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1、ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1248.11-2016 玉米抗病虫性鉴定技术规范第11部分:灰斑病Technical specification on evaluation of maize resistance to pes臼一Part 11:Gray leaf spot 2016-10-26发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1248.11一2016目IJ1=1 农国全斤1l 瞅凯阱喃砌制主1由究院hf学脚来川学业斗农林分省农部叫四r所J石为究所、分轧研究阳刚起护研到百刊保学J见组L物科贤和。即王植物世技分出削院作孙定部
2、给出悖院立鉴;1提山阳山仔细唱此住院航班时庇时胁毗概叫苗时才斑斑黑花米霉抱抱枯弯灰瘤粗T种古由川九三大小丝矮玉腐镰镰纹、/im处处A川除川陕八优除除附附时附川臼脚靴机辟部部部主口在古部4川口守-n0121照农草务要112345678911IU为按闹起服主T第第第第第第第第第第第第第分分分分广分盯一一一一一一一一一部部部部推部N一一一一-一一一一一一一一本本本本术本技业I 范围玉米抗病虫性鉴定技术规范第11部分:灰斑病本部分规定了玉米抗灰斑病鉴定技术方法和抗性评价标准。NY/T 1248.11-2016 本部分仅适用于栽培玉米CZeamays L.)自交系、杂交种、群体、开放授粉品种以及野生玉米
3、和玉米近缘种对灰斑病抗性的田间鉴定和评价。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1 灰斑病gray leaf spot 由尾子包属CCercosporaFres.)真菌侵染，引起以叶片、叶黯、苞叶产生灰白色、浅褐色狭长形病斑为特征的玉米病害。在中同，主要致病种为玉蜀泰尾抱(Cercos户orazeae-mydis Tehon et E.Y.Dan-iels)和玉米尾抱(Cercos户orazeil1a Crous et U.Braun)。3 尾抱菌接种体制备3.1 病原物分离以单抱分离法或常规组织分离法从发病植株叶片的典型病斑上分离灰斑病病原物。分离物经形态学鉴定确认为尾抱菌后，进行纯
4、化培养和致病性测定。3.2 病原物种的鉴定对用作抗病性鉴定接种体的病原物应进行种的鉴定，依据形态学、培养特征和分子特征(参见附录A)确定病原物的种级分类地位。3.3 接种体繁殖接种体繁殖方法为:将在马铃薯葡萄糖琼脂CPotatodextrose agar,PDA)培养基平板上培养的病原菌菌落划碎为小块，接种于加有10个15个直径5mm玻璃珠的马铃薯煎糖液体CPotatosucrose,PS)培养基000mL)的三角瓶(容量250mL)中，250C、180rpm/min条件下培养15d后，取0.2mL菌丝悬浮液涂布于玉米叶粉碳酸钙琼脂CMaizeleaf powder plus CaC03 ag
5、ar,MLPCA)培养基平板上(参见附录A)，250C黑暗培养5d7 d，菌落上产生大量分生抱子，即可用于接种。4 抗病性鉴定圃4.1 鉴定圃设置鉴定圃具备良好的自然发病环境，能够进行田间灌溉和排涝，或具备叶面喷雾设施。4.2 鉴定设计鉴定材料随机排列或顺序排列。鉴定选育品种时，每份材料种植2行，每15份品种设1组己知高抗、高感对照材料(见附录B);鉴定种质资源时，每份材料种植1行，每50份种质设1组已知高抗、高感对照材料。鉴定小区两端应种植不少于2行的保护行。4.3 种植要求l NY/T 1248.11-2016 鉴定材料播种时间与大田生产相同。鉴定小区行长5m，行距与植株密度根据各区域品种
6、试验要求确定，条播或大播。对选育品种进行抗性鉴定时，双行留苗二三50株;对种质资源等材料进行抗性鉴定时，单行留苗二三25株。土壤肥力水平和耕作管理与大田生产相同。5 接种5.1 接种时期接种时期为玉米喇叭口期(11叶期)至抽雄初期，接种选择在傍晚或阴天时进行.同批次鉴定材料应在同一天完成。5.2 接种方法在田间湿度高的山区采MLPCA培养基平板上培子液混合，制备浓度为种叶片，接种量为10浮液在玉米大喇叭5.3 接种时的田接种前应雾，提供病害发内完成。6 病情调查6.1 调查时在玉6.2 调查方调查者目划分标准，对6.3 病情分级田间7 抗性评价7.1 鉴定有效性判别4个尾抱菌菌株分别在将不同菌
7、株的分生抱20(V/V)。喷雾接法接种，将接种悬病情级别当设置的高感对照材料发病程度达到感病(7级)及以上时，该批次鉴定视为有效。7.2 抗性评价标准依据鉴定材料群体发病程度(病情级别)确定其抗性水平，评价标准见表2。2 NY/T 1248.11-2016 表2玉米对灰斑病抗性的评价标准病情级别抗性1 高度抗病Highlyresistant(高抗HR)3 抗病Resistant(抗R)3 中度抗病Modcratelyresistant(巾抗MR)7 感病Susccptiblc(感S)9 高度感病Highlysusceptiblc(高感HS)7.3 重复鉴定若鉴定材料初次鉴定时二年进行重复鉴定。
