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1、Modern Instrument Analytical Method仪器分析课程仪器分析课程仪器分析课程仪器分析课程厦门大学精品课程厦门大学精品课程厦门大学精品课程厦门大学精品课程仪器分析仪器分析仪器分析仪器分析(含实验含实验含实验含实验)第十二章第十二章第十二章第十二章Chapter Twelve分子荧光分子荧光分子荧光分子荧光分子荧光分子荧光:FluorescenceFluorescenceFluorescence分子磷光分子磷光分子磷光分子磷光分子磷光分子磷光:PhosphorescencePhosphorescencePhosphorescenceModern Instrument
2、Analytical Method12.1 分子发光的基本原理分子发光的基本原理vv第第第第一一一一次次次次记记记记录录录录荧荧荧荧光光光光现现现现象象象象的的的的是是是是1616世世世世纪纪纪纪西西西西班班班班牙牙牙牙的的的的内内内内科科科科医医医医生生生生和和和和植植植植物物物物学学学学家家家家N.MonardesN.Monardes，15751575年年年年 他他他他 提提提提 到到到到 在在在在 含含含含 有有有有 一一一一 种种种种 称称称称 为为为为“Lignum Lignum NephriticumNephriticum”的的的的木木木木头头头头切切切切片片片片的的的的水水水水溶
3、溶溶溶液液液液中中中中，呈呈呈呈现现现现了了了了极极极极为为为为可可可可爱爱爱爱的的的的天天天天蓝蓝蓝蓝色。色。色。色。vv直直直直到到到到18521852年年年年，StokesStokes在在在在考考考考察察察察奎奎奎奎宁宁宁宁和和和和叶叶叶叶绿绿绿绿素素素素的的的的荧荧荧荧光光光光时时时时，用用用用分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计观观观观察察察察到到到到其其其其荧荧荧荧光光光光的的的的波波波波长长长长比比比比入入入入射射射射光光光光的的的的波波波波长长长长稍稍稍稍微微微微长长长长些些些些，才才才才判判判判断断断断这这这这种种种种现现现现象象象象是是是是这这这这些些些些物物物物质质质
4、质在在在在吸吸吸吸收收收收光光光光能能能能后后后后重重重重新新新新发发发发射射射射不不不不同同同同波波波波长长长长的的的的光光光光，而而而而不不不不是是是是由由由由光光光光的的的的漫漫漫漫射射射射作作作作用用用用所所所所引引引引起起起起的的的的，从从从从而而而而导导导导入入入入了了了了荧荧荧荧光光光光是是是是光光光光发发发发射射射射的的的的概概概概念念念念，他还由发荧光的矿石他还由发荧光的矿石他还由发荧光的矿石他还由发荧光的矿石“萤石萤石萤石萤石”推演而提出推演而提出推演而提出推演而提出“荧光荧光荧光荧光”这一术语。这一术语。这一术语。这一术语。vv18671867年年年年，Goppelsro
5、derGoppelsroder进进进进行行行行了了了了历历历历史史史史上上上上首首首首次次次次的的的的荧荧荧荧光光光光分分分分析析析析工工工工作作作作，应应应应用铝用铝用铝用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。桑色素配合物的荧光进行铝的测定。桑色素配合物的荧光进行铝的测定。桑色素配合物的荧光进行铝的测定。vv1919世世世世纪纪纪纪以以以以前前前前，荧荧荧荧光光光光的的的的观观观观察察察察是是是是靠靠靠靠肉肉肉肉眼眼眼眼进进进进行行行行的的的的，直直直直到到到到19281928年年年年，才才才才由由由由JetteJette和和和和WestWest提出了第一台荧光计。提出了第一台荧光计。提出了第一
6、台荧光计。提出了第一台荧光计。Modern Instrument Analytical Method一一一一.分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生1.1.单重态与三重态单重态与三重态单重态与三重态单重态与三重态2.2.分子的活化与去活化分子的活化与去活化分子的活化与去活化分子的活化与去活化3.3.分子发光的类型分子发光的类型分子发光的类型分子发光的类型按激发的模式分类：按激发的模式分类：按激发的模式分类：按激发的模式分类：按分子激发态的类型分类：按分子激发态的类型分类：按分子激发态的类型分类：按分子激发态的类型分类：光致发光光致发光光致发光光致发光化
