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1、HIV实验室检测技术张家口市疾病预防控制中心刘琪琛2010.5.26窗口期的意义 窗口期：窗口期：广义的讲，从病原体侵入机体到用现行广义的讲，从病原体侵入机体到用现行的实验室手段可以证明受到感染的期限称为窗口的实验室手段可以证明受到感染的期限称为窗口期。期。狭义的讲，狭义的讲，HIV感染后至抗体检出前的一感染后至抗体检出前的一段时间称为窗口期。段时间称为窗口期。检测检测HIV感染的实用方法是检感染的实用方法是检测抗测抗-HIV，在免疫功能正常人群，其窗口期为，在免疫功能正常人群，其窗口期为2-12周。周。正确选择检测时机正确选择检测时机通常在危险暴露后通常在危险暴露后3个月检测，个月检测，把握
2、度在把握度在95%以上以上 正确解释检测结果正确解释检测结果-阴性只能说明阴性只能说明3个月以前没个月以前没遭受感染，不可以说遭受感染，不可以说“检测没事儿检测没事儿”“安全用血安全用血”只是相对做到安全，因处于窗口只是相对做到安全，因处于窗口期的供血，检测不到抗期的供血，检测不到抗-HIV。HIV感染急性期（早期）：症状出现在感染后感染急性期（早期）：症状出现在感染后6周以周以内，类似感冒，出现异常淋巴细胞升高内，类似感冒，出现异常淋巴细胞升高潜伏期：感染到潜伏期：感染到AIDS发病前，数月发病前，数月-10年以上。抗年以上。抗-HIV阳性、阳性、P24抗原或病毒分离在早期阳性，以后抗原或病
3、毒分离在早期阳性，以后不定或阴性，核酸检测由阳性到不确定到阳性不定或阴性，核酸检测由阳性到不确定到阳性艾滋病早期：持续发热、持续淋巴结肿大、可以有艾滋病早期：持续发热、持续淋巴结肿大、可以有持续性腹泻；体重减轻，可以发生机会性感染持续性腹泻；体重减轻，可以发生机会性感染艾滋病期：保持和发展艾滋病期：保持和发展AIDS早期症状，出现多种机早期症状，出现多种机会性感染，神经细胞和功能损伤的表现，易发生会性感染，神经细胞和功能损伤的表现，易发生多种肿瘤多种肿瘤 *AIDS的病程通常的病程通常2年年 关于检测抗关于检测抗-HIV的残余危险度的残余危险度 含义：含义：在目前条件下，筛查后仍具感染性的机率
4、在目前条件下，筛查后仍具感染性的机率 称为残余危险度。称为残余危险度。影响因素：影响因素：*窗口期和检测时机的选择问题窗口期和检测时机的选择问题 *实验室质控实验室质控 *个别人免疫功能低下，对个别人免疫功能低下，对HIV无反应无反应 *试剂质量和保存问题试剂质量和保存问题 *是否在有效期内使用是否在有效期内使用 *试验操作错误：标本或结果登记的差错、仪器校准否、试验操作错误：标本或结果登记的差错、仪器校准否、错误的操作错误的操作 前病毒 HIV进入宿主靶细胞后，病毒RNA利用自身的逆转录酶进行逆转录，合成病毒基因组的双链DNA分子。在整合酶的作用下（在细胞核内），双股DNA整合入宿主细胞染色
5、体DNA中，这种整合的病毒双股DNA即称为前病毒。抗抗-HIV初筛试验结果的解释和处理初筛试验结果的解释和处理 抗抗-HIV阳性：极大可能为阳性：极大可能为HIV感染，也可能属于非特异反应感染，也可能属于非特异反应 抗抗-HIV弱阳性：存在真阳性和假阳性两种可能弱阳性：存在真阳性和假阳性两种可能 抗抗-HIV阴性：极大可能无阴性：极大可能无HIV感染，不排除阳性的可能（存在感染因感染，不排除阳性的可能（存在感染因素下检测时机不合适）素下检测时机不合适）通常的抗通常的抗-HIV检测结果的处理检测结果的处理 结果结果 试剂试剂1 试剂试剂2 处理意见处理意见 A 再次采样，做确证实验再次采样，做确
6、证实验 B 或或 再次采样，做确证实验再次采样，做确证实验 C 报告抗报告抗-HIV阴性阴性 D 不必复检不必复检 报告抗报告抗-HIV阴性阴性 疫情报告疫情报告*责任疫情报告人：中华人民共和国传染病防治法及其实施办法规定，执行职务的医疗保健人员、卫生防疫人员是传染病责任疫情报告人。*报告时限和方法：责任疫情报告人发现AIDS患者、疑似AIDS患者或无症状HIV感染者时，城镇于6小时内、农村于12小时内，以最快的通讯方式向当地卫生防疫机构报告，并同时报出传染病报告卡。HIVHIV抵抗力抵抗力HIVHIV一旦离开宿主在外界环境中生存能一旦离开宿主在外界环境中生存能力便很快消失，力便很快消失，HI
