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1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中林可霉素检验 液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for lincomycin in biological samplesLC-MS -发布-实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（S
2、AC/TC179/SC1）提出并归口。本标准由起草单位：公安部物证鉴定中心、深圳市公安局。本标准主要起草人：张云峰、王芳琳、黄健、王炯、常靖、王瑞花、董颖、张蕾萍、侯小平、栾玉 静、杜鸿雁、崔冠峰、于忠山、何毅、李树辉。GA/T 1 法庭科学 生物检材中林可霉素检验 液相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等）中林可霉素的液相色谱-质谱（LC-MS）定性定量检验方法。本标准适用于法庭科学生物检材中林可霉素的定性分析和定量分析。其他可疑样品中林可霉素的定性分析和定量分析可参照使用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引
3、用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相色谱-质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子和离子丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。在分析中使用的试剂均为色谱纯，试剂包括：a)甲醇；b
4、)乙腈；c)甲酸；d)二氯甲烷；e)标准溶液：1)1.0mg/mL 标准物质溶液：根据林可霉素标准物质的纯度，称取适量，用甲醇配制 1.0mg/mL林可霉素标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液；2)10.0g/mL 标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 的林可霉素标准物质溶液 0.1mL，用甲醇稀释至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的标准工作溶液均由 10.0g/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。GA/T 2 5.2 材料 材料包括：a)具盖离心管；b)具塞玻璃试管；c)
5、有机系微孔滤膜：0.22m；d)固相萃取柱：Oasis HLB 固相萃取柱或其他等效固相萃取柱，使用前依次用甲醇、水活化；注：Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。e)一次性注射器。6 仪器和设备 仪器和设备包括：a）液相色谱-质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆质量分析器；b）电子天平；c）离心机；d）振荡器；e）移液器。7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体检材样品0.5mL，或称取铰碎
6、的肝脏等固体检材样品0.5g于具盖离心管中，加入二氯甲烷3mL，振荡5min，8000r/min离心10min，分离有机相，置于浓缩器上50浓缩至干，残留物用1mL初始流动相溶解，用0.22m的有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液供仪器分析。7.1.1.2 固相萃取 移取血液等液体检材样品0.5mL，或称取绞碎的肝脏等固体检材样品0.5g于具盖离心管中，加3mL水稀释，振荡10min，8000r/min离心20min，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱中，控制上清液过柱，流速为1mL/min，依次用3mL水、3mL甲醇/水（体积比10:90）淋洗，抽干弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃
7、取柱2min，用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液并置于浓缩器上50浓缩至干，残留物用1mL初始流动相溶解，用0.22m的有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液供仪器分析。7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加林可霉素标准物质，作为添加样品（添加样品的浓度为5.0ng/mL(g)），与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件（液相色谱-质谱）以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：GA/T 3 a）色谱柱：ACQ
8、UITY UPLC HSS T3 C18，(2.1mm 50mm，1.7m)或等效色谱柱；注：ACQUITY UPLC HSS T3 C18是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b）流动相：A：甲醇，B：0.1%甲酸水溶液；c）洗脱方式：梯度洗脱，梯度见表1；d）柱温：35；e）进样量：2L；f）流速：0.6mL/min；表1 梯度洗脱条件 时间 min A B-10%90%1.5 40%60%1.8 90%10%2.2 90%10%2.5 10%90%4.0 10%90%g）
9、离子源：电喷雾电离源（ESI）；h）检测方式：正离子；i）毛细管电压：3.5kV；j）离子源温度：150；k）雾化气流速：800L/h；l）雾化气温度：400；m）扫描方式：多反应离子监测（MRM）；n）MS 参考条件（定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能量条件）见表 2。表2 MS参考条件 名 称 定量离子对 定性离子对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 林可霉素 407.2126.1 407.2126.1 30 30 407.2359.2 20 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移
10、取血液等液体检材样品0.5mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品0.5g两份，按7.1.1进行操作。内标-工作曲线法：另取等量相似基质的空白样品六份，一份作为空白样品，另外五份添加不同浓度的标准物质（添加浓度应呈良好的线性关系，且检材样品中目标物的含量应在线性范围内），作为添加样品，与检材样品平行操作。GA/T 4 内标-单点校正法：另取等量相似基质的空白样品两份，一份作为空白样品，另外一份添加标准物质（检材样品中目标物含量应为添加样品中目标物含量的（100 50）%），作为添加样品，与检材样品平行操作。7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析。7.2.2.