7、学发光化学发光化学发光化学发光/生物发光生物发光生物发光生物发光热致发光热致发光热致发光热致发光场致发光场致发光场致发光场致发光摩擦发光摩擦发光摩擦发光摩擦发光 分子发光分子发光分子发光分子发光分子发光分子发光分子发光分子发光荧光荧光荧光荧光磷光磷光磷光磷光瞬时荧光瞬时荧光瞬时荧光瞬时荧光迟滞荧光迟滞荧光迟滞荧光迟滞荧光按光子能量分类：按光子能量分类：按光子能量分类：按光子能量分类：斯托克斯荧光斯托克斯荧光斯托克斯荧光斯托克斯荧光(Stokes)(Stokes)：exex emem共振荧光共振荧光共振荧光共振荧光(Resonance)(Resonance)：exex=emem 荧光荧光荧光荧光
8、 Modern Instrument Analytical Method分子的活化与去活化分子的活化与去活化分子的活化与去活化分子的活化与去活化S S0 0S S1 1T T1 1S S2 2紫紫紫紫外外外外可可可可见见见见吸吸吸吸收收收收光光光光谱谱谱谱外转移外转移外转移外转移紫紫紫紫外外外外可可可可见见见见共共共共振振振振荧荧荧荧光光光光光光光光谱谱谱谱内转移内转移内转移内转移荧光荧光荧光荧光系间系间系间系间窜跃窜跃窜跃窜跃磷磷磷磷光光光光反系间反系间反系间反系间窜跃窜跃窜跃窜跃迟迟迟迟滞滞滞滞荧荧荧荧光光光光振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫.无辐射跃迁的类型无辐射跃迁的类型无辐射跃迁的类
9、型无辐射跃迁的类型振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫:V Vr r 1010-12-12secsec外外外外 转转转转 移移移移:无辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁回到基态回到基态回到基态回到基态内内内内 转转转转 移移移移:S S2 2SS1 1能级能级能级能级之间有重叠之间有重叠之间有重叠之间有重叠系间窜跃系间窜跃系间窜跃系间窜跃:S S2 2TT1 1能级能级能级能级之间有重叠之间有重叠之间有重叠之间有重叠反系间窜跃反系间窜跃反系间窜跃反系间窜跃:由外部获由外部获由外部获由外部获取能量后取能量后取能量后取能量后 T T1 1 S S2 2.辐射跃迁的类型辐射跃迁的类型辐射跃迁的类型辐
10、射跃迁的类型共振荧光：共振荧光：共振荧光：共振荧光：1010-12-12 secsec荧荧荧荧 光：光：光：光：1010-8-8 secsec磷磷磷磷 光：光：光：光：110110-4-4 secsec迟滞荧光迟滞荧光迟滞荧光迟滞荧光:10102 21010-4-4 secsecModern Instrument Analytical Method二二二二.分子荧光分子荧光分子荧光分子荧光(磷光磷光磷光磷光)光谱光谱光谱光谱1.1.荧光荧光荧光荧光(磷光磷光磷光磷光)激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱荧光荧光荧光荧光(磷光磷光磷光磷光)均为光致发光，在光辐
11、射的作用下，荧光物质发射出不均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。同波长的荧光。同波长的荧光。同波长的荧光。A.A.激发光谱激发光谱激发光谱激发光谱固定固定固定固定 emem=620nm(MAX)=620nm(MAX)exex=290nm =290nm(MAX)(MAX)固定发射波长固定发射波长固定发射波长固定发射波长扫描激发波长扫描激发波长扫描激发波长扫描激发波长荧光激发光谱与荧光激发光谱与荧光激发光谱与荧光激发光谱与紫外紫外紫外紫外-可见吸收光可见吸收光可见吸收光可见吸收
12、光谱类似谱类似谱类似谱类似Modern Instrument Analytical Method exex=290nm =290nm(MAX)(MAX)固定固定固定固定 emem=620nm(MAX)=620nm(MAX)固定固定固定固定 exex=290nm=290nm(MAX)(MAX)emem=620nm 620nm(MAX)(MAX)B.B.发射光谱发射光谱发射光谱发射光谱(荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱)固定激发波长固定激发波长固定激发波长固定激发波长 扫描发射波长扫描发射波长扫描发射波长扫描发射波长C.C.激发光谱与发射激发光谱与发射激发光谱与发射激发光谱与发射光谱的镜像关系光谱
13、的镜像关系光谱的镜像关系光谱的镜像关系S S0 04 43 32 21 1S S1 14 43 32 21 1发射光谱的形状与激发波长无关：发射光谱的形状与激发波长无关：发射光谱的形状与激发波长无关：发射光谱的形状与激发波长无关：分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于使分子被激发到高于使分子被激发到高于使分子被激发到高于S S1 1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛
14、豫降到的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S S1 1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。1 1 4 41 1 3 31 1 2 21 11 11 1 4 41 1 4 41 1 2 21 1 1 1Modern Instrument Analytical MethodI I F F f f f f
15、(exex 、emem)蒽的发射光谱蒽的发射光谱蒽的发射光谱蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图 蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱Modern Instrument Analytical MethodVBVB1 1和和和和VBVB2 2的三维荧光光谱的三维荧光光谱的三维荧光光谱的三维荧光光谱RLSRLSDSDSTSTSATSATSADSADS散射片三维共振光散射光谱散射片三维共振光
16、散射光谱散射片三维共振光散射光谱散射片三维共振光散射光谱3.3.3.3.三维共振光散射光谱三维共振光散射光谱三维共振光散射光谱三维共振光散射光谱ADSADSADSADSATSATSATSATSTS TS TS TSRLSRLSRLSRLSDS DS DS DS散射片三维共振光散射等高线光谱图散射片三维共振光散射等高线光谱图散射片三维共振光散射等高线光谱图散射片三维共振光散射等高线光谱图共振光散射共振光散射共振光散射共振光散射瑞利散射瑞利散射瑞利散射瑞利散射固定固定固定固定 exex=270nm=270nm拉曼光拉曼光拉曼光拉曼光二级共振光散射二级共振光散射二级共振光散射二级共振光散射三级共振光
17、散射三级共振光散射三级共振光散射三级共振光散射荧光光谱有用区间荧光光谱有用区间荧光光谱有用区间荧光光谱有用区间Modern Instrument Analytical Method三三三三.分子荧光分子荧光分子荧光分子荧光(磷光磷光磷光磷光)强度与荧光物质浓度的关强度与荧光物质浓度的关强度与荧光物质浓度的关强度与荧光物质浓度的关系系系系1.1.荧光强度荧光强度荧光强度荧光强度(磷光磷光磷光磷光)与浓度的关系与浓度的关系与浓度的关系与浓度的关系光吸收定律光吸收定律光吸收定律光吸收定律（Lambert Beer LawLambert Beer Law）相应的吸光分数为：相应的吸光分数为：相应的吸光
18、分数为：相应的吸光分数为：荧光强度（荧光强度（荧光强度（荧光强度（I IF F）与相应的吸光分数成正比：）与相应的吸光分数成正比：）与相应的吸光分数成正比：）与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：按照级数展开式：按照级数展开式：按照级数展开式：Modern Instrument Analytical Method对于稀溶液，当对于稀溶液，当对于稀溶液，当对于稀溶液，当 bc bc0.0.0505（磷光磷光磷光磷光 bc bc0.10001000 p p(s)(s)2.62.62.52.51.41.40.230.230.0140.0140.00230.00236.6.溶剂效应溶剂效应溶剂效应溶
19、剂效应蓝移蓝移蓝移蓝移:E E n*n*E E n*n*红移红移红移红移:E E*E E*在极性溶剂中：在极性溶剂中：在极性溶剂中：在极性溶剂中：无溶剂化作用无溶剂化作用无溶剂化作用无溶剂化作用有溶剂化作用有溶剂化作用有溶剂化作用有溶剂化作用Modern Instrument Analytical Method三三三三.金属螯合物的荧光金属螯合物的荧光金属螯合物的荧光金属螯合物的荧光1.1.螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光2.2.螯合物中金属离子的发光螯合物中金属离子的发光螯合物中金属离子的发光螯合物中金属离子的发光8-8-羟基喹啉羟基喹啉羟基喹
