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1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中丁丙诺啡检验 液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for buprenorphine in biological samplesLC-MS -发布-实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委
2、员会(SAC/TC 179/SC1)提出并归口。本标准起草单位：公安部物证鉴定中心、山西医科大学法医学院。本标准主要起草人：王瑞花、董颖、栾玉静、杜鸿雁、任昕昕、王爱华、宋歌、董林沛、蔚志文。GA/T 1 法庭科学 生物检材中丁丙诺啡检验 液相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等）中丁丙诺啡的液相色谱-质谱（LC-MS）定性定量检验方法。本标准适用于法庭科学生物检材中丁丙诺啡的定性分析和定量分析。其他可疑样品中丁丙诺啡的定性分析和定量分析可参照使用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于
3、本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相色谱-质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和离子丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水，除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括：a)甲醇（色谱纯）；
4、b)乙腈（色谱纯）；c)氨水；d)盐酸；e)5%氨水/乙腈溶液：量取 5mL 氨水，加乙腈稀释至 100 mL；f)0.1mol/L 盐酸：量取 8.4mL 浓盐酸，加水稀释至 1000mL；g)5mmol/L 乙酸铵溶液（pH 值 9.0）：称取乙酸铵 0.38g，加水溶解并稀释至 1000mL，用氨水调至 pH 值为 9.0；GA/T 2 h)5mmol/L 甲酸铵溶液（pH 值 3.5）：称取甲酸铵 0.32g，加水溶解稀释至 1000mL，用甲酸调pH 值为 3.5；i)标准溶液：1）1.0mg/mL 标准物质溶液：根据丁丙诺啡标准物质纯度和盐型换算后，称取适量，用甲醇配制 1.0mg
5、/mL 丁丙诺啡标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液；2）10.0 g/mL 标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质溶液 0.1mL，用甲醇稀释至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。5.2 材料 材料包括：a)固相萃取柱：混合型阳离子交换（MCX）固相萃取柱或等效固相萃取柱，使用前依次用甲醇、水活化；b)一次性注射器；c)具盖离心管；d)有机系微孔滤膜：0.22m。6 仪器和设备 仪器和设备包括：a)液
6、相色谱-质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆或离子阱质量分析器；b)离心机；c)振荡器；d)电子天平；e)移液器。7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 沉淀蛋白 移取血液等液体检材样品0.5mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品0.5g于具盖离心管中。加入乙腈2mL，振荡10min，8000r/min离心20min，取上清液，经有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器分析。7.1.1.2 固相萃取 移取血液等液体检材样品1.0mL2.0mL，或称取绞碎的肝脏等固体检材样品1.0g2.0g于具盖离心管中，用4倍体积0.1mol/L的盐酸稀释，振荡10
7、min，8000r/min离心20min，取上清液转移至已活化好的MCX固相萃取柱中，控制上清液过柱流速为0.5mL/min，依次用0.1mol/L盐酸1mL、甲醇1mL、乙腈1mL淋洗，抽干弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱2min，用1mL 5%的氨水/甲醇溶液洗脱，GA/T 3 收集洗脱液置于浓缩器上45浓缩至干，残留物用甲醇200L溶解，用0.22m的有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器分析。7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加丁丙诺啡标准物质，作为添加样品（添加样品
8、的浓度为20ng/mL），与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 液相色谱-质谱（离子阱质量分析器）条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品实际情况进行调整：a)色谱柱：XTerra RP18色谱柱（2.1mm 150mm，3.5m），或其他等效反相液相色谱柱；注：XTerra RP18是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)柱温：30；c)流动相：80%乙腈:20%5mm
9、oL/L 乙酸铵溶液（氨水调节 pH 至 9.0）；d)流速：0.2mL/min；e)进样体积：10L；f)离子源：电喷雾电离（ESI）；g)扫描方式：正离子检测，采用二级全扫，母离子M+H+=468.3，定量子离子 m/z=414.2；h)源电压：4.5kV；i)加热毛细管温度：280；j)鞘气（氮气）流量：38arb，辅助气（氮气）流量：5arb；k)碰撞能：34。7.1.2.1.2 液相色谱-质谱（三重四级杆质量分析器）条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱，(2.1mm 100 mm,1.7m)或其他
10、等效色谱柱；注：注：ACQUITY UPLC BEH C18是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)流动相：A：乙腈，B：5mmol/L甲酸铵溶液（pH值3.5）；c)梯度洗脱程序：见表1；表1 梯度洗脱条件 时间 min A B-10%90%1.5 90%10%2.2 90%10%2.5 10%90%4.0 10%90%GA/T 4 d)柱温：35；e)流速：0.6mL/min；f)离子源：电喷雾电离（ESI）；g)检测方式：正离子；h)毛细管电压：3.5kV；i)源温度：15
