《GA∕T 1610-2019 法庭科学 生物检材中红霉素和罗红霉素检验 液相色谱-质谱法(公共安全).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《GA∕T 1610-2019 法庭科学 生物检材中红霉素和罗红霉素检验 液相色谱-质谱法(公共安全).pdf（10页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、 faICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中红霉素和罗红霉素检验 液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for erythromycin and roxithromycin in biological samplesLC-MS -发布-实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准
2、由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（SAC/TC179/SC1）提出并归口。本标准起草单位：公安部物证鉴定中心、深圳市公安局。本标准主要起草人：张云峰、王芳琳、黄健、王炯、常靖、王瑞花、董颖、张蕾萍、侯小平、栾玉静、杜鸿雁、崔冠峰、于忠山、何毅、李树辉。GA/T 1 法庭科学 生物检材中红霉素和罗红霉素检验 液相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等）中红霉素和罗红霉素的液相色谱-质谱（LC-MS）定性定量检验方法。本标准适用于法庭科学生物检材中红霉素和罗红霉素的定性分析和定量分析。其他可疑样品中红霉素和罗红霉素的定性分析和定量分析可
3、参照使用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相色谱-质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/
4、T 6682 中规定的一级水。在分析中使用的试剂均为色谱纯，试剂包括：a)甲醇；b)乙腈；c)甲酸；d)氨水；e)0.1%甲酸的 5mmol/L 甲酸铵水溶液：称取 0.315g 甲酸铵加水溶解，加 1mL 甲酸，用水稀释至1000mL；f)0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 值 8）：称取磷酸氢二钾 5.59g 与磷酸二氢钾 0.41g，用水定容至1000mL；g)标准溶液：1)1.0mg/mL 标准物质溶液：根据红霉素和罗红霉素标准物质的纯度，各称取适量，分别用甲醇配制 1.0mg/mL 红霉素和罗红霉素标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液；GA/T 2
5、 2)10.0g/mL 混合标准工作溶液：分别移取 1.0mg/mL 的红霉素和罗红霉素标准物质溶液各0.1mL，用甲醇稀释至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液均由 10.0g/mL 混合标准工作溶液用甲醇稀释得到。注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。5.2 材料 材料包括：a)具盖离心管；b)有机系微孔滤膜：0.22m；c)固相萃取柱：Oasis HLB 柱或等效固相萃取柱，使用前依次用甲醇、水活化。注：Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认
6、可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。6 仪器和设备 仪器和设备包括：a)液相色谱-质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆质量分析器；b)电子天平；c)离心机；d)振荡器；e)移液器。7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 取血液等液体检材样品0.5mL2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品0.5g2.0g于具盖离心管中，用氨水调pH值至9，加入4mL乙酸乙酯，振荡10min，8000r/min离心10min，分离有机相；重复提取一次，合并两次提取的有机相，置于浓缩器上50浓缩至干，残留物用甲醇200L溶解，用有机系微孔滤
7、膜过滤，作为检材样品提取液供仪器分析。7.1.1.2 固相萃取 取血液等液体检材样品0.5mL2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品0.5g2.0g于具盖离心管中，以4倍体积0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释，振荡10min，8000r/min离心20min，取上清液转移至已活化好的HLB固相萃取柱中，控制流速为2mL/min，依次用3mL水、3mL甲醇/水（体积比1:9）溶液淋洗，弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱2min，用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液并置于浓缩器上于50浓缩至干，用初始流动相1mL溶解，用有机系微孔滤膜过滤，供仪器分析。7.1.1.3 质控样品制备 GA/T 3
8、 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加红霉素或罗红霉素标准物质，作为添加样品（添加样品的浓度为2.0ng/mL），与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件（液相色谱-质谱）以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm 50mm，1.7m)或等效色谱柱；注：ACQUITY UPLC HSS T3是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表
9、示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)流动相：A：甲醇，B：0.1%甲酸的5mmol/L甲酸铵水溶液；c)洗脱：梯度洗脱，梯度见表1；表1 梯度洗脱条件 时间 min A B-10%90%1.5 40%60%1.8 90%10%2.2 90%10%2.5 10%90%4.0 10%90%d)柱温：35；e)进样量：2L；f)流速：0.6mL/min；g)离子源：电喷雾电离（ESI）；h)检测方式：正离子；i)毛细管电压：3.5kV；j)源温度：150；k)雾化气流速：800L/h；l)雾化气温度：450；m)扫描模式：多反应离子监测（MRM）；n)MS 质