20、啉羟基喹啉弱荧光弱荧光弱荧光弱荧光8-8-羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉-Zn-Zn螯合螯合螯合螯合物物物物黄绿色强荧光黄绿色强荧光黄绿色强荧光黄绿色强荧光2,2-2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯无荧光无荧光无荧光无荧光2,2-2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯-Al-Al螯合物螯合物螯合物螯合物强荧光强荧光强荧光强荧光T T1 1系间窜跃系间窜跃系间窜跃系间窜跃S S0 0S S1 1d d*、f f*d d*d d f f*f f 荧光荧光荧光荧光分子内能量转移分子内能量转移分子内能量转移分子内能量转移Modern Instrument An
21、alytical Method四四四四.荧光的熄灭荧光的熄灭荧光的熄灭荧光的熄灭1.1.碰撞熄灭碰撞熄灭碰撞熄灭碰撞熄灭荧荧荧荧 光光光光 熄熄熄熄 灭灭灭灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光强度降低或消失的现象。荧光强度降低或消失的现象。荧光强度降低或消失的现象。荧光熄灭剂荧光熄灭剂荧光熄灭剂荧光熄灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。：这些溶剂分子或其它溶质分
22、子称为荧光熄灭剂。：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。相对速率相对速率相对速率相对速率 1 1K K1 1 M M*K K2 2 MM*Q Q 与分子的直径、与分子的直径、与分子的直径、与分子的直径、粘度、温度等因素粘度、温度等因素粘度、温度等因素粘度、温度等因素有关。有关。有关。有关。2.2.能量转移熄灭能量转移熄灭能量转移熄灭能量转移熄灭再吸收过程：再吸收过程：再吸收过程：再吸收过程：共振能量转移：共振能量转移：共振能量转移：共振能量转移：分子内能量转移：分子内能量转移：分子内能量转移：分子内能量转移：hvhv激发激发激发激发发射发射发射发射熄灭熄灭熄灭熄灭Modern Instr
23、ument Analytical Method3.3.氧的熄灭作用氧的熄灭作用氧的熄灭作用氧的熄灭作用氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，4.4.自熄灭与自吸收自熄灭与自吸收自熄灭与自吸收自熄灭与自吸收当荧光物质的浓度大于当荧光物质的浓度大于当荧光物质的浓度大于当荧光物质的浓度大于1g/L1g/L时，常发生荧光的自熄灭时，常发生荧光的自熄灭时，常发生荧光的自熄灭时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭浓度熄灭浓度熄灭浓度熄灭)自吸收：自吸收：自吸收：自吸收：没有除氧，溶液中没有除氧，溶液中没有除氧，溶液中没有除氧，溶液中难以观
24、察到磷光难以观察到磷光难以观察到磷光难以观察到磷光由于由于由于由于 F F 1 1，使荧光，使荧光，使荧光，使荧光强度减弱或消失强度减弱或消失强度减弱或消失强度减弱或消失.形成二聚体：形成二聚体：形成二聚体：形成二聚体：由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。灭现象。灭现象。灭现象。Modern Instrument Analytical Method12.3 12.3 荧光荧光荧光荧光(磷光磷光磷光磷光)分光光度计分光
25、光度计分光光度计分光光度计一一一一.主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源光源光源光源氙氙氙氙灯灯灯灯激发单色器激发单色器激发单色器激发单色器样品池样品池样品池样品池光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据
26、处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器发射单色器发射单色器发射单色器发射单色器问问问问题题题题：荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计与与与与紫紫紫紫外外外外-可可可可见见见见分分分分光光光光光度计有何异同点？光度计有何异同点？光度计有何异同点？光度计有何异同点？Modern Instrument Analytical Method二二二二.光源光源光源光源1.1.光源的要求：光源的要求：光源的要求：光源的要求：vv发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱vv光辐射强
27、度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小vv有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命2.2.氙灯光源氙灯光源氙灯光源氙灯光源常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：氙灯光源氙灯光源氙灯光源氙灯光源 高压汞光源高压汞光源高压汞光源高压汞光源波长范围：波长范围：波长范围：波长范围：2001000nm2001000nm工作压力：工作压力：工作压力：工作压力：520 atm520 atm启动电压：启动电压：启动电压：启动电压：2040KV2040KV使用寿命：使用寿命：使用寿命：使用
28、寿命：10002000h10002000h最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：发射波长范围宽发射波长范围宽发射波长范围宽发射波长范围宽 发射光强度大发射光强度大发射光强度大发射光强度大Modern Instrument Analytical Method3.3.高压汞灯光源高压汞灯光源高压汞灯光源高压汞灯光源应用广泛的应用广泛的应用广泛的应用广泛的线光源线光源线光源线光源：253.7253.7 296.5 302.2 312.6 296.5 302.2 312.6313.2 313.2 365.0 365.0 365.5 366.3365.5
29、 366.3404.7 435.8404.7 435.8 546.1 557.0 546.1 557.0579.0 579.0 (nm)(nm)光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发滤光片滤光片滤光片滤光片检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发滤光片滤光片滤光片滤光片检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射滤光片滤光片滤光片滤光片Modern Instrument An
30、alytical Method玻玻玻玻璃璃璃璃滤滤滤滤光光光光片片片片的的的的透透透透射射射射率率率率干干干干涉涉涉涉滤滤滤滤光光光光片片片片的的的的透透透透射射射射率率率率截截截截止止止止涉涉涉涉滤滤滤滤光光光光片片片片的的的的透透透透射射射射率率率率Modern Instrument Analytical Method三三三三.单色单色单色单色器器器器 平面衍射光栅平面衍射光栅平面衍射光栅平面衍射光栅线色散率线色散率线色散率线色散率聚光本领聚光本领聚光本领聚光本领分辨率分辨率分辨率分辨率四四四四.检测器检测器检测器检测器光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管 放大倍数：放大倍数：放大倍数
31、：放大倍数：2 2 2 2n n n n 5 5 5 5n n n n;n=10,10;n=10,10;n=10,10;n=10,103 3 3 3 101010107 7 7 7，最大最大最大最大101010108 8 8 8 101010109 9 9 9五五五五.样品池：液池、荧光池样品池：液池、荧光池样品池：液池、荧光池样品池：液池、荧光池1.1.样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样2.2.吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外吸收池的形状
32、：紫外吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围波长范围波长范围波长范围3.3.使用注意事项使用注意事项使用注意事项使用注意事项容易破碎容易破碎容易破碎容易破碎问题：问题：问题：问题：紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什
33、么区别？样品池有什么区别？样品池有什么区别？样品池有什么区别？沾污问题沾污问题沾污问题沾污问题闪跃特性闪跃特性闪跃特性闪跃特性Modern Instrument Analytical Method六六六六.磷光分光光度计磷光分光光度计磷光分光光度计磷光分光光度计1.1.光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器切
34、光器（斩波器）切光器（斩波器）切光器（斩波器）切光器（斩波器）共振荧光：共振荧光：共振荧光：共振荧光：1010-12-12 secsec荧荧荧荧 光：光：光：光：1010-8-8 secsec磷磷磷磷 光：光：光：光：110110-4-4 secsec迟滞荧光：迟滞荧光：迟滞荧光：迟滞荧光：1001010010-4-4 secsec2.2.样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别通常情况下，样品池需要放在盛通常情况下，样品池需要放在盛通常情况下，样品池需要放在盛通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶液氮的石英杜瓦瓶液
