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1、综合实验二：综合实验二：血清成分的生化分析血清成分的生化分析实验五实验五血清胆固醇的定量测定（血清胆固醇的定量测定（4学时）学时）实验六实验六血清蛋白的分离纯化（血清蛋白的分离纯化（12学时）学时）实验七实验七血清中转氨酶活力的测定（血清中转氨酶活力的测定（8学时）学时）实实实实 验验验验 六六六六血清清蛋白与血清清蛋白与血清清蛋白与血清清蛋白与-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白的分离及鉴定的分离及鉴定的分离及鉴定的分离及鉴定生命与环境科学学院生命与环境科学学院生命与环境科学学院生命与环境科学学院 生化组生化组生化组生化组总总体体步步骤骤：盐盐析析透透析析浓浓缩缩电电泳泳（期期间间穿穿插凝胶柱层析）插
2、凝胶柱层析）一、盐析一、盐析50%饱和度，血清球蛋白沉淀饱和度，血清球蛋白沉淀、-（33%饱和度沉淀饱和度沉淀）100%饱和度，血清清蛋白沉淀饱和度，血清清蛋白沉淀（NH4）2SO4：破坏水膜、中和电荷：破坏水膜、中和电荷纯度鉴定：层析（柱）、电泳等纯度鉴定：层析（柱）、电泳等二、透析二、透析目的：去盐（柱层析也可）目的：去盐（柱层析也可）透析袋：装样量：透析袋：装样量：1/22/3三、浓缩三、浓缩目的：去水（目的：去水（蔗糖蔗糖）四、电泳四、电泳目的：鉴定清蛋白和目的：鉴定清蛋白和-球蛋白纯度球蛋白纯度五、层析五、层析练习：分离蓝葡聚糖和重铬酸钾（蓝色练习：分离蓝葡聚糖和重铬酸钾（蓝色+黄色
3、）黄色）实验材料实验材料鸡血清鸡血清：三黄鸡血清：三黄鸡血清或或乌骨鸡血清乌骨鸡血清实验六实验六（一）（一）血清清蛋白与血清清蛋白与-球蛋白的盐析球蛋白的盐析、透析与浓缩、透析与浓缩一、目的一、目的1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和方法、掌握盐析法分离蛋白质的原理和方法2、掌握透析法脱盐及蛋白质浓缩的方法、掌握透析法脱盐及蛋白质浓缩的方法二、试剂及仪器用品二、试剂及仪器用品血清血清PBS（NH4）2SO4溶液溶液蔗糖蔗糖双缩脲试剂双缩脲试剂酪蛋白酪蛋白BaCl2溶液溶液离心机离心机烧杯烧杯移液管移液管透析袋透析袋三、三、原理原理中中性性盐盐类类能能破破坏坏溶溶液液中中蛋蛋白白分分子子表表面面的的
4、双双电电层层和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。沉沉淀淀不不同同蛋蛋白白质质所所需需盐盐类类浓浓度度不不同同。如如，50饱饱和和的的硫硫酸酸铵铵能能使使血血清清中中的的球球蛋蛋白白沉沉淀淀，而而33饱饱和和的的硫硫酸酸铵铵则则使使-球球蛋蛋白白沉沉淀淀。因因此此，可可根根据据所所要要分分离离的的蛋蛋白白质质，选选择择不不同同饱饱和和度度的的硫硫酸酸铵铵溶溶液液进进行行盐析。盐析。透透析析是是利利用用蛋蛋白白质质等等生生物物大大分分子子不不能能通通过过半半透透膜膜的的性性质质的的一一类类纯纯化化方方法法，可可利利用用该该方方法法分分离离大大分分子与
5、小分子的混合物。子与小分子的混合物。由由于于NH4+和和SO42-可可以以通通过过半半透透膜膜，而而血血清清清清蛋蛋白白不不能能，因因此此，可可以以利利用用透透析析的的方方法法使使清清蛋蛋白白溶溶液脱盐。液脱盐。透析装置透析装置利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。将将盛盛有有待待浓浓缩缩的的大大分分子子溶溶液液的的透透析析袋袋放放入入高高浓浓度度的的吸吸水水性性强强的的蔗蔗糖糖固固体体颗颗粒粒中中，袋袋内内溶溶液液中中的的水水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。四、实验步骤四、实验步骤1、盐析、透析与浓缩、盐析、透析与浓缩