11、0；j)雾化气流速：800L/h；k)锥孔气流速：50L/h；l)扫描模式：多反应离子监测（MRM）；m)MS参考条件（定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能量）见表2。表 2 MS 参考条件 检测目标物 定量离子对 定性离子对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 丁丙诺啡 468.4414.2 468.4396.1 35 35 468.4414.2 40 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品1.0mL2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g2.0g两份，按7
12、.1.1.2进行操作。另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份分别添加丁丙诺啡标准物质作为添加样品（添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的(100 50)%），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析。7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件每个样品进样分析23 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品提取液平行进样 23 次
13、的目标物保留时间和峰面积值，按公式（1）计算含量：GA/T 5 添样添样添样VMAVMAW=.(1)式中：W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（g/g）或微克每毫升（g/mL）；A样检材样品提取液中目标物峰面积平均值；M添添加样品中目标物添加量，单位为微克（g）；V样检材样品的定容体积，单位为毫升（mL）；A添添加样品提取液中目标物峰面积平均值；M样检材样品的取样量，单位为克（g）或毫升（mL）；V添添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）。7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（2）计算相对相差：%10021=XXXRD.(3)式中：RD相对相差，用
14、百分比（%）表示；X1、X2两个检材样品平行定量测定的含量数值；X两个检材样品平行定量测定含量的平均值。8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 3 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。本方法丁丙诺啡的检出限和相关图谱参见附录 A。表 3 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50%2050 1020 10%最大允许相对偏差 20 25
15、 30%50%8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。方法检出限参见附录 A。8.2 定量结果评价 如果目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。丁丙诺啡的理化性质、毒理作用参见附录B。GA/T 6 附 录 A（资料性附录）丁丙诺啡的检出限和相关图谱 丁丙诺啡相关谱图见图A.1图A.3。本方法丁丙诺啡的检出限为10ng/mL（g）。5ugxue02#156 RT:2.5
16、7 AV:1 NL:3.45E6F:+c ESI Full ms2 468.0034.00 125.00-500.00150200250300350400450500m/z0102030405060708090100Relative Abundance414.23396.23468.31426.22326.19368.28450.26243.20267.23312.32223.16338.21199.17175.10152.08486.96 图 A.1 丁丙诺啡的二级质谱图(离子阱质量分析器)RT:0.00-8.54012345678Time(min)010203040506070809010
17、0Relative AbundanceRT:3.31RT:2.20RT:7.43RT:1.16RT:5.36RT:0.12RT:4.76RT:6.13RT:6.70RT:8.27NL:3.74E6TIC F:+c ESI Full ms2 468.0034.00 125.00-500.00 MS ICIS xuetj3 图 A.2 血添加 100ng/mL 丁丙诺啡液相色谱质谱离子流图(离子阱质量分析器)GA/T 7 10ng biaozhun18-Mar-201610:41:51Time0.501.001.502.002.503.003.504.004.50%01000.501.001.50
18、2.002.503.003.504.004.50%01000.501.001.502.002.503.003.504.004.50%010020160318-2MRM of 4 Channels ES+468.399 414.12(ding bing nuo fei)1.02e5Area1.30370920160318-2MRM of 4 Channels ES+468.399 396.17(ding bing nuo fei)1.29e5Area1.30440320160318-2MRM of 4 Channels ES+TIC(ding bing nuo fei)5.00e5Area1.3
19、018222 图 A.3 丁丙诺啡的液相色谱-质谱图(三重四级质量分析器)GA/T 8 附 录 B（资料性附录）丁丙诺啡的理化性质及毒理作用 B.1 理化性质 丁丙诺啡的分子式为 C29H41NO4，分子量为 467.7，化学结构见图 B.1。图 B.1 丁丙诺啡化学结构 本品一般由蒂巴因制得，为白色结晶性粉末，熔点 209，盐酸盐熔点 245。B.2 毒理作用 丁丙诺啡镇痛作用强于哌替啶和吗啡，镇痛活性为吗啡的25倍，与 受体亲合力强，可置换出结合于 受体的其他麻醉性镇痛药，从而产生拮抗作用。该药起效慢，持续时间长。口服后2h血浆浓度达峰值，30min60min出现镇痛作用，针剂可持续6h8h，舌下含片可维持8h12h，对呼吸有抑制作用。该药能减慢心率、使血压轻度下降，但对心排血量无明显影响，药物依赖性近似吗啡。丁丙诺啡血浆蛋白结合率为96%，主要在肝脏代谢，大部分经胆汁和粪便排泄。丁丙诺啡的主要代谢产物是N-去烃基丁丙诺啡。_