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1、ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1248.8一2016玉米抗病虫性鉴定技术规范第8部分:镰抱穗腐病Technical specification on evaluation of maize resistance to pests-Part 8:Fusarium and gibberella ear rot 2016-10-26发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1248.8-2016.刚昌学寸坠14万仲1林农省北所河究帆附梅州阳刚肌士且旷拗术件技业分业农部农省个同林LU全吉荆州所所晋轧究究出bw栩叫他明阳科范现现L科保洁利肋
2、胆湖山时石技分制并翩翩贤辑部时赳学学附80甘京叶T牛吁伊性批批庇病;第m局MM阵啦病病腐腐腐哺际栅际附土问问农农晓抗病病穗叶膜茎茎穗病抱斑黑缩M1子同情长斑斑黑花米霉抱抱枯叫大小丝矮玉腐镰镰纹奇戒陆相U归附Mm即队什此处处热热热热热处处分分分分盯muMU剧所缸M部部部部部部部部部哺呻硝呻N照农草究要11234567891111为按由起研主T第第第第第第第第第第第第第分分分分护分盯一一一一一一一一一一一一一部部部部保部N一一一一一一一一二一-一本本本本物本中且i,E 院I 1 范围本部分规定了玉本部分适用于栽培缘种对镰抱穗腐病抗性2 术语和定义2.1 2.3 辈子采用粗3.1 病原菌分离以常规组
3、织分离菌(Fusariumspp.)3.2 致病种鉴定玉米抗病虫性鉴定技术规范第8部分:镰抱穗腐病由于多种镰抱菌可以引起玉NY/T 1248.8-2016 品种以及野生玉米和玉米近菌所引起的粒腐烂或全态学鉴定确认为镰抱鉴定采用形态学方法并结合分子鉴定技行特异性检测;若病原菌为禾谷镰抱复合种，还应对病原菌的翻译延伸因子(translationelongation factor 1 alpha,TEF-1 a)等基因进行序列测定，通过基因序列比对，确定病原菌的种(参见附录A)。通过玉米幼苗根系接种，明确病原菌的致病性。3.3 病原菌繁殖在接种前需要进行病原菌的繁殖。3.3.1 拟轮枝镰抱分生于包子
4、的产生将病原菌接人液体培养基中，在250C、自然光下静置培养10d15 d。以双层纱布过滤培养物并获得分生抱子悬浮液，用无菌水将分生于包子悬浮液浓度调至2X106抱子/mL，即可用于接种。1 NY/T 1248.8-2016 3.3.2 禾谷镰抱分生于包子的产生将病原菌接入分生抱子诱导培养基中，在250C、自然光条件下振荡(120rpm)培养7d。以双层纱布过滤培养物并获得分生于包子悬浮液，用无菌水将分生于包子悬浮液浓度调至2X 106抱子/mL，即可用于接种。分生抱子悬浮液可在20C40C下保存3周4周。3.3.3 拟轮枝镰抱/禾谷镰于包带菌牙签的培养在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基或倒有培养基
5、的100mL容量烧杯中接种拟轮枝镰抱或禾谷镰抱。培养7d后，将元菌牙签捅人长满镰抱菌的培养基中，250C下黑暗培养7d10d，待菌丝生长至牙签1/3处后即可用于接种。4 抗病性鉴定圃4.1 鉴定圃设置鉴定圃应具备良好的自然发病环境，能够进行自主灌溉。4.2 鉴定设计鉴定材料随机排列或顺序排列。在进行选育品种抗病性鉴定时，每30行鉴定材料设1组已知抗病和感病对照材料(参见附录B)。在进行种质资源抗病性鉴定时，每50行鉴定材料设l组已知抗病和感病对照材料。4.3 种植要求鉴定材料播种时间与生产播种时间相同。鉴定小区行长5.00m，行距0.60m或0.65m，条播或穴播，确保每行留苗25株30株，低