7、VHIV对环境中的物理因对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙肝素和化学因素抵抗力均较弱，比乙肝病毒（病毒（HBVHBV）的抵抗力低得多。因此，）的抵抗力低得多。因此，对对HBVHBV有效的消毒和灭活方法均适用于有效的消毒和灭活方法均适用于HIVHIV。HIVHIV抵抗力抵抗力-物理因素 HIVHIV对热很敏感，对低温的耐受性强对热很敏感，对低温的耐受性强于高温。因此，可以用高温灭活于高温。因此，可以用高温灭活HIVHIV，在低温条件下保存，在低温条件下保存HIVHIV。对紫外线不敏感：用紫外线、对紫外线不敏感：用紫外线、射射线不能灭活线不能灭活HIVHIV。HIVHIV抵抗力抵抗力-
8、物理因素 HIVHIV灭活：美国疾病控制中心证明，在干燥灭活：美国疾病控制中心证明，在干燥环境中的环境中的HIV HIV 浓度在几小时之内降低浓度在几小时之内降低909099%99%（即降低（即降低1 12 log 2 log）。在室温（）。在室温（22222727）液体环境下）液体环境下HIVHIV可存活可存活1515天以上；经天以上；经5656处理处理3030分钟，可使分钟，可使HIVHIV在体外对人在体外对人T T淋淋巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清中的中的HIVHIV；血清中；血清中HIVHIV经过经过603603小时或小时或80308030分钟
9、作用后不能检出感染性分钟作用后不能检出感染性HIVHIV。目。目前，世界卫生组织推荐的逆转录病毒灭活前，世界卫生组织推荐的逆转录病毒灭活方法是方法是1002010020分钟。分钟。HIVHIV抵抗力抵抗力化学因素 HIVHIV耐碱不耐酸：在耐碱不耐酸：在pH3.0pH3.0条件下条件下HIVHIV滴滴度在度在1010分分钟钟可下降可下降4 4个个对对数数级级，而，而pHpH值值高达高达9.09.0时时，HIVHIV滴度下降甚微。滴度下降甚微。对含氯消毒剂敏感。对含氯消毒剂敏感。0.50.5次氯酸、次氯酸、2 2戊二醛溶液、戊二醛溶液、3 3碘酒、碘酒、6 6过氧化过氧化氢可在氢可在3 35 5
10、分钟内灭活分钟内灭活HIVHIV。实验常用的消毒办法实验常用的消毒办法 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 (121 20(121 20分钟分钟)干烤干烤 170 2170 2小时小时 煮沸煮沸 2020分钟分钟 消毒剂浸泡消毒剂浸泡3030分钟，常用消毒剂为分钟，常用消毒剂为5 5可用可用氯氯(次氯酸钠、次氯酸钾、氯氨次氯酸钠、次氯酸钾、氯氨T)T)、6 6过过氧化氢、氧化氢、2 2戊二醛等。戊二醛等。70%70%酒精酒精1 1分钟可灭分钟可灭活活HIVHIV。二、实验室检测技术二、实验室检测技术HIV感染实验室诊断感染实验室诊断HIV感染实验室检测方法：、血清学检测、HIV核酸检测、病毒分离、CD4
11、 T 淋巴 细胞计数等目前最常用的方法为HIV特异性抗体的检测。检测标本主要为血液，包括血清、血浆和全血；此外还可用唾液检测HIV（Orasure，如Salivacard），尿液检测HIV抗体。标本的采集、运送和处理标本的采集、运送和处理 标标本本采采集集:用用一一次次性性注注射射器器（或或真真空空采采血血管管）抽抽取取一一定定量量静静脉脉血血，室室温温下下自自然然放放置置1 2h，待待血血液液凝凝固固、血血块块收收缩缩后后再再用用3、000r/min离离心心15min，吸出血清备用。，吸出血清备用。用用加加有有抗抗凝凝剂剂的的真真空空采采血血管管（或或一一次次性性注注射射器器抽抽取取静静脉脉