6、离心管离心管2mL血清血清2mLPBS2mL（NH4）2SO4摇匀摇匀静置静置303000rps离心离心20上清液（主要上清液（主要含清蛋白）含清蛋白）沉淀（主要含沉淀（主要含-球蛋白）球蛋白）3.132g（NH4）2SO4上清液上清液静置静置30，离心，离心201mL水（或水（或PBS）沉淀沉淀流水透析流水透析1h蔗糖蔗糖浓缩浓缩清蛋白清蛋白1mLPBS沉淀沉淀1mL水（或水（或PBS）流水透析流水透析1h蔗糖蔗糖浓缩浓缩-球蛋白球蛋白滴加滴加0.5mL（NH4）2SO4静置静置30，离心，离心20沉淀（沉淀（-球蛋白）球蛋白）实验六实验六（二）（二）血清清蛋白与血清清蛋白与-球蛋白的鉴定球
7、蛋白的鉴定醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳一、目的一、目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作学习醋酸纤维薄膜电泳的操作了解电泳技术的一般原理。了解电泳技术的一般原理。二、原理二、原理 醋醋醋醋酸酸酸酸纤纤纤纤维维维维薄薄薄薄膜膜膜膜电电泳泳是是用用醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜作作为为支支持持物的电泳方法。物的电泳方法。醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜由由二二乙乙酸酸纤纤维维素素制制成成，它它具具有有均均一一的的泡泡沫沫样样的的结结构构，厚厚度度仅仅120m微微米米，有有强强渗渗透透性性，对对分分子子移移动动无无阻阻力力，作作为为区区带带电电泳泳的的支支持持物物进进行行蛋蛋白白电电泳泳有有简简便便，快快速速，样样品
8、品用用量量少少，应应用用范范围围广广，分分离离清清晰晰，没没有有吸吸附附现现象象等等优优点点。目目前前已已广广泛泛用用于于血血清清蛋蛋白白，脂脂蛋蛋白白，血血红红蛋蛋白白，糖糖蛋蛋白白和和同同工工酶的分离及用在免疫电泳中。酶的分离及用在免疫电泳中。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质是是两两性性电电解解质质，在在pH不不等等于于其其等等电电点点的的溶溶液液中中，可可带带有有电电荷荷，在在电电场场中中会会向向着着与与其其所所带带电电荷相反的电极移动。荷相反的电极移动。血血清清中中含含有有白白蛋蛋白白、-球球蛋蛋白白、-球球蛋蛋白白、-球球蛋蛋白白等等蛋蛋白白质质，各各种种蛋蛋白白质质由由于于氨氨基基酸酸组组
9、分分、立立体体构构象象、相相对对分分子子质质量量、形形状状及及等等电电点点不不同同，在在电电场场中迁移速度就不同，故通过电泳法可将其分离。中迁移速度就不同，故通过电泳法可将其分离。三、实验器材三、实验器材1、醋酸纤维薄膜（、醋酸纤维薄膜（28cm）2、常压电泳仪、电泳槽、常压电泳仪、电泳槽3、点样器（市售或自制）、点样器（市售或自制）4、培养皿（染色及漂洗用）、培养皿（染色及漂洗用）5、粗滤纸、直尺、单面刀片、电吹风、粗滤纸、直尺、单面刀片、电吹风6、玻璃板、玻璃板7、竹镊子、竹镊子8、白磁反应板等、白磁反应板等四、实验试剂四、实验试剂1、巴巴比比妥妥-巴巴比比妥妥钠钠缓缓冲冲液液（pH8.6
10、，离离子子强强度度0.07）：1000mL：巴比妥巴比妥2.76g，巴比妥钠，巴比妥钠15.45g，加水至，加水至1000mL。2、染色液：、染色液：300mL含含氨氨基基黑黑10B0.25g，甲甲醇醇50mL，冰冰醋醋酸酸10mL，水水40mL可重复使用。可重复使用。3、漂洗液：、漂洗液：2000mL含甲醇或乙醇含甲醇或乙醇45mL，冰醋酸，冰醋酸5mL，水，水50mL。4、透明液：、透明液：300mL：含无水乙醇：含无水乙醇7份，冰醋酸份，冰醋酸3份。份。5、血清：、血清：新鲜，无溶血现象新鲜，无溶血现象五、操作五、操作总体步骤：总体步骤：膜处理膜处理30装置装置电泳槽电泳槽电极缓冲液：两