35、氮的石英杜瓦瓶液氮的石英杜瓦瓶内，来测定内，来测定内，来测定内，来测定低温磷光低温磷光低温磷光低温磷光。Modern Instrument Analytical Method12.12.荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用一一一一.工作曲线法工作曲线法工作曲线法工作曲线法荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高10103 310104 4.荧光熄灭工作曲线法荧光熄灭工作曲线法荧光熄灭工作曲线法荧光熄灭工作曲线法F Fx xF FC Cs sC Cx x直接
36、荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法F FC Cs sF Fx xC Cx x二二二二.荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度Modern Instrument Analytical Method在在在在紫紫紫紫外外外外光光光光照照照照射射射射下下下下会会会会发发发发生生生生荧荧荧荧光光光光的的的的无无无无机机机机化化化化合合合合物物物物很很很很少少少少，主主主主要要要要依依依依赖赖赖赖于于于于有机试剂形成的螯合物。有机试剂形成的螯合物。有机试剂形成的螯合物。有机试剂形成的螯合物。三三三三.荧光分析的应用荧光分析的应用荧光分析的
37、应用荧光分析的应用1.1.无机化合物无机化合物无机化合物无机化合物vv直接荧光测定法直接荧光测定法直接荧光测定法直接荧光测定法其其其其中中中中，较较较较常常常常测测测测定定定定的的的的元元元元素素素素有有有有：BeBe、AlAl、B B、GaGa、SeSe、MgMg、ZnZn、CdCd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到1010-10-10;某某某某些些些些元元元元素素素素虽虽虽虽然然然然不不不不与与与与有有有有机机机机试试试试剂剂剂剂形形形形成成成成发发发发荧荧荧荧光光
38、光光的的的的配配配配合合合合物物物物，但但但但是是是是它它它它会会会会与与与与发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合物物物物争争争争夺夺夺夺配配配配位位位位体体体体，组组组组成成成成不不不不发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合，使使使使其其其其产产产产生生生生荧荧荧荧光光光光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：F F、S S、FeFe、AgAg、CoCo、NiNi、CuCu、MoMo、W
39、Wvv荧光熄灭测定法荧光熄灭测定法荧光熄灭测定法荧光熄灭测定法 自自自自从从从从18671867年年年年GoppelsroderGoppelsroder进进进进行行行行了了了了历历历历史史史史上上上上首首首首次次次次的的的的荧荧荧荧光光光光分分分分析析析析工工工工作作作作，应应应应用用用用铝铝铝铝桑桑桑桑色色色色素素素素配配配配合合合合物物物物的的的的荧荧荧荧光光光光进进进进行行行行铝铝铝铝的的的的测测测测定定定定以以以以来来来来，采采采采用用用用有机试剂可以测定有机试剂可以测定有机试剂可以测定有机试剂可以测定7070多种元素。多种元素。多种元素。多种元素。Modern Instrument
40、Analytical Methodvv催化荧光测定法催化荧光测定法催化荧光测定法催化荧光测定法较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：CrCr、NbNb、U U、TeTe、PbPb某某某某些些些些元元元元素素素素虽虽虽虽然然然然与与与与有有有有机机机机试试试试剂剂剂剂形形形形成成成成发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合物物物物，但但但但是是是是反反反反应应应应速速速速度度度度慢慢慢慢，在在在在某某某某些些些些微微微微量量量量元元元元素素素素的的的的催催催催化化化化下下下下，反反反反应应应应速速速速度度度度会会会会加加加加快快快快，在在在在特特特特定定