12、血血，转转移移至至加加有有抗抗凝凝剂剂的的试试管管），反反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。复轻摇，分离血浆和血细胞备用。用用于于核核酸酸定定性性检检测测时时，采采集集的的抗抗凝凝全全血血应应在在4 8h内内分分离离PBMC和和血血浆浆，否否则则应应在在24 48h内分离血浆和血细胞。内分离血浆和血细胞。采集样品注意事项采集样品原则上应按临床采血技术规范操作。采集样品时应注意安全，建议采用真空采血管及蝶形针具，以避免直接接触血液；直接接触HIV感染者/艾滋病（AIDS）病人血液/体液的操作,应戴双层手套。标本运送标本运送：运送血清或血浆标本应运送血清或血浆标本应灭活灭活（56 30min 灭活），
13、用带盖的试管严密封口，），用带盖的试管严密封口，试管上应标明样品的编号或受检者姓试管上应标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。随样品应附有名、种类和采集时间。随样品应附有“送检单送检单”和和“生物样品检测委托书生物样品检测委托书”，送检单与生物样品检测委托书应，送检单与生物样品检测委托书应与标本分开。如果路程较远或气候炎与标本分开。如果路程较远或气候炎热，应在热，应在2-82-8条件下运送。用于抗体条件下运送。用于抗体检测的样品可在短期内（检测的样品可在短期内（4848小时）小时）室温递送。标本应专人用送。室温递送。标本应专人用送。收样单位：详细地址：邮政编码：联系人：联系电话：送样单位
14、：详细地址：邮政编码：联系人：联系电话：用于用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品应淋巴细胞测定的样品应在室温下在室温下18 23运送。运送。应采用应采用WHO提出的三级包装系统提出的三级包装系统 第一层容器第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。送检单，送检单
15、应与样品分开放置。第二层容器第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。将试管装第一层容器，可以装若干个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。第三层容器第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签（数量，收、发消毒。在第三层容器外面要贴标签（数量，收、发件人）件人）一、血清学检测血清学检测即抗体、抗原检测HIV抗体诊断临床上实际应用的是测定特异性HIV抗体，包括初筛和确认两个方面。HIV抗
16、体一般在感染后几周逐渐出现，可延续至终身，是重要诊断依据，但是从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1到3个月，还有一小部分比例的HIV感染者出现迟缓反应，95%以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后6个月以内。抗体检测方法酶联免疫吸附试验（ELISA）明胶颗粒凝集试验（PA）斑点免疫试验胶体金或胶体硒间接免疫荧光（IFAT）HIVHIV抗体检测的要点抗体检测的要点1 筛查试验阳性不能出阳性报告；2 严格遵守实验室标准操作程序（SOP）3 严格按照试剂盒说明书操作；4 注意防止样品间交叉污染。HIV抗体检测发展历史1985年4月首次检测HIV-1抗体的ELISA药盒开始供市，不久又建立
17、起WB（免疫印迹法）等确认试验。其他技术如乳胶和明胶颗粒凝集试剂测定HIV-1抗体的初筛方法也相继研制成功，这样不仅提供了HIV/AIDS的临床诊断依据，而且明显地减少了输血后HIV感染的危险性。一、酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法捕获法竞争法ABS-ELISA法双抗体夹心法双抗原夹心法（HIV抗体筛查常用方法）双抗原夹心法目前我国常用的HIV抗体筛查方法是酶联免疫试验(ELISA)双抗原夹心法（第三代试剂）第四代ELISA试剂（线性免疫酶测定）是最近几年发展起来的HIV抗原抗体联合测定试剂,可同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体.与第三代抗HIV-1/2试剂相比,检出时间提前了49.