6、于25株时视为该品种/材料鉴定无效。鉴定种质资源时，每份鉴定材料种植l行;鉴定选育品种时，每份材料种植2行。土壤肥力水平和耕作管理与大田生产相同。5 接种5.1 接种时期接种时期为玉米雌穗吐丝后4d7 d(Rl)，接种可全天进行。5.2 接种方法5.2.1 花丝通道接种接种采用注射法，器具为可进行连续定量注射的连动注射器。将注射器吸液管置于病原菌的分生于包子悬浮液中，金属的注射针管从雌穗顶端上方的花丝通道部位侧边插入至花丝通道中间，定量注人2mL接种液。注人的菌液沿花丝向雌穗的籽粒方面流淌，分生于包子萌发，菌丝生长，完成对籽粒的侵染。每株仅接种第一个雌穗。5.2.2 籽粒伤口接种5.2.2.1
7、 针刺接种方法一为用空心金属钊连接有注射接种液的器具在雌穗中上部苞叶外进行穿刺，当金属针刺人籽粒时，同时进行注射接种。方法二为用端部钉有2个5个金属钉的木棒穿刺雌穗中上部苞叶，深度约5mm，直至籽粒中部;穿刺前，金属钉先在镰子包菌分生抱子悬浮液中浸蘸，以使病原菌附着在钉子上，穿刺时即完成对籽粒的接种。5.2.2.2 牙签接种将经过培养后带有大量病原菌菌丝的牙签直接在雌穗中上部苞叶外刺人井达到籽粒中部。为确保菌丝被带人籽粒，接种采用双牙签法，也可用尖的金属器具先在雌穗上钻孔，然后捕人带菌牙签。5.3 接种前后的田间管理接种鉴定田不应特殊管理。玉米接种后适度保持田间大气湿度即可满足发病要求。2 N
8、Yj T 1248.8-2016 6 病情调查6.1 调查时间在玉米生理成熟后(R6)进行调查。6.2 调查方法采收接种的雌穗，去除苞叶后逐穗调查并对雌穗籽粒被病菌雯染的面积进行分级记载。6.3 病情分级依据表1中的描述，逐个记载调查雌穗的发病级别。图l为雌穗发病面积的模拟图。表1玉米对穗腐病抗性鉴定的病情级别划分病情分级描述发病丽和、占雌穗总面积0%-1%3 发病面积占雌穗总面积2%-10%5 发病面积占雌穗、总面积11%-25%7 发病面积占l挂在穗总面积26%-50%9 发病面积占雌穗总面积51%-100%0%1%lOO!o 25%J 50%100%注:左为经花丝通道接种后的发病模拟.右
9、为苞叶穿刺接种后的发病模拟。图1玉米雌穗发病面积模拟图(仿Reidet al.1996)7 抗性评价7.1 鉴定有效性判别当设置的感病对照材料平均病情级别注5.6时，该批次鉴定视为有效。7.2 抗性评价标准计算每份鉴定材料雌穗的平均病情级别，并依据平均级别确定该鉴定材料对穗腐病的抗性，抗性的划分标准见表203 NY/T 1248,8-2016 表2玉米对镰子包穗腐病抗性评价标准平均病情级别抗性=二1.5高度抗病Highlyresistant(高抗HR)1.63，5 抗病Resistant(抗R)3,65，5 中度抗病Moderatelyresistant(巾抗MR)5,67，5 感病Susce
10、ptibleC感S)7,69，0 高度感病Highlysusceptible(高感HS)7,3 重复鉴定若鉴定材料初次鉴定时表现为7,4 抗性评价对初次鉴定结果和重鉴定材料进行抗性评价。编号4 A.1.1 拟轮枝镰抱(无无性态学名:F异名:约140m250m;(34)m。A.1.3 燕麦镰抱(无性态)无性态学名:Fusarium avenac 附录A(资料性附录)玉米镰抱穗腐病病原菌有性态学名:Gibberella avenacea Cook NY/T 1248.8-2016 3)m;大型分有性态特征:较子囊抱子大小隔的分生抱子大小为:子囊壳卵圆状，直径燕麦镰于包无性态特征:大型分生于包子镰刀
11、状，有隔膜1个3个，大小变化较大，(850)m X(3.54.5)m;无小型分生于包子和厚垣抱子。有性态特征:子囊壳球形或梨形;子囊棒状，(70100)mX(9 12)m，内含8个子囊子包子;子囊子包子无色，近镰刀状，中间具1隔，(l3 19)mX(45)m。A.1.4 亚蒙古团镰抱(无性态)/亚薪团赤霉菌(有性态)元性态学名:Fusarium subglutinans(Wollenweber&.Reinking)Nelson,Toussoun and Marasas 异名:Fusarium moniliforme var.subglutinans Wollenweber&.Reinking