11、2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液或基质标准工作溶液及标准工作溶液，按7.1.2.1的分析条件每个样品进样分析23次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于6次。7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 外标-单点法 记录各样品提取液平行进样 23 次的目标物保留时间和峰面积值，按公式（1）计算含量：添样添样添样VMAVMAW=.(1)式中：W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（g/g）或微克每毫升（g/mL）；A样检材样品提取液中目标物峰面积平均值；M添添加样品中目标物添加量，单位为微克（g）；V样检材样品的定容体积，单位为毫升（mL）；A添添加样
12、品提取液中目标物峰面积平均值；M样检材样品的取样量，单位为克（g）或毫升（mL）；V添添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）。7.2.3.1.2 外标-标准曲线法 记录样品提取液和基质标准工作溶液平行进样23次的目标物保留时间和峰面积值，以林可霉素定量离子对的峰面积（A样）为纵坐标、林可霉素质量浓度（W）为横坐标进行线性回归，得线性方程，按公式（2）计算含量。若检材样品中目标物的含量高于线性范围，应将检材样品提取液用甲醇稀释后进样分析。=样(2)式中：W 检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（g/g）或微克每毫升（g/mL）；A样 检材样品提取液中目标物峰面积平均值；a 线性方程的截距；b
13、线性方程的斜率。7.2.3.2 计算相对相差 记录 2 份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（3）计算相对相差：GA/T 5%10021=XXXRD.(3)式中：RD相对相差，用百分比（%）表示；X1、X2两个样品平行定量测定的含量数值；X两个样品平行定量测定含量的平均值。8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表3规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中
14、检出目标物。林可霉素的相关谱图参见附录A中图A.1、图A.2。表 3 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50%2050 1020 10%最大允许相对偏差 20 25 30%50%8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。方法检出限参见附录 A。8.2 定量结果评价 如果目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。林可霉素中毒诊断参考资料参见附录B。GA/T 6
15、A A 附 录 A（资料性附录）林可霉素的相关色谱图 A.1 林可霉素的MRM总离子流图见图A.1。图A.1 林可霉素的MRM总离子流图 A.2 林可霉素的MRM提取离子流图见图A.2。图A.2 林可霉素的MRM提取离子流图 A.3 LC-MS 分析，林可霉素检出限为 2.0ng/mL(g)。GA/T 7 B B 附 录 B（资料性附录）林可霉素中毒诊断参考资料 B.1 中毒症状 口服使用林可霉素容易出现消化系统症状和体征，如常见恶心、呕吐、腹痛、腹泻等；严重者有腹绞痛、腹部压痛、严重腹泻（水样或脓血样），伴发热、异常口渴和疲乏（假膜性肠炎）。在肌肉注射或静脉注射时，由于剂量使用不当或用药速度快，可导致林可霉素极性中毒反应，用药后立即出现颜面潮红、烦燥，继而双眼凝视、昏厥，脉搏血压测不出、缺氧、心音弱、心率快、全身无力、舌头发麻、手脚发麻、呼吸困难等中毒症状及体征反应。病理检验：脑水肿及肺水肿、心肌炎等病理改变。B.2 中毒死亡机理 林可霉素中毒具有神经肌接头阻断作用，可以引起血压下降、呼吸和心跳停止发生休克样反应，最终引起死亡。B.3 林可霉素的中毒浓度 小鼠静脉注射为214mg/kg，口服为4000mg/kg；大鼠口服为4000mg/kg。_