《生化分析仪的基础与应用.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生化分析仪的基础与应用.ppt（88页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、生化分析仪的基础与生化分析仪的基础与应用应用 n n生化分析离不开生化分析仪。所谓生化分析一般是指以吸光光度分析为基础的（有的包含离子选择电极等测定方法）、具有样品取样及加试剂、混合、保温反应等测定。分析过程监控和数据处理及输出能力的半自动或全自动仪器。它们的分析方法都以仪器和试剂为基础，以方法学为指导标准来规范，以试验参数来联系体现。所以，首先必须了解仪器、试剂和方法学的原理及特点，其次是利用方法学评价对仪器、试剂及参数在实践中作评价，以保证分析的精密度和准确度，提高成本效益。n n实验证明，单色光经过有色溶液时，透过溶液的实验证明，单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关
2、，而且还与溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。其规律厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。其规律可用下式表示为可用下式表示为n n A AKCLKCLn n 式中：式中：A A（E E）吸光度（或叫做光密度，也吸光度（或叫做光密度，也可用可用DD表示）；表示）；n n KK某溶液的消光（吸收）系数；某溶液的消光（吸收）系数；n n CC溶液的浓度；溶液的浓度；n n LL光程，即溶液的厚度。光程，即溶液的厚度。n n 可见、收光谱法的定量基础是朗伯比尔可见、收光谱法的定量基础是朗伯比尔（Lambert-BeerLambert-Beer）定律：）定律
3、：n n A=A=lgIlgI o/I t=-o/I t=-lgTlgT=lg1/T=lg1/T n n即当一束强度为L的平行单色光通过一个含有浓度为C的吸光物质、厚度为L的吸收他时，光的一部分被吸收，光强度从IO减小至It。当吸光系数k一定时，透过光与浓度或厚度呈指数函数关系，但吸光度（absorbance，A）与浓度或厚度呈简单的正比关系。n n 在浓度、厚度、单色光波长、溶剂及其温度等相同条件下，不同吸光物质的吸光度不同，即它们的吸光系数不同。n n是物质的特性常数，它只和该物质分子在基态和激发态之间的跃迁几率有关。它的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度，常用的表示方式是摩
4、尔吸光系数（molar absorptivity）。摩尔吸光系数即1摩尔浓度的溶液在厚度为 1cm时的吸光度。在吸光度与浓度之间的直线关系中，吸光系数是斜率，其值愈大，测定灵敏度愈高。n n应用注意点：n n 1由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数，Beer定律成立的重要前提之一是单色光，即只有一种波长的光。但在实际测定中，入射光常常并非严格的单色光，常有不同波长的辐射同时存在。此种多色辐射是使测定中吸光度的变化偏离Beer定律（常为负偏离）的主要光学影响因素。单色光的纯度可用谱带宽度（bandwidth）衡量。n n单色光源是用分光光度计由单色器或滤光片从连续光谱的多色光中选择的、最大吸收
5、波长max在内的一小段波长范围的复合光。以谱带宽度较小、吸收峰较宽的max作为测定条件。n n 2Beer定律一般适用于稀溶液的测定 有两层含义：被测物的浓度不宜过大，其吸光度应在相对测量误差较小的区域；溶液在反应中存在化学平衡，受浓度、pH、溶剂和温度等因素的影响。n n 3介质不均匀引起偏离 当待测试液是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光因一部分散射损失，使透光率减小，实测吸光度增加。n n 比浊法及免疫浊度反应的特点n n 比浊法与可见、紫外吸收光谱法不同，它们不是测定澄清溶液而是测定悬浮液或胶体溶液中物质的浓度，分析的光学基础是分散颗粒对光的反射、折射、散射和吸收等多种作用。生化分析仪