12、Fusarium s阳charivar.subglutinans(Wollenw巳ber&.Reinking)Nirenberg 3 NY/T 1248.8-2016 有性态学名:Gibbel-ella subglutinans(Edwards)Nelson,Toussoun&.Marasas 异名:Gibberella fujikuroi(Sawada)Wollenw.var.subglutinans Edwards 亚站团镰子包无性态特征:小型分生于包子较小，长卵形或拟纺锤形，多元隔或1隔2隔，(6.4 12.7)mX(2.54.8)m，聚集成假头状勃抱子团;大型分生抱子镰刀形，较直，顶胞
13、渐尖、足胞较明显，2个6个分隔，以3隔者居多2隔者大小(14.025.5)mX(2.8 5.0)m;3隔者大小(24.244.6)mX(3.55.0)m;4隔者大小(42.1 51.0)mX(4.85.4)m;5隔者大小(43.356.1)mX(4.85.9)m。有性态特征:子囊壳球状;子囊长棒状，内含8个子囊抱子;子囊于包子大小(l215)mX(4.55)m。A.1.5 黄色镰抱(无性态)无性态学名:F usarium culmorum(W.G.Smi th)Sacc.异名:Fusisporium culmorum W.G.Smith.黄色镰于包无性态特征:大型分生抱子镰刀形，端部较尖、足胞
14、明显，3个5个分隔，3隔的大小为(2636)mX(46)m;5隔的大小为(3450)mX(57)m。A.1.6 层出镰抱(无性态)/中间赤霉菌(有性态)无性态学名:Fusriumproliferatum(Matsushima)Nirenberg 异名:Cehalos户orzumroliferatumMatsushima 有性态学名:Gibberellaintermedia(Kuhlman)Samuels,Nirenberg&.Seifert 异名:Gibberellafujikuroi var.Intermedia Kuhlman 层出镰抱无性态特征:大型分生抱子较少形成，镰刀状，较直，3个5
15、个分隔。小型分生抱子短棍棒形，通常1个2个细胞，元厚垣抱子。A.1.7 尖镰抱(无性态)无性态学名:Fusarium oxysporum Schlechtendahl Emend.Snyder&.Hansen 尖镰于包无性态特征:大型分生抱子镰刀形，3个7个分隔，3隔的大小为(27 46)m X(35)m;5隔的大小为(3560)mX(35)m;6隔7隔的大小为(5066)mX(3.55)m;小型分生于包子卵圆形，大小为(512)mX(2.23.5)m。A.2 镰于包菌培养与保存A.2.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar medium,PDA)马铃薯200g，
16、葡萄糖20g，琼脂18g20 g，蒸馆水1000mL。分装在三角瓶中后1210C高压灭菌20 min后备用。PDA培养基用于镰抱菌生长培养及菌种保存，培养温度为250C，保存温度为40C。A.2.2 马铃薯葡萄糖液体培养基(Potatodextrose medium,PD)马铃薯200g，葡萄糖20 g，蒸馆水1000mL。分装在三角瓶中(500mL三角瓶中分装150mL),1210C高压灭菌20min后备用。PD培养基用于镰抱菌的菌丝培养(用于病菌DNA提取)和产抱培养。A.2.3 禾谷镰抱大分生于包子诱导培养基磷酸二氢梆(KH2P04)2.0 g，硝酸梆(KN03)2.0g，氯化饵(KCl