11、槽等高电极缓冲液：两槽等高搭桥搭桥点样点样电泳电泳染色染色漂洗漂洗透明透明需做三条膜：全血清、需做三条膜：全血清、-球蛋白、清蛋白球蛋白、清蛋白1、膜处理、膜处理膜的浸泡膜的浸泡用用无无齿齿镊镊子子取取醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜一一张张（识识别别出出光光泽泽面面与与无无光光泽泽面面，并并在在角角上上做做好好记记号号）放在缓冲液中浸泡放在缓冲液中浸泡20min。2 2、电泳槽的准备、电泳槽的准备、电泳槽的准备、电泳槽的准备根根据据薄薄膜膜宽宽度度剪剪裁裁合合适适的的滤滤纸纸条条。在在两两个个电电极极槽槽中中各各倒倒入入等等体体积积电电极极缓缓冲冲液液，在在电电泳泳槽槽两两个个膜膜支支架架上上各各放
12、放两两层层滤滤纸纸条条，滤滤纸纸的的一一端端与与支支架架前前沿沿对对齐齐，另另一一端端浸浸入入电电极极缓缓冲冲液液内内。当当滤滤纸纸条条全全部部润润湿湿后后，用用玻玻棒棒轻轻轻轻挤挤压压在在膜膜支支架架上上的的滤滤纸纸以以驱驱逐逐气气泡泡，使使该该端端滤滤纸纸紧紧贴贴于于膜膜支支架架上上。滤滤纸纸条条是是两两个个电电极极槽槽联联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。3、点点样样把把膜膜条条从从缓缓冲冲液液中中取取出出，夹夹在在两两层层粗粗滤滤纸纸中中吸吸干干多多余余的的液液体体，然然后后平平铺铺在在玻玻璃璃板板上上（无无光光泽泽面面朝朝上上）。将将点点样样
13、器器先先于于放放置置在在白白磁磁反反应应板板上上的的血血清清中中沾沾一一下下，再再在在膜膜条条一一端端23cm处处轻轻轻轻地地水水平平地地落落下下并并随随即即提提起起，这这样样即即在膜条上点上了细条状的血清样品。在膜条上点上了细条状的血清样品。+-点样说明：点样说明：点样说明：点样说明：点点样样位位点点不不可可直直接接在在薄薄膜膜上上划划线线，以以免免破破坏坏薄薄膜膜。可可制制备备点点点点样样样样模模模模板板板板：取取等等大大小小滤滤纸纸条条，在在距距纸纸边边1.52cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。点点样样后后要要在在薄薄膜膜上上形形成成具具一一
14、定定宽宽度度、粗粗细细均均匀匀的的直直线线。此此步步骤骤是是实实验验关关键键，是是获获得得具具有有清清晰晰区区带带电电泳泳图图谱谱的的重重要要环环节节。点点样样前前应应在在滤滤纸纸上上反反复复练练习习，掌握点样技术后再正式点样。掌握点样技术后再正式点样。4、电泳、电泳将将膜膜条条上上点点样样的的一一端端靠靠近近负负极极（点点样样面面朝朝下下，要要求求膜膜紧紧贴贴滤滤纸纸并并绷绷直直，中中间间不不能能下下垂垂。若若电电泳泳槽槽中中同同时时安安放放几几张张薄薄膜膜，则则薄薄膜膜间间应应相相隔隔几几mm）。盖盖严严电电泳泳室室，平平衡衡10min。通通电电。调调节节电电压压到到160V，电电流流强强
15、度度0.40.6mA/cm（毫毫安安/厘厘米米）膜宽，电泳时间约为膜宽，电泳时间约为4560min。5、染染色色电电泳泳完完毕毕后后，将将膜膜条条取取下下并并放放在在染染色色液液中浸泡中浸泡510min。6、漂漂洗洗将将膜膜条条从从染染色色液液中中取取出出后后移移置置漂漂洗洗液液中中漂漂洗洗数数次次到到无无蛋蛋白白区区底底色色脱脱净净为为止止，可可得得色色带带清清晰的电泳图谱。晰的电泳图谱。7、定定量量、将将膜膜条条用用滤滤纸纸压压平平吸吸干干，按按区区带带分分段段剪剪开开，分分别别浸浸在在4.0mL0.4mol/L氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液中中半半小小时时，并并剪剪取取相相同同大大小小的的无无
16、色色带带膜膜条条作作空空白白对对照照，在在A650nm进进行行比比色色。、将将将将干干干干燥燥燥燥的的的的电电电电泳泳泳泳图图图图谱谱谱谱膜膜膜膜条条条条放放放放在在在在洁洁洁洁净净净净的的的的玻玻玻玻璃璃璃璃板板板板上上上上，将将将将透透透透明明明明液液液液滴滴滴滴入入入入，待待待待膜膜膜膜条条条条完完完完全全全全透透透透明明明明后后后后用用用用吹吹吹吹风风风风机机机机吹吹吹吹干干干干或或或或放放放放入入入入烘烘烘烘箱箱箱箱中中中中烘烘烘烘干干干干，可用光密度计直接测定，可用光密度计直接测定，此图谱可长期保存。此图谱可长期保存。此图谱可长期保存。此图谱可长期保存。实验六实验六（三）（三）凝胶