6、通过免疫比浊法等技术，架起临床生化与现代免疫技术的桥梁，免疫化学法的应用日益广泛。n n 1比浊法的分类及原理在光源的光路方向上测量透射光（实际包括透射光和散射光）强度与入射光强度的比值和被检溶液中颗粒浓度间的关系，称为透射比浊法（turbidimetry）。在光路的一定角度（一般为5o90o）方向上测量散射光强度和被检溶液中颗粒浓度间的关系，称为散射比浊法（nephelometry）。n n 透射比浊法的计算公式是：n n In（IOI）bn n令=23kcn nlgI o/I kbcn n 即当一束强度为I o的平行光通过一个散射颗粒浓度为c混浊介质厚度为b的稀的悬浮液后，人射光被吸收和散
7、射，光强度衰减至I，在浊度系数为时，透过率与颗粒浓度呈线性关系。n n 散射光强度与悬浮液或胶体溶液中的颗粒质点大小、入射光波长大小及二者的比例有关。颗粒直径接近或大于光源波长时，常呈透射光和光路上的向前散射光，其散射光强度与入射光强度的关系遵从Mie散射理论，光散射随波长的变化小。颗粒远小于光源波长（d小于005）时常呈偏离光路方向、900对称分布的散射光，其散射光强度与人射光强度的关系符合Rayleigh散射定律，波长愈短，散射光愈强。n n 一般比浊法的灵敏度不如可见、紫外吸收光谱法，但免一般比浊法的灵敏度不如可见、紫外吸收光谱法，但免疫浊度法的敏感度约为疫浊度法的敏感度约为50ng50
8、ngrnlrnl。聚合剂（如聚乙二醇。聚合剂（如聚乙二醇600060001000010000）可提高免疫复合物的形成速度。胶乳增强）可提高免疫复合物的形成速度。胶乳增强免疫浊度法（免疫浊度法（latex enhanced latex enhanced turhidimetricturhidimetric immunoassay immunoassay）由于采用颗粒较大、折光性强的胶乳，将抗体经吸附或由于采用颗粒较大、折光性强的胶乳，将抗体经吸附或共价交联反应固定于胶乳表面，增加抗原抗体凝聚体积，共价交联反应固定于胶乳表面，增加抗原抗体凝聚体积，减少透过光，使灵敏度提高到近减少透过光，使灵敏度提
9、高到近1ng1ngmlml水平。散射比水平。散射比浊法的灵敏度比透射比浊法高，但干扰因素较多。比浊浊法的灵敏度比透射比浊法高，但干扰因素较多。比浊法的精密度相近，变异系数为法的精密度相近，变异系数为1 15 55 5。目前，由。目前，由于技术发展，两种比浊法的灵敏度和特异性已接近，而于技术发展，两种比浊法的灵敏度和特异性已接近，而全自动生化仪的自动化程度和精密度要胜于专用散射比全自动生化仪的自动化程度和精密度要胜于专用散射比浊仪，故透射免疫比浊法在临床上的应用日益广泛。速浊仪，故透射免疫比浊法在临床上的应用日益广泛。速率法的灵敏度和特异性都优于终点法，但终点法的稳定率法的灵敏度和特异性都优于终
10、点法，但终点法的稳定性较好。性较好。n n2免疫浊度反应的特点n n抗原抗体反应与其他化学反应不同，在免疫浊度反应中，抗原抗体复合物的生成量和生成颗粒的大小，与反应体系中抗原抗体的比例关系极大抗原相对不足时，生成的免疫复合物沉淀量少；抗原抗体比例合适时，复合物生成量达到峰值；抗原过量时，复合物反而再溶解，沉淀量下降。临床上免疫比浊法多用抗体测定抗原，保证抗体足量、n n防止抗原过量是基本的方法学条件。要使在临床常见的高抗原浓度范围内（至少高于正常参考上限 50）抗体也足以与之反应，只有这样，抗原抗体复合物的生成量才随抗原的增加而递增，光散射的强度才与抗原量成比例。抗体不足时，测定结果往往偏低。
11、n n 3应用注意点n n （l）若悬浮颗粒本身具有特征吸收，则吸收作用是主要的，宜选择最大吸收波长作比浊测定；若悬浮颗粒本身无特征吸收而介质对人射光有吸收，则测定必须选择在高透光度的波长区。若悬浮颗粒小（粒径小于35nm），溶液浊度小，透射比大于90%，不宜选用透射比浊法，应选择散射比浊法测定。n n（2）透射比浊时，35100nm大小的微粒在波长290410nrn下有最大吸收峰，免疫复合物的大小大致在此范围。散射比浊时，较大的散射光角度适用于35100nrn大小的微粒，较小的散射光角度适用于100800nrn间的微粒。血浆中的白蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白等微粒直径多在50nrn以下，其散射光
12、是对称的。IgM、乳糜颗粒、免疫反应初期产生的抗原抗体复合物等颗粒的直径在50-400nrn，都属颗粒直径接近或大于光源波长这一类，其散射光是不对称的。n n（3）非特异性光散射的影响：免疫浊度法常受内源性光散射的干扰。血清中的乳糜微粒、VLDL、LDL以及反应体系中的颗粒都会产生杂散光，影响比浊灵敏度。为避免上述影响，样品组分的比例，透射比浊法宜在3以下，散射比浊法应在05以下。所用的试剂要澄清，必要时经022m滤膜过滤。应作试剂空白和样品空白。n n（4）带现象（zone phenomenon）的影响：n n抗原或抗体过剩使免疫复合物部分或全部解离的现象，称为带现象。免疫浊度测定中常表现为