17、)1.0 g，硫酸镇(MgS04)1.0 g，硫酸亚铁(FeSO，)0.002 g，三氯化铁(FeC13)0.002 g，硫酸锤(MnS04)0.002 g，硫酸铸(ZnSO，)0.002 g.葡萄糖1.0 g，蒸馆水1000mLo分装在三角瓶中(500mL三角瓶中分装150mL),121 oC高压灭菌20min 后备用。A.2.4 无菌牙签制备市售木质牙签以清水浸泡2h，期间换水数次，最后煮沸以彻底去除牙签中的消毒药剂成分:牙签晾干并包成100根/包200根/包，在1210C下高压灭菌30min后即可按照3.3.3的要求进行带菌培养。NY/T 1248.8-2016 A.3 镰抱菌不同种和复
18、合种的分子检测对形态学鉴定初步确认为镰抱菌的分离物进行镰抱种的分子检测。镰子包属和主要镰抱菌种分子检测的特异性引物及禾谷镰抱复合种中各独立种鉴定的转录延伸因子C translation elongation actor 1 alpha)，基因扩增引物见表A.10 TEF-la基因片段扩增的50.0L反应体系:1U的Taq聚合酶O.5L.10 X PCR buffer 5.0 L，dNTPC2.5 mM)4.0 L，引物(10mol/L)各1.0L，DNA模板2.5L，加ddH20补足至50.0L。PCR扩增条件:940(预变性4min，940(变性40s,530(退火40s.720(延伸1mi
19、n,35个循环，720(延伸10 min，40(保存。表A.l镰于包属和种的特异性引物镰抱菌种/鉴定基因引物引物序列(5-3)扩增片段bp 镰抱菌属Fusariumspp.1tsF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA 431 58 ltsR I寸AACGGCGTGGCCGC禾谷镰抱复合种F.graminearum Clade Fg16NF ACAGATGACAAGA1寸CAGGCACA280 57 Fg16NR 丁寸CTTTGACATCTGTTCAACCCA黄色镰于包F.culmorum Fc01F ATGGTGAACTCGTCCTGGC 570 59 Fc01R CCC1寸CT
20、TACGCCAATCTCG拟轮枝镰于包F.verticillioides VERl CTTCCTGCGATGI寸CTCC578 56 VER2 AATTGGCCATTGGTATTATATATCTA 层出镰于包F.roliferatum PR01 cITCCGCCAAG丁寸TC1寸C585 56 PR02 TGTCAGTAACTCGACG1寸GTTGil勃团镰于包F.subglutina阳SUBl CTGTCGCTAACCTCT寸TATCCA631 56 SUB2 CAGTATGGACGTTGGTA1寸ATATCTAA尖镰抱F.oxysorum FoF1 ACATACCACrGrGCCTCG 3
21、40 58 FoR1 CGCCAA TCAA TITGAGGAACG TEF-1 TEF-F 5-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3 703 53 TEF-R 5-GGARGTACCAGTSATCATG丁寸3 7 NY/T 1248.8-2016 B.1 抗病鉴定对照材料X178，对镰抱穗腐病表B.2 感病对照自交系8 附录B(资料性附录)玉米镰于包穗腐病抗性鉴定对照材料NY/T 1248.8-2016 参考文献lJ吕国忠，赵志慧，孙晓东，等，2010.串珠镰于包菌种名 的废弃及其与藤仓赤霉复合种的关系J.菌物学报，29(1):143-151 2JReid L.M.Mather O.
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