18、1d.其优点在于能同时检测抗原抗体,降低血源筛查的残余危险度.第4代试剂从理论上来讲，这种试剂是很完美的，但其敏感度和特异度尚需通过大量的临床评估加以确认。在初筛诊断试剂上还发展了特异的HIV IgA，用作围产期儿童诊断，敏感度达93.1%，特异度在1月龄以上的婴儿可达100%。此外，在对抗HIV IgM的诊断也正在积极研究，并取得了可喜的成绩，无形中可缩短窗口期710天。双抗原夹心ELISA试验原理此类试验比较敏感和特异，可检测血清中的IgA、IgM、IgG抗体。将HIV-1/2混合抗原包被在微孔板底部。“一步法”-实验时加入待检血清和辣根过氧化物酶标记HIV-1/2混合抗原“二步法”-实验
19、时先加入待检血清，温度处理后，再加酶标记HIV-1/2混合抗原温度处理后洗涤。待检血清中如有特异性抗体，即将包被抗原和酶标记的抗原桥联在一起，如无抗体，通过洗板而洗去酶标记的混合抗原。加入的底物同被桥联抗原上的酶发生颜色反应，指示抗体存在，如无抗体参与则无显色。实验中设空白对照、阴性对照和阳性对照。操作方法实验准备:试验开始前将试剂和样品放置在室温(1823),按实验室SOP做好试剂准备。备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后,严格按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测.注意事项ELISA 是目前公认的抗-HIV 较佳的筛选方法，但在实际工作中，ELISA抗-HIV的检测受诸多因素
20、影响。.系统误差包括试剂盒质量问题、移液器标定与否、酶标仪读数的准确性、冰箱、水浴箱温度的波动及环境温度等。.随机误差由于工作人员操作不规范造成，如加样不准甚至漏加或误加等。二、胶体金或胶体硒与斑点EIA相似,也是以硝酸纤维膜为载体.区别在于不用酶标记抗体,而代之以红色的胶体金(或胶体硒)A蛋白,用渗滤法作为洗涤方法.试剂稳定,可室温长期保存.试验时不需任何设备,迅速,简便,特异性较好,敏感性约相当于中度敏感的ELISA,适用于应急检测,门诊急诊个体检测.目前有在国内被SFDA批准注册的国外进口试剂和国内产品.一般可在1030min内判读结果.HIVHIV抗体检测程序流程图抗体检测程序流程图 标本标本 选用初筛试剂 初筛检测初筛检测 阳性反应或可疑阳性反应阳性反应或可疑阳性反应 阴性反应阴性反应 原用试剂和另一设计原理或厂家的初筛 试剂复检复检 报告阴性报告阴性 双阳性或双阳性或 双阴性双阴性 一阴一阳一阴一阳 阴性 确认实验确认实验可疑3个月复检一次,共2次 仍属可疑 阳性阳性报告阳性，随访、咨询服务报告阳性，随访、咨询服务 谢谢 谢！谢！Thank You Very Much