13、抗原过剩时免疫复合物形成的量反而下降，又称钩状效应（hook effect）。克服办法主要是：采用高质量试剂，设置仪器监测，减少血清用量。n n（5）伪浊度的影响：即不是特异性抗原抗体反应产生的免疫复合物形成的浊度。形成原因复杂，主要是抗血清存在的非特异性交叉反应性杂抗体成分，增浊剂浓度过高和反应时间掌握不当，样品本身的浊度处理不当，试剂污染和变质，比色杯不洁，等等。n n（6）校准与计算：应选用适当的校准品及浓度作剂量反应曲线。曲线往往有截距或呈S形，不成直线。自动生化分析仪多推荐5点或6点定标，然后选择适当的数学模型作曲线拟合，如 IngitLog变换或 y dcx bx2 ax3的 3次
14、方程回归曲线。更换试剂批号时也必须重新校准曲线。n n（三）均相酶免疫分析n n酶联免疫分析利用免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性对抗原或抗体进行测定，均相酶免疫分析（homogeneous enzyme immunoassay）是其中的一类。n n在均相酶免疫分析中，最常用的是酶放大免疫分析（enzyme multiplied immunoassay，EMIT）。其原理是：当酶标抗原（半抗原）与相应抗体结合，生成酶标抗原抗体复合物后，对标记酶产生调节作用，使酶的构象改变，酶活性抑制、恢复或增强，酶催化的信号随之发生改变；n n酶标抗原抗体复合物与游离酶标抗原同处一相，不需分离步骤就可
15、测定酶活性，计算出被检抗原（半抗原）的含量。常采用酶标抗原与未知抗原对特异性抗体的竞争反应：抗原与标记酶结合使酶的活性抑制或激活，再与相应抗体结合后其酶活性被激活或抑制，未知抗原和酶标抗原与抗体形成竞争体系。n n 均相酶免疫分析目前主要用于检测小分子半抗原，均相酶免疫分析目前主要用于检测小分子半抗原，如某些激素、药物或代谢产物，也逐渐用于大分如某些激素、药物或代谢产物，也逐渐用于大分子物质，如血清子物质，如血清 IgGIgG测定。测定药物的灵敏度一测定。测定药物的灵敏度一般为般为 0 0 5 5 2g2gmlml。方法简便、快速，准确性。方法简便、快速，准确性和重复性好，但影响酶活性的因素也
16、必然影响酶和重复性好，但影响酶活性的因素也必然影响酶联免疫分析。联免疫分析。n n 克隆酶供体免疫分析（克隆酶供体免疫分析（cloned cloned enzyenzy。donor donor immunoassayimmunoassay，CEDIACEDIA）是有发展前途的均相酶免）是有发展前途的均相酶免疫技术，灵敏度比一般酶免疫法高。其原理为：疫技术，灵敏度比一般酶免疫法高。其原理为：用基因工程技术制备称为酶供体（用基因工程技术制备称为酶供体（EDED）和酶受体）和酶受体（EAEA）的两肽段。）的两肽段。n nED和EA独立存在时无酶活性，但在合适条件下可以自动装配并聚合成具有酶活性的四聚
17、体。ED标记申抗原小分子或抗原大分子后，不影响其与EA的装配，但当相应抗体存在时，抗原抗体结合后形成的空间位阻使酶的装配受阻，使用竞争结合模式即可检测末知的半抗原或抗原。n n(四)酶促反应的特点：n n 由酶催化的反应称为酶促反应。以酶作为试剂来进行分析测定，或通过酶促反应测定待测酶的活性，具有高效、专一、温和、灵敏的特点，广泛用于生化分析。试剂中的酶活性（浓度）在反应过程中始终不变。下面仅对酶活性测定知识作介绍。n n 1酶活性测定 生物体内含有成千种酶，存在于细胞中。当细胞通透性增加或细胞破裂时，会使体液中酶浓度增加，n n因此测定体液中特别是血液中酶浓度的变化有助于临床诊断疾病、判断预
18、后和观察疗效。血液中的酶含量甚微，一般每毫升含量在微微克（Pg）到毫微克（ng）水平，因此要直接测定酶含量是非常困难的。虽然近年免疫学技术发展迅速，可以对某些酶直接进行测定，但目前临床仍以测定酶活性间接推算酶的含量。n n 酶活性的大小，是在一定条件下通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量引起的吸光度变化，即测定酶促反应的速率来获得的。n n一般情况下，产物和底物的浓度变化是一致的，一般情况下，产物和底物的浓度变化是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好。这但测定产物的生成要比测定底物的减少为好。这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的，反是由于反应体系中使用的底物