41、定定的的的的时时时时间内可用来测定微量元素。间内可用来测定微量元素。间内可用来测定微量元素。间内可用来测定微量元素。vv低温荧光测定法低温荧光测定法低温荧光测定法低温荧光测定法常测定的元素有：常测定的元素有：常测定的元素有：常测定的元素有：CuCu、BeBe、FeFe、CoCo、OsOs、AgAg、AuAu、ZnZn、AlAl、TiTi、V V、MnMn、ErEr、H H2 2OO2 2、CNCN某某某某些些些些微微微微量量量量元元元元素素素素存存存存在在在在，会会会会催催催催化化化化发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合物物物物产产产产生生生生荧荧荧荧光光光光熄熄熄熄灭灭灭灭，在特
42、定的时间内可用来测定微量元素。在特定的时间内可用来测定微量元素。在特定的时间内可用来测定微量元素。在特定的时间内可用来测定微量元素。溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮 1961960 0C C较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：CeCe、SmSm、Tb Tb 等稀土元素等稀土元素等稀土元素等稀土元素SbSb、V V、PbPb、BiBi、NbNb、MnMnvv固体荧光测定法固体荧光测定法固体荧光测定法固体荧光测定法固体荧
43、光发在荧光分析中也经常用到。固体荧光发在荧光分析中也经常用到。固体荧光发在荧光分析中也经常用到。固体荧光发在荧光分析中也经常用到。Modern Instrument Analytical Method芳芳芳芳香香香香族族族族化化化化合合合合物物物物存存存存在在在在共共共共轭轭轭轭的的的的不不不不饱饱饱饱和和和和体体体体系系系系，是是是是有有有有机机机机化化化化合合合合物物物物荧荧荧荧光光光光测测测测定的主要类型。定的主要类型。定的主要类型。定的主要类型。.有机化合物有机化合物有机化合物有机化合物待测物待测物待测物待测物试剂试剂试剂试剂 exexmaxmax ememmaxmax测定范围测定范围
44、测定范围测定范围 ppm ppm丙三醇丙三醇丙三醇丙三醇苯胺苯胺苯胺苯胺紫外紫外紫外紫外蓝色蓝色蓝色蓝色0.120.12糠醛糠醛糠醛糠醛蒽酮蒽酮蒽酮蒽酮4654655055051.5151.515氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氧化酶氧化酶氧化酶氧化酶3153154254250.01500.0150维生素维生素维生素维生素A A无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇345345490490020020蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质曙红丫曙红丫曙红丫曙红丫紫外紫外紫外紫外5405400.0660.066肾上腺素肾上腺素肾上腺素肾上腺素乙二胺乙二胺乙二胺乙二胺4204205255250.0010.020.0010.0
45、2 青霉素青霉素青霉素青霉素-甲氧基甲氧基甲氧基甲氧基-氯氯氯氯-(-(-氨乙基氨乙基氨乙基氨乙基)-)-氨基氮杂蒽氨基氮杂蒽氨基氮杂蒽氨基氮杂蒽4204205005000.06250.6250.06250.625玻璃酸梅玻璃酸梅玻璃酸梅玻璃酸梅3-3-乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚3953954704700.0010.0330.0010.033胍基丁胺胍基丁胺胍基丁胺胍基丁胺邻苯二醛邻苯二醛邻苯二醛邻苯二醛3653654704700.0550.055四氧嘧啶四氧嘧啶四氧嘧啶四氧嘧啶苯二胺苯二胺苯二胺苯二胺3653654854851010-4-43.3.生命与生物物质生命与生
46、物物质生命与生物物质生命与生物物质Modern Instrument Analytical Method紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制荧光荧光荧光荧光(磷光磷光磷光磷光)分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器Modern Instrument Analytical Method紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计测量池测量池测量池测量池(吸收池吸收池吸收池吸收池)荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计样品池样品池样品池样品池I0ItI0ItIF,p