17、层析（练习实验）凝胶层析（练习实验）一、目的一、目的掌握凝胶过滤层析的技术方法掌握凝胶过滤层析的技术方法二、凝胶柱层析原理二、凝胶柱层析原理1、凝凝胶胶层层析析也也称称凝凝胶胶过过滤滤，是是一一类类利利用用有有一一定定孔孔径径范范围围的的多多孔孔凝凝胶胶的层析技术。的层析技术。2、当当样样品品流流经经这这类类凝凝胶胶的的固固定定相相时时，不不同同分分子子大大小小的的各各组组分分因因进进入入网网孔孔受受阻阻滞滞的的程程度度不不同同而而以以不不同同的的速速度度通通过过层层析析柱柱，从从而而达达到到分分离离的的目的。目的。3、当当样样品品通通过过层层析析柱柱时时，分分子子量量较较大大的的物物质质因因
18、为为不不能能或或较较难难通通过过网网孔孔而而进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒，而而是是沿沿着着凝凝胶胶颗颗粒粒间间的的间间隙隙流流动动，所所以以流流程程较较短短，向向前前移移动动的的速速度度较较快快，即即受受阻阻滞滞的的程程度度较较小小，最最先先流流出出层层析析柱柱；反反之之，分分子子量量较较小小的的物物质质，因因为为颗颗粒粒直直径径小小，可可通通过过网网孔孔而而进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒，所所以以流流程程较较长长，向向前前移移动动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。本本实实验验采采用用SephandexG-25凝凝胶胶柱柱分分离离重重铬铬酸酸钾和蓝葡聚糖
19、混合物。钾和蓝葡聚糖混合物。Sephandex：葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶。G20、G30G200等等，编编号号越越小小，筛筛孔孔越越小小。根根据据需需要要选取适当型号可分离高分子物质或脱盐等。选取适当型号可分离高分子物质或脱盐等。三、试剂及仪器用品三、试剂及仪器用品（1）SephandexG-25（1）铁架台）铁架台（2）生理盐水）生理盐水（2）凝胶柱）凝胶柱（3）重铬酸钾）重铬酸钾（3）玻璃棒）玻璃棒（4）蓝葡聚糖）蓝葡聚糖（4）烧杯）烧杯（5）试管）试管（6）胶头吸管）胶头吸管四、实验步骤四、实验步骤1、凝胶预处理、凝胶预处理称称取取8gG-25放放入入250mL烧烧杯杯中中100mL蒸蒸馏馏
20、水水小小火火煮煮沸沸1h静静止止、冷冷却却倾倾弃弃蒸蒸馏馏水水加加入入10mLPBS轻轻轻轻搅搅拌拌至至凝凝胶胶悬悬起起倾倾入入10cm1.0cm层析柱。层析柱。2 2、装柱、装柱、装柱、装柱将将全全部部凝凝胶胶都都倾倾入入柱柱内内，当当液液面面接接近近凝凝胶胶面面时时，用用螺螺旋旋夹夹将将橡橡胶胶管管夹夹紧紧，然然后后小小心心放放松松螺螺旋旋夹夹，使使液液体体缓缓慢慢流流出出（45d/m），到到液液体体刚刚好好流流入入凝凝胶胶面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。3 3、加样、加样、加样、加样用用胶胶头头吸吸管管将将柱柱中中上上方方清清液液吸吸出出，加加入入
21、重重铬铬酸酸钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口。钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口。4、洗脱、洗脱用用生生理理盐盐水水洗洗脱脱液液进进行行洗洗脱脱。打打开开螺螺旋旋夹夹，使使液体的流速达到液体的流速达到1015d/m。5 5、收集、收集、收集、收集混混合合液液在在凝凝胶胶柱柱中中分分离离，蓝蓝色色的的蓝蓝葡葡聚聚糖糖在在下下方方，黄黄色色的的重重铬铬酸酸钾钾在在上上方方。用用试试管管收收集集流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。实验结果实验结果1.洗脱曲线洗脱曲线例子例子实际洗脱曲线实际洗脱曲线2.实验结论实验结论五五、实实验验结结果果可通过凝胶过滤对