19、往往是过量的，反应时间通常又很短，尤其在酶活性很低时，底物应时间通常又很短，尤其在酶活性很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易精减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易精确；反之，产物从无到有，只要测定方法灵敏，确；反之，产物从无到有，只要测定方法灵敏，准确度可以很高。所以，酶活性测定大多数采用准确度可以很高。所以，酶活性测定大多数采用测定产物生成速率的方法。测定产物生成速率的方法。n n2 2酶促反应三阶段酶促反应是一个可逆反应，其酶促反应三阶段酶促反应是一个可逆反应，其反应全过程的速率并不都与酶活性成正比。将酶反应全过程的速率并不都与酶活性成正比。将酶促反应过程中测得的产物或
20、底物的变化量对时间促反应过程中测得的产物或底物的变化量对时间作图，得到酶促反应时间进程曲线，作图，得到酶促反应时间进程曲线，nn 图2-1n n图中产物图中产物P P或底物或底物S S的浓度变化曲线的斜率就代表的浓度变化曲线的斜率就代表酶反应速率。酶促反应一般分为三阶段。酶反应速率。酶促反应一般分为三阶段。（1 1）延滞期（延滞期（lag phaselag phase）：底物与酶混合、反应启动后）：底物与酶混合、反应启动后的一段短时间内，产物从零开始逐渐生成，处于的一段短时间内，产物从零开始逐渐生成，处于较低水平，反应速度较低，未达到待测酶最大反较低水平，反应速度较低，未达到待测酶最大反应速度
21、；另外，在酶偶联反应中，指示酶的反应应速度；另外，在酶偶联反应中，指示酶的反应必须有一定量测定酶的产物堆积才能进行；这些必须有一定量测定酶的产物堆积才能进行；这些都使酶反应要稍待一定时期后，吸光度才有明显都使酶反应要稍待一定时期后，吸光度才有明显的线性变化，这一时期称为延滞期。延滞期的长的线性变化，这一时期称为延滞期。延滞期的长短不一，当反应体系中存在抑制剂或有干扰物质短不一，当反应体系中存在抑制剂或有干扰物质参与的副反应时，延滞期可延长；当样品酶活性参与的副反应时，延滞期可延长；当样品酶活性过高或反应体系中存在激动剂时，延滞期可缩短。过高或反应体系中存在激动剂时，延滞期可缩短。n n在开始酶
22、反应（即待测样品与基质混合）之前，在开始酶反应（即待测样品与基质混合）之前，应有一个预孵育期（应有一个预孵育期（prepreIncubation periodIncubation period），让），让所有可能干扰测定的反应充分进行，避免干扰待所有可能干扰测定的反应充分进行，避免干扰待测酶活性。内源性产物被工具酶催化消耗，内源测酶活性。内源性产物被工具酶催化消耗，内源性底物也通过偶联反应充分消耗，然后加入底物性底物也通过偶联反应充分消耗，然后加入底物启动反应。启动反应。n n （2 2）线性期（）线性期（linearlinear。basebase）：在反间应体系中）：在反间应体系中底物大于酶
23、饱和浓度的情况下，产物或底物的变底物大于酶饱和浓度的情况下，产物或底物的变化量随反应时间呈线性增减，即反应速度（单位化量随反应时间呈线性增减，即反应速度（单位时间内产物或底物的变化量）恒定不变，这一时时间内产物或底物的变化量）恒定不变，这一时期称为线性期或恒态期，亦称零级反应期。在此期称为线性期或恒态期，亦称零级反应期。在此期，反应速度不受底物和产物浓度的影响，只与期，反应速度不受底物和产物浓度的影响，只与酶活性浓度呈线性关系。测定酶活性都在零级反酶活性浓度呈线性关系。测定酶活性都在零级反应期进行。应期进行。n n(3）偏离线性期：随着反应时间的延长，反应体系中的底物不断消耗，酶不能被其饱和，
24、以及可逆反应、产物抑制、酶变性失活等原因，致酶促反应速度下降，产物或底物的变化曲线渐趋平坦，这一时期称为偏离线性期，亦称一级反应期。在此期，反应速度不仅与酶活性浓度有关，还受底物浓度影响，与底物浓度成正比，因此不能准确反映酶的真正活性，产物浓度与反应时间不呈线性关系。n n 二、自动生化分析仪的基本结构及工作原理n n (基本结构)n n 1按照反应装置的结构，自动生化分析仪主要分为流动式（flow system）、分立式（discrete system）两大类。n n （l）流动式：指测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应在同一管道流动的过程中完成，这是第一代自动生化分析仪。n n
