增稳的溶液室温磷光法）胶束增稳的溶液室温磷光