22、样品脱盐可通过凝胶过滤对样品脱盐一、实验原理一、实验原理*盐析分离所得之盐析分离所得之-球蛋白，在进一步纯化之球蛋白，在进一步纯化之前，先要将其中的硫酸铵除去。凝胶过滤法较前，先要将其中的硫酸铵除去。凝胶过滤法较之透析法是一种快速有效的方法。之透析法是一种快速有效的方法。*当蛋白质、硫酸铵混合物流经当蛋白质、硫酸铵混合物流经Sephadex G-25 Sephadex G-25 柱时，硫酸铵渗入柱时，硫酸铵渗入 Sephadex G-25 Sephadex G-25 内部，而蛋内部，而蛋白质被排阻在外，因此，蛋白质随溶剂先流出，白质被排阻在外，因此，蛋白质随溶剂先流出，硫酸铵后流出。故能将二者
23、分开。硫酸铵后流出。故能将二者分开。二、操作方法二、操作方法1 1装柱装柱 *取层析柱取层析柱1 1根（根（1.520cm1.520cm），垂直于固定架上，夹），垂直于固定架上，夹住流出口；住流出口；*加加10ml10ml磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（0.0175 mol/L0.0175 mol/L，pH6.7pH6.7）于）于柱中；柱中；*将溶胀好的将溶胀好的Sephadex GSephadex G2525倾倒去水，加入磷酸盐倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液（缓冲液（0.0175mol/L0.0175mol/L，pH6.7pH6.7）并搅拌成悬浮液；）并搅拌成悬浮液；*慢慢将凝胶装入柱中，打开流出口
24、；慢慢将凝胶装入柱中，打开流出口；*继续加入继续加入SephadexGSephadexG2525使自然沉降至使自然沉降至15cm15cm高，关高，关闭出口。闭出口。2.2.上样上样 *打开出口，使柱中多余的磷酸盐缓冲液流出打开出口，使柱中多余的磷酸盐缓冲液流出至凝胶柱床面（切勿低于柱床面）；至凝胶柱床面（切勿低于柱床面）；*用吸管吸取盐析所得的蛋白质溶液用吸管吸取盐析所得的蛋白质溶液2ml2ml，沿管，沿管壁加入凝胶面上；壁加入凝胶面上；*打开流出口，让样品进入凝胶柱；打开流出口，让样品进入凝胶柱；*再用滴管小心加入磷酸盐缓冲液至离凝胶面再用滴管小心加入磷酸盐缓冲液至离凝胶面2 23cm3cm
25、高；高；*接通装有磷酸缓冲液的洗脱瓶开始洗脱；接通装有磷酸缓冲液的洗脱瓶开始洗脱；*调节流速为调节流速为0.5ml0.5mlminmin，每，每2ml2ml收集收集1 1管，编管，编号，按顺序放在试管架上。号，按顺序放在试管架上。3.3.检测检测（1）在收集的同时，检查蛋白质是否流出：在收集的同时，检查蛋白质是否流出：*于每管中取出于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中滴放在黑色比色板孔中(按编号顺序）；按编号顺序）；*再分别加入再分别加入1滴滴20磺酰水杨酸，如出现白色沉淀即表磺酰水杨酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出凝胶柱；示蛋白质已流出凝胶柱；*如此再检查到蛋白质全流出为止。如此再检查到蛋白质全流出为止。（2）与此同时，检测蛋白收集液中是否有硫酸铵：）与此同时，检测蛋白收集液中是否有硫酸铵：*再从含蛋白质的管中取出再从含蛋白质的管中取出1滴于白色比色板中；滴于白色比色板中；*加入奈氏试剂加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去，白质中的硫酸铵已除去，（3）合并无硫酸铵的蛋白质管，待用。）合并无硫酸铵的蛋白质管，待用。