25、（2）分立式：指各待测样品与试剂混合后的化学反应都是在各自的反应杯中完成的，其中有几类分支。n n l l）典型分立式自动生化分析仪：此型仪器应用最）典型分立式自动生化分析仪：此型仪器应用最广。广。n n 2 2）离心式自动生化分析仪：每个待测样品都是）离心式自动生化分析仪：每个待测样品都是在离心力的作用下，在各自的反应槽内与试剂混在离心力的作用下，在各自的反应槽内与试剂混合，完成化学反应并测定。由于混合、反应和检合，完成化学反应并测定。由于混合、反应和检测几乎同时完成，它的分析效率较高。测几乎同时完成，它的分析效率较高。n n 3 3）袋式自动生化分析仪：是以试剂袋来代替反）袋式自动生化分析
26、仪：是以试剂袋来代替反应杯和比色杯，每个待测样品在各自的试剂袋内应杯和比色杯，每个待测样品在各自的试剂袋内反应并测定。反应并测定。n n 4 4）固相试剂自动生化分析仪：亦称为子化学式）固相试剂自动生化分析仪：亦称为子化学式自动分析仪，是将试剂固相干胶片或滤纸片等载自动分析仪，是将试剂固相干胶片或滤纸片等载体上，每个待测样品搞加在相应试纸条上进行反体上，每个待测样品搞加在相应试纸条上进行反应及测定。操作快捷、便于携带是它的优点。应及测定。操作快捷、便于携带是它的优点。n n生化分析仪的正确应用只是掌握了测定技术原理还不够，还需要对具体仪器的工作流程及测定计算方法有足够了解。n n1一般工作流程
27、工作流程可以通过仪器的测定周期来考察。重点关注比色杯空白读数点（CB）、加样品点（S）、各试剂加液点（R、R2、）、试剂空白读数点（RB）、各测定读数点（P）、各点时间间隔及周期总时间等。每个仪器一般都在反应转盘的固定位置和反应测定周期的固定时间设置样品、试剂和稀释的加液位，以及（始点测定吸光度一始点空白吸光度）。如HITACHI7170在P1至P34周期为10分钟具体工作流程如图2-2所示 n n 图图2-22-2n n 2数据处理计算方法 n n仪器在各个吸光度读数点读取的吸光度数据，并不一定都纳入浓度计算。仪器往往根据仪器定义和操作者设定的要求，对吸光度原始数据作计算处理，转换成所谓的反
28、应数据，再按系数或公式作浓度计算。举例如下：n n （1）HITACHI 7170的终点法：测定点（AX）吸光度计算为（AX AX-l）2，实际吸光度=吸光度数据10000。n n（2 2）OLYMPUS AU600OLYMPUS AU600试剂空白数据：试剂空白数据：POPO点试点试剂空白（剂空白（RBRB）POPO点吸光度一比色杯水空白点吸光度一比色杯水空白（WBWB）；任一测定点试剂空白（）；任一测定点试剂空白（RBXRBX）=该点吸该点吸光度一比色杯水空白（光度一比色杯水空白（WBWB）。）。n n （3 3）Monarch 1000Monarch 1000两点终点法的反应数据两点终点
29、法的反应数据=（终点测定吸光度一终点空白吸光度）（始点（终点测定吸光度一终点空白吸光度）（始点测定吸光度一始点空白吸光度）测定吸光度一始点空白吸光度）n n （4 4）AU600AU600终点法（带试剂空白，终点法（带试剂空白，ENDEND法）的法）的反应数据反应数据=终点吸光度一终点吸光度一POPO点吸光度点吸光度n n（试剂空白，（试剂空白，RBRB）。终点法（不带试剂空白，）。终点法（不带试剂空白，ENDIENDI法）的反应数据法）的反应数据=终点吸光度一比色杯空白终点吸光度一比色杯空白（WBWB）。）。n n（5 5）AU600AU600两点法（自身空白）的反应数据二两点法（自身空白）
30、的反应数据二（加第二试剂后测定点读数（加第二试剂后测定点读数-PO-PO点读数）（加点读数）（加第二试剂前测定点读数第二试剂前测定点读数-Po-Po 点读数）。点读数）。n n 1 1仪器运行前操作程序主要进行仪器的基本仪器运行前操作程序主要进行仪器的基本设置。设置。n n (1)(1)试验项目设置：对试验名称、编码、试验试验项目设置：对试验名称、编码、试验组合（组合（profileprofile）、试验轮次（）、试验轮次（roundround）、必要时包）、必要时包括试验顺序等设置。括试验顺序等设置。n n （2 2）各试验的参数设置：包括试验间比值、结）各试验的参数设置：包括试验间比值、结
31、果核对等参数的设定。果核对等参数的设定。n n （3 3）试剂设置：根据有关试验参数设置各试验）试剂设置：根据有关试验参数设置各试验的试剂位、试剂瓶规格，必要时设定试剂批号、的试剂位、试剂瓶规格，必要时设定试剂批号、失效期等。失效期等。n n（4）校准品设置：对校准品的位置、浓度和数量等进行设置。n n （5）质控设置：根据质控要求设置质控物个数、质控规则、质控项目及相应质控参数等。n n 3测定结果的检查分析n n (1)要了解和熟悉仪器的各种警示符号的含义与作用：在正确设定参数的前提下利用各种警示符号能提高我们发现问题和解决问题的效率。n n（2）要熟悉和灵活运用仪器的相关操作屏（界面）：