8、7.4 抗性评价对初次鉴定结果材料进行抗3 NY/T 1248.11-2016 A.1 学名和形态描述引起玉米灰斑病的有多种尾抱菌。附录A(资料性附录)玉米灰斑病病原茵无性态学名:玉蜀泰尾抱Cercosorazeae-maydis Tehon et E.Y.Daniels。无性态学名:玉米尾抱Cercosporazeina Crous et U.Braun。玉蜀泰尾子包:分生于包子梗褐色至橄榄褐色，通常3根14根自玉米叶片表皮气孔长出，直立，呈屈膝状，不分枝，大小为(40180)mX(48)m分生抱子元色，倒棍棒形、近圆柱形，顶端钝圆，基部偶平截，隔膜1个10个，(30100)m X(4的m，
9、脐部略加厚，色暗，宽2m3m。在PDA培养基培养中菌落呈灰黑色，生长慢，250C下日生长直径O.5 mmO.8 mm，多产生略带红色的尾抱菌素。玉米尾抱:分生于包子梗浅橄榄色至中褐色，3根20根松散或成柬从叶片表面的气孔长出，直立，近柱形至屈膝状，不分枝或上部分枝，大小为(40100)mX(57)m，隔膜1个5个;分子抱子无色，3隔膜5隔膜，少数10隔膜，宽纺锤形，(6075)mX(78)m，少数达100m，顶端微饨，基部近平截，脐部略加厚，色暗，宽2m3m。在培养基上生长较慢，250C下日生长直径约0.4mm，不产生红色的尾抱菌素。尾抱菌形态分类学论著见参考文献。A.2 尾抱菌的培养和保存马
10、铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g20 g，水1000mL。马铃薯震糖琼脂(Potatosucrose agar,PSA)培养基:马铃薯200g，震糖20 g，琼脂18g20 g,7j(1 000 mL。此两种培养基用于尾抱菌的培养和保存，培养温度为250C280C;保存采用斜面试管，保存温度为40C，保存期限为一年以上。尾抱菌产抱培养基为玉米叶粉碳酸钙琼脂(MLPCA)培养基:叶粉(玉米中上部绿叶，干燥后粉碎并经150目筛过筛，保存)15g,CaC032 g，琼脂15g，蒸馆水1000mL。A.3 灰斑病病原菌种的分子鉴定采用H3组蛋白基因进行玉米灰斑病
11、致病尾抱种的特异性鉴定。玉蜀泰尾子包鉴定的上游特异引物为CzeaeHIST5-TCG ACT CGT CTT TCA CTT G-3，下游特异引物为CYIH3R5-AGC TGG ATG TCC TTG GAC TG-3;玉米尾拖上游特异引物为CzeinaHIST5-TCG AGT GGC CCT CAC CGT-3，下游特异引物为CYIH3R5-AGC TGG ATG TCC TTG GAC TG-3 0 PCR反应体系25.0 L:DNA模板2.0 L.上下游引物各1.0L，dNTP 0.5L，Taq酶O.5L，buffer 2.0 L，加ddH20定容至25.0L。反应程序如下:940C
12、 5 min预变性，940C 45 s,550C 30 s,720C 60 s，35个循环，720C 10 min。取4.0L PCR产物在2.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。2个种的特异性扩增片段大小均为284忡。对扩增片段进行测序和比对，确定种的分类地位。4 NY/T 1248.11-2016 附录B(规范性附录)鉴定结果汇总和对照用自交系B.1 鉴定结果汇总表格玉米抗灰斑病鉴定结果整理后填人鉴定结果表格，见表B.L表B.l一一一年玉米抗灰斑病鉴定结果表编号品种/种质名称来源病情级别注1.鉴定地点一一注2.接种病原菌分离物编号一一一。注3:接种日期。调杏日期。鉴定技术负责人(签字):B.2
13、 抗病对照自交系齐319，对灰斑病表现稳定的抗病CResistant，R)，选自美国玉米杂交种P785990 B.3 感病对照自交系抗性评价掖478，对弯抱叶斑病表现稳定的高度感病CHighlysusceptible,HS)，选自白交系U8112和沈5003的组配后代。3 NY/T 1248.11-2016 参考文献lJEllis M.R.1971.Dcmatiaccous HyphomycetesR.Kew,England:Commonwealth Mycological Institute 2JCrous P.W.,Braun U.2003.Mycoshaerella and its an
14、amorphs.1.Namcs published in Cercosora and Passatora R.CBS Biodivcrsity Series 1 3JCrous P.W.,Groenewald.Z.,Groencwald M.,et al.2006.Spccics of Cercosora associated with grey lcaf spot of maizeJ.Studics in MycologyC5曰:189-1974J徐秀德.董怀玉.姜练.等，2003.玉米灰斑病抗性鉴定技术.植物保护学报，30(2):129-132 5JJ uliatti F.C.,Pcdro
15、sa M.G.,Silva H.D.et al,2009.Genctic mapping for resistance to gray leaf spot in maize J.Eup叭阳，169(2):227-238 6JBerger D.K.Carstens 悦KorsmanJ.N.,et al.2014.Mapping QTL conferring resistancc in maize to gray lcaf spot discase caused by Cercosora zeina J.BMC Genctics.曰:60.doi:10.1186/1471-2156-15-60 6