10、谱参考条件（定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能量）见表 2。表 2 MS 参考条件 目标物 定量离子对 定性离子对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 红霉素 734.4158.1 734.4158.1 24 30 734.4576.4 18 罗红霉素 837.6158.1 837.6158.1 26 36 837.6679.5 22 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。GA/T 4 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品1.0mL2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g2.0g两份，按7.1
11、.1进行操作。内标-工作曲线法：另取等量相似基质的空白样品六份，一份作为空白样品，另外五份添加不同浓度的标准物质（添加浓度应呈良好的线性关系，且检材样品中目标物的含量应在线性范围内），作为添加样品，与检材样品平行操作。内标-单点校正法：另取等量相似基质的空白样品两份，一份作为空白样品，另外一份添加标准物质（检材样品中目标物含量应为添加样品中目标物含量的（100 50）%），作为添加样品，与检材样品平行操作。7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析。7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液或基质标准工作溶液及标准工作溶液，按 7.1.2.1
12、的分析条件每个样品进样分析 23 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 外标-单点法 记录各样品提取液平行进样 23 次的目标物保留时间和峰面积值，按公式（1）计算含量：添样添样添样VMAVMAW=.(1)式中：W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（g/g）或微克每毫升（g/mL）；A样检材样品提取液中目标物峰面积平均值；M添添加样品中目标物添加量，单位为微克（g）；V样检材样品的定容体积，单位为毫升（mL）；A添添加样品提取液中目标物峰面积平均值；M样检材样品的取样量，单位为克（g）或毫升（mL）；V添
13、添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）。7.2.3.1.2 外标-标准曲线法 记录样品提取液和基质标准工作溶液平行进样23次的目标物保留时间和峰面积值，以红霉素或罗红霉素定量离子对的峰面积（A样）为纵坐标、红霉素或罗红霉素质量浓度（W）为横坐标进行线性回归，得线性方程，按公式（2）计算含量。若检材样品中目标物的含量高于线性范围，应将检材样品提取液用甲醇稀释后进样分析。GA/T 5(2)式中：W 检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（g/g）或微克每毫升（g/mL）；A样 检材样品提取液中目标物峰面积平均值；a 线性方程的截距；b 线性方程的斜率。7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作
14、的检材样品中目标物的含量，按公式（3）计算相对相差：%10021=XXXRD.(3)式中：RD 相对相差，用百分比（%）表示；X1、X2 两个检材样品平行定量测定的含量数值；X两个检材样品平行定量测定含量的平均值。8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表3规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。红霉素和罗红霉素的相关谱图参见附录A。表 3 离子丰度
15、比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50%2050 1020 10%最大允许相对偏差 20 25 30%50%8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。方法检出限参见附录 A。8.2 定量结果评价 如果目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠，应按7.2重新提取检验。红霉素和罗红霉素中毒诊断参考资料参见附录B。GA/T 6 A A 附 录 A（资料性附录）罗红霉素和红霉素的相关谱图 A.1 罗
16、红霉素的MRM总离子流图见图A.1。图A.1 罗红霉素的MRM总离子流图 A.2 罗红霉素的MRM提取离子流图见图A.2。图A.2 罗红霉素的MRM提取离子流图 GA/T 7 A.3 红霉素的MRM总离子流图见图A.3。图A.3 红霉素的MRM总离子流图 A.4 红霉素的MRM提取离子流图见图A.4。图A.4 红霉素的MRM提取离子流图 A.5 LC-MS 分析，红霉素和罗红霉素检出限均为 1.0ng/mL（g）。GA/T 8 B B 附 录 B（资料性附录）红霉素和罗红霉素中毒诊断参考资料 B.1 中毒症状 红霉素主要的不良反应为胃肠道反应，可有恶心、呕吐、腹痛及腹泻，反应与剂量大小有关；红
17、霉素可引起过敏反应，可有荨麻疹及药物热，并可引起肝脏损害，如血清丙氨酸氨基转移酶升高，出现黄疸等；静注或静滴乳糖酸红霉素可引起血栓性静脉炎，静注发生的可能性较多。肌注局部刺激性大，可引起疼痛及硬结，因此不宜肌注；红霉素与氨茶碱类药物一起使用时，容易引起恶心、呕吐、震颤、抽搐，乃至心律失常，救治不及时易导致死亡。口服罗红霉素不良反应相对轻微，主要为恶心、呕吐、胃痛、腹泻等胃肠道症状；静脉滴注罗红霉素引起的不良反应中以皮肤黏膜损害反应发生率最高，该系统的损害较表浅，常以皮疹、斑丘疹伴瘙痒等较明显症状为主，容易被观察到；罗红霉素引起过敏性肝炎或过敏性休克并最终导致死亡。B.2 中毒死亡机理 红霉素和罗红霉素等大环内脂类抗生素以半抗原复合物的形式获得抗原性致敏T细胞，并产生T细胞介导的细胞毒及抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)，且促发巨噬细胞激活因子的生成从而形成以胆淤为主要病理变化的过敏性肝炎，可伴有程度不等的肝细胞坏死，可致急性肝功能衰竭引起死亡。B.3 红霉素和罗红霉素的中毒浓度 红霉素：小鼠口服为2.93 g/kg3.11g/kg，大鼠口服为大于3g/kg。罗红霉素：小鼠腹腔注射为435mg/kg，口服为1397mg/kg。_