32、如用反应过程监测观察反应时间进程曲线；用校准追踪（calibration trace）回顾分析校准曲，利用统计（statistics）了解不同日期段病人测定均值及数据分布；运用分析数据编辑察看和校正测定数据。n n n n（3）校准的检查：要充分利用仪器设置的功能检测校正曲线图形、各校准点吸光度值（不能忽略试剂空白值及空白速率值）计算K值等的波动情况，以及以往的比较。必要时应进一步检查反应时间进程曲线。必须结合质控数据来把握实践条件。n n（4）病人结果的检查：除了目测观察或用血清指数了解标本性状、注意和了解临床及诊断外，学会分析反应时间进程曲线及数据是重要的基本功。四基本测定方法四基本测定方
33、法n n终点法终点法终点法终点法n n一旦样本中加入试剂，反应就发生了：起初是吸一旦样本中加入试剂，反应就发生了：起初是吸光率短暂的变化（通常是在样本孵育阶段）；最光率短暂的变化（通常是在样本孵育阶段）；最后是反应的颜色（和由此得到吸光率）的趋向恒后是反应的颜色（和由此得到吸光率）的趋向恒量，被定义为稳定状态。量，被定义为稳定状态。n n通常，吸光率（通常，吸光率（A A）是从样本孵育的第一点读数。）是从样本孵育的第一点读数。然后该值乘以在定标中得到样本的分析浓度所计然后该值乘以在定标中得到样本的分析浓度所计算的因数。算的因数。n n样本中样本中Conc.=Conc.=因数因数x x（A3 A
34、3 试剂空白）试剂空白）等待时间等待时间 孵育时间孵育时间 读数时间读数时间固定时间法固定时间法n n这种方法的反应中，在孵育和读数两个阶段都有这种方法的反应中，在孵育和读数两个阶段都有增加和减少变化。但是，在这两个阶段线的倾斜增加和减少变化。但是，在这两个阶段线的倾斜度可能不一样。而且，呈现给用户的反应图也非度可能不一样。而且，呈现给用户的反应图也非总是线性，但总是分段地产生线性。这是因为该总是线性，但总是分段地产生线性。这是因为该曲线图是从不总是排列成行的读数点组合中得到曲线图是从不总是排列成行的读数点组合中得到的。复位线是在孵育和读数两个阶段中计算出来的。复位线是在孵育和读数两个阶段中计
35、算出来的。它们给用户提供了反应正确演变的有关信息。的。它们给用户提供了反应正确演变的有关信息。在读数过程中，也计算出吸光率变化率（在读数过程中，也计算出吸光率变化率（A A），），计算样本中的最后分析浓度要求有计算样本中的最后分析浓度要求有A A值。值。n n由于自然的延迟，会产生仪器完全定时且测试项目根据所设置的参数在不同的时期读数。在这种情况下，分析仪执行多个读数，在最后点数之间描绘复位线，移动至精确的读数时间，从而得到正确的吸光率值。n n浓度是用吸光率变化率（读数过程中）乘以定标过程中所计算出来的因数。n n样本中Conc.=因数x（A3 A2）（A3 A2）=A等待时间 孵育时间 读
36、数时间 等待时间 孵育时间 读数时间 动力学法动力学法n n这种方法的反应与前一种非常相似，所不同的是这种方法的反应与前一种非常相似，所不同的是该种反应和曲线图是从两条复位线计算中得到的：该种反应和曲线图是从两条复位线计算中得到的：一条在孵育阶段，一条在读数阶段。如果反应良一条在孵育阶段，一条在读数阶段。如果反应良好的话这两条总是一样的。读数阶段的复位线以好的话这两条总是一样的。读数阶段的复位线以分钟来计算吸光率变化率（分钟来计算吸光率变化率（A/A/分钟）。然后这分钟）。然后这个值乘以因数来计算样本中分析浓度：个值乘以因数来计算样本中分析浓度：n n样本中样本中Conc.=Conc.=因数因
37、数x x（A3 A2A3 A2）（A3 A3 A2A2）=A/A/分钟分钟延迟时间 孵育时间 读数时间 延迟时间 孵育时间 读数时间起始速率法起始速率法（I.R.）n n这种方式的反应与动力法反应十分相似。如果初始阶段稳定的话，那么它就含有与动力法反应完全一样的反应。如果初始阶段不稳定的话，复位线就是将外部点除去49%至100%计算得来的。因此除按分钟计算外，这种计算方法与动力法反应的计算方法一样。n n样本中Conc.=因数x（A）样本空白（样本空白（A）法）法n n当需要清除样本干扰（例如混浊的血清）时就使当需要清除样本干扰（例如混浊的血清）时就使用这种方法。这种是双试剂终点法反应。这种反
38、用这种方法。这种是双试剂终点法反应。这种反应和计算是在两种截然不同的阶段执行的：第一应和计算是在两种截然不同的阶段执行的：第一阶段（样本空白）是在第一种试剂和样本阶段（样本空白）是在第一种试剂和样本（R1+SR1+S）中产生反应的；第二阶段是在第一种试）中产生反应的；第二阶段是在第一种试剂和样本和第二种试剂（剂和样本和第二种试剂（R1+S+R2R1+S+R2）中产生反应）中产生反应的。用来计算浓度的最后吸光率在两阶段的数值的。用来计算浓度的最后吸光率在两阶段的数值差中得到：差中得到：n n样本中样本中Conc.=Conc.=因数因数x A2 x A2 （A1 x kA1 x k）样本空白（样本
39、空白（B）法）法n n这种方法的反应与前一种非常相似。反应总是在这种方法的反应与前一种非常相似。反应总是在两个阶段产生：第一阶段（样本空白）仪器从第两个阶段产生：第一阶段（样本空白）仪器从第一种试剂和样本（一种试剂和样本（R1+SR1+S）所产生反应的中读出最）所产生反应的中读出最后的吸光率（后的吸光率（A1A1），从第二种试剂和样本），从第二种试剂和样本（R2+SR2+S）所产生反应的中读出最后的吸光率）所产生反应的中读出最后的吸光率（A2A2）。这两种反应是截然不同和独立的，在两）。这两种反应是截然不同和独立的，在两个不同的正在读数的比色杯取样。在计算中所使个不同的正在读数的比色杯取样。在
40、计算中所使用的最后吸光率是从两个阶段的数值差中得到：用的最后吸光率是从两个阶段的数值差中得到：n n样本中样本中Conc.=Conc.=因数因数x x（A2 A1A2 A1）n n R1+S R2+S两点终点法两点终点法n n这种方法（只用在单试剂测试中）是在需要清除反应中由于血清的干扰中使用的。最后的值减去孵育阶段的吸光率读数：n n样本中Conc.=因数x（A3 A1）n n 等待时间 孵育时间 读数时间 只读法只读法n n这种方法只在样本加入试剂空白的终点法反应读数时使用。它可被用做读已（手工）准备好的溶解液。用作计算的因数可从定标或用户自己设定中得到：n n样本中Conc.=因数x 最
41、后的A值。乳胶颗粒法乳胶颗粒法n n使用乳胶颗粒法试剂的仪器要求严格遵循程序设定过程的使用乳胶颗粒法试剂的仪器要求严格遵循程序设定过程的时限。因此分析仪就不能使取样和读数阶段最优化，这样时限。因此分析仪就不能使取样和读数阶段最优化，这样就不可避免地减少所执行的每小时测试数目。这种方法与就不可避免地减少所执行的每小时测试数目。这种方法与样本空白（样本空白（A A）法十分相似。当需要清除样本的干扰（例）法十分相似。当需要清除样本的干扰（例如混浊的血清等）时就使用这种方法。其中包括双试剂终如混浊的血清等）时就使用这种方法。其中包括双试剂终点法反应。该反应和计算方法在两个阶段完成：第一阶段点法反应。该
42、反应和计算方法在两个阶段完成：第一阶段（样本空白）反应产生于第一种试剂和样本（样本空白）反应产生于第一种试剂和样本（R1+SR1+S）之间；）之间；第二阶段反应产生于第一种试剂和样本和第二种试剂第二阶段反应产生于第一种试剂和样本和第二种试剂（R1+S+R2R1+S+R2）之间。在计算中所使用的最后吸光率是从两）之间。在计算中所使用的最后吸光率是从两个阶段的吸光率数值差中得到：个阶段的吸光率数值差中得到：n n样本中样本中Conc.=Conc.=因数因数x A2 x A2 （A1 x kA1 x k）三、三、自动生化分析仪的基本参数及应用自动生化分析仪的基本参数及应用 n n了解生化分析仪基本参
43、数的原理，有利于仪器、试剂的正确使用，有助于正确分析和处理测定数据。但是，配套系统的原装分析参数不宜更改；采用非仪器配套的试剂及校准品体系时，参数修改要慎重。对于不同仪器、不同类型的反应分析程序，所显示的人机对话分析参数的信息有所不同。n n（一）反应测定时间n n 多数全自动生化分析仪可以在整个测定反应周期内连续监测（如 HITACHI 7170常规测定周期 10分钟，监测 34点，OLYMPUS AU600固定周期 8分 15秒，监测 27点），但反应监测时间是指该时间内的测定读数要用于结果计算。它的设置与加样点、加试剂点（包括R1、R2）、监测时间（读数点）、读数间隔时间及试剂样品比例等
44、有关，要结合方法学兼顾权衡。n n1反应时间（reactfon time）n n指仪器的一个分析周期中，试剂和样品混合到最末一点测定读数的时间。它对终点法尤其重要，是终点法的瓶颈。有的仪器有多个反应时间可选（如 HITACHI 7170），须预先选定。多数仪器为 10分钟左右，这对试剂提出了较高要求。不少终点法试剂（尤其手工法试剂）反应时间常常也在10分钟上下，测定时间没有余地，当样品浓度高或试剂质量下降时，均可致测定结果偏低。因此，终点法不宜采用标明反应时间接近和长于仪器最大反应时间的试剂盒。不得已时必须用接近测定范围上限的高浓度质控血清监测。n n2 2监测时间（读数点）和读数间隔时间监测
45、时间（读数点）和读数间隔时间n n各类型仪器不尽一致。离心式生化仪读数间隔时各类型仪器不尽一致。离心式生化仪读数间隔时间短，监测时间也短。流动式生化仪读数间隔时间短，监测时间也短。流动式生化仪读数间隔时间一般较长。分立式生化仪一般监测时间间一般较长。分立式生化仪一般监测时间1010分钟分钟左右，间隔左右，间隔10103030秒读数一次。有的仪器在整个秒读数一次。有的仪器在整个测定反应周期全程读数，有的只读取指定时间测定反应周期全程读数，有的只读取指定时间（点）的吸光度。（点）的吸光度。n n3 3加试剂点加试剂点 n n 采用双试剂时，加采用双试剂时，加 R2R2点决定点决定 R1R1与样品的
46、反应时与样品的反应时间，也决定间，也决定 R2R2与与R1R1及样品的反应时间。一般仪器及样品的反应时间。一般仪器各各5 5分钟左右。分钟左右。HITACHI 7170HITACHI 7170有四个加试剂点，有四个加试剂点，若采用双试剂，各若采用双试剂，各5 5分钟，则加分钟，则加R2R2设在第设在第3 3加试剂加试剂点。点。n n 4 4反应监测时间还要考虑延迟时间的长短、测反应监测时间还要考虑延迟时间的长短、测定物质的浓度范围及相关临床价值。工作效率等定物质的浓度范围及相关临床价值。工作效率等因素。因素。n n（二）延迟时间n n 延迟时间（delay time）是指试剂与样品混合后到监测
47、开始之间的时间。一般用于两点法和速率法，某些情况下也用于终点法。终点法应选择反应趋于平衡的时间（稳定期或平衡期）作测定，测定点前即所谓的孵育期。速率法的线性反应期之前即延迟期。正确选择延迟时间的长短，有利于准确测定，减少试验误差。设置一般根据试剂盒的说明书，还应考虑本室的仪器特点和工作程序。n n1仪器特点 比如半自动生化仪多为流动比色池，要考虑泵速、进样管长短。反应液粘稠度及混合情况，以及室温、反应液温度同反应要求温度间的温差，等等。全自动生化仪的测定读数设置方式不同，直接以“秒”设置，或以测定点设置，测定点间隔时间不一样，需要灵活掌握。n n 2 2试剂及方法学试剂及方法学n n （l l
48、）试剂组成：在酶活性的连续监测法时，若）试剂组成：在酶活性的连续监测法时，若试剂含工具酶数量多、偶联反应多，则激活反应试剂含工具酶数量多、偶联反应多，则激活反应时间一般较长，延迟时间也较长，如肌酸激酶时间一般较长，延迟时间也较长，如肌酸激酶（NACNAC法）延迟时间常设置法）延迟时间常设置120120180180秒；若试剂秒；若试剂中底物经待测酶催化，其产物可以直接测定的，中底物经待测酶催化，其产物可以直接测定的，则延迟时间较短，则延迟时间较短，n n如如 -谷氨酰转移酶（谷氨酰转移酶（GGTGGT）设定）设定 3030 6060秒。同一秒。同一项目同一方法，但试剂配方不同，其反应快慢等项目同
49、一方法，但试剂配方不同，其反应快慢等特征也可能不同，如白蛋白测定。白蛋白与溴甲特征也可能不同，如白蛋白测定。白蛋白与溴甲酚绿（酚绿（BCGBCG）为即时反应，）为即时反应，1010秒钟内已完成，其秒钟内已完成，其后后、球蛋白等也将与球蛋白等也将与BCGBCG发生反应，所以孵育发生反应，所以孵育时间不能延长。但在同一测定时间，时间不能延长。但在同一测定时间，BCGBCG浓度、浓度、缓冲液种类、缓冲液种类、pHpH和表面活性剂不同的试剂，测定和表面活性剂不同的试剂，测定结果可能差异明显。结果可能差异明显。n n（2）样品异常成分干扰：有的试验项目需要用工具酶将内源性代谢产物耗尽，比如丙氨酸氨基转移
50、酶活性测定试剂中须有足量的乳酸脱氢酶（LDH）。如果使用单试剂，正常血清样品延迟时间60秒即可；但当内源性酮酸增多（如酮症酸中毒）时，试剂内LDH常常不能在60秒内完全将其清除，剩余酮酸会进入监测期干扰测定，使测定结果偏高，所以延迟时间应增至90120秒。采用双试剂，则可在加入R1后即进入预孵育期。n n（3）方法学要求：比如肌酐（Jaffe氏法）测定的特异性不强，一般认为反应前20秒左右为乙酰乙酸等快反应干扰物呈色，后约80100秒为蛋白质等慢反应假肌酐呈色，2060秒肌酐呈色反应占主导地位。采用两点法或速率法可减少干扰，但具体取多长的延迟时间，应根据试剂和仪器读数特点来评价决定。n n 3