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1、荧荧光原位光原位杂杂交交（FISHFISH）技）技术术血液血液肿肿瘤瘤诊诊疗疗中中的的应应用用一、技一、技术术 二、二、质质控控 三三、临临床床应应用用四四、多多技技术术结结合合应应用案用案例例技技术术理理论论1950-19601960-19701970-19801980-1990显带时显带时期期非非显带时显带时期期18881888提提 出出 染染 色色 体体19141914染染色色体体 畸畸变变导导 致致肿肿瘤瘤19561956确确 定定 染染 色色 体体 46 46 条条19581958应应 用用 于于 血血 液学液学19601960发现发现Ph Ph 染色体染色体 CMLCML显带显带技
2、技 术术高速高速 发发展展 G/RG/R多多种种血血 液液病病相相 关关异异常常 核核型型被被 发现发现FISHFISH中期中期/间间期期多色多色 FISHFISH微微阵阵列技列技术术 aCGHaCGH、aSNPaSNPCGHCGH技技术术分子分子遗传遗传细细胞胞遗传遗传学学发发展展简简史史FISHFISH技技术术的的发发展展1990年FISH1992年CGH1996年24色FISH（SKY、M-FISH、RX-FISH）2001年array CGH技技术术原理原理AGGCTATTCCGATACOVALENT BONDFFSpecimen DNAFISH Probe DNA操作步骤操作步骤FI
3、SHFISH样本的制备样本的制备（染色体制备、细胞滴片制备）（染色体制备、细胞滴片制备）探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针）探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针）探针标记探针标记杂交（杂交（7676变性变性10min10min、3737杂交杂交10h10h）洗脱洗脱DAPIDAPI复染复染荧光显微镜检测荧光显微镜检测结果分析结果分析FISHFISH技技术术的特点的特点 操作操作简简便，便，稳稳定，人定，人员员培培训较训较快快 方法敏感，特异性好，方法敏感，特异性好，检测检测效效率率高，高，能能迅迅速速得到得到 结结果，果，2424小小时时就可以完成就可以完成检测检测 标标本本来来源源
4、丰丰富富，细细胞胞不不需需培培养养，间间期期细细胞胞，分分裂裂 中中期期细细胞胞、分分化化或或未未分分化化细细胞胞及及死死亡亡或或存存活活的的细细 胞皆可以被胞皆可以被检测检测 可与多种技可与多种技术结术结合（合（细细胞形胞形态态学学、免、免疫疫学学、流式流式 细细胞胞术术），可回），可回顾顾性分性分析析,可确定可确定恶恶性性细细胞胞的的克克隆隆 起源或起源或鉴别鉴别良良恶恶性性细细胞胞FISHFISH技技术术的局的局限限性性 异常异常检测检测取决于能否取决于能否获获得相得相应应探探针针 三体三体检测检测敏感性高于敏感性高于单单体或缺失体或缺失 骨髓、外周血骨髓、外周血标标本本较实较实体瘤、体
5、瘤、石石蜡切蜡切片片好好处处理理 不能不能检测检测全基因全基因组组异常（异常（间间期期FISHFISH）FISHFISH主要主要仪仪器器 FISHFISH分析工作站（分析工作站（荧荧光光显显微微镜镜、分析照相、分析照相软软件）件）荧荧光原位光原位杂杂交交仪仪 恒温水浴槽恒温水浴槽 高速离心机高速离心机 培养箱培养箱 微量加微量加样样器器pHpH仪仪FISHFISH技技术术比比较较FISHFISHSKY SKY M-FISHM-FISHRX-FISHRX-FISHCGHCGHaCGHaCGH全染色体全染色体扫扫描描平衡易位平衡易位部分不平衡易位不平衡易位部分倒位倒位部分缺失缺失部分扩扩增增部分非
6、整倍体非整倍体分辨率分辨率1-10 kb2-10 Mb2-10 Mb3 Mb10-100kbFISHFISH探探针针种种类类着丝粒探针位点探针涂染探针双色双色单单融合探融合探针针额额外信号探外信号探针针双色双融合探双色双融合探针针正常异 常双色分离探双色分离探针针数量、位点探数量、位点探针针人人类细类细胞胞遗传遗传学命名学命名 nunuc c isish h(CEP8(CEP82)4002)400nunuc c ish(BCR,ABL)ish(BCR,ABL)24024000nunuc c isish h(BCR,ABL)(BCR,ABL)3,(B3,(BCRCR cocon n A AB B
7、L L2)380/4002)380/400nunuc c isish h(MLL(MLL2)4002)400 nunuc c isish h(MLL(MLL2)(52)(5MLMLL L sesep p 3 3MLMLL L1)100/2001)100/200 nunuc c isish h(CEPX(CEPX2)2/(2)2/(C CEPEPX X,CE,CEP PY Y)1 1 3 39898 A:nuc ish(ABL,BCR)2B:nuc ish(ABL 2,BCR 3)ABLBCRAABLBCRBA:nuc ish(ABL,BCR)3(ABL con BCR2)B:nuc ish(A
8、BL,BCR)4(ABL con BCR3)C:nuc ish(ABL 3,BCR 2)(ABL con BCR1)ABLBCRBBCRABLACABLBCRTELAML1A:nuc ish(TEL2,AML13)(TEL con AML11)B:nuc ish(TEL1,AML14)(TEL con AML11)C:nuc ish(TEL2,AML15)AML1TEL/AML1AAML1TELBCABCD5S721D5S721D5S721EGR1EGR1EGR1A:nuc ish(D5S23/D5S7211,EGR11)B:nuc ish(D5S23/D5S7212,EGR11)C:nuc
9、ish(D5S23/D5S7213,EGR11)质质量控制量控制质质量管理内容量管理内容 商品探商品探针针、自配、自配试剂验证试剂验证 标标准化流程及准化流程及规规范化操作（前范化操作（前处处理、理、实实验验操操作）作）规规范判范判读标读标准准 建立本建立本实验实验室判室判读阈值读阈值 建立建立临临床生物参考区床生物参考区间间FISHFISH操作流程操作流程 样样本制本制备备：细胞、骨髓、外周血、组织等 制片制片：细胞悬液滴片或石蜡组织切片 预处预处理理：2SSC，固定液，NaSCN 酶酶消化消化：胃蛋白酶，蛋白酶K 变变性性：温度 杂杂交交：互补结合，温度 洗洗涤涤：无附离子溶液，PH，温度
10、复染复染：DAPI II 读读片：片：荧光显微镜，滤镜FISHFISH技技术术要点要点 样样本本浓浓度、切片厚度、度、切片厚度、细细胞状胞状态态 充分低渗与固定充分低渗与固定 制片制片环环境温度与湿度境温度与湿度 探探针针充分混匀充分混匀 变变性液性液pHpH与温度与温度 橡皮泥橡皮泥严严密封片密封片 洗脱液温度洗脱液温度 抗衰抗衰变剂变剂规规范判范判读读 规规范正常和异常信号范正常和异常信号 杂杂交成功交成功率率75%计计数数量、方法：数数量、方法：单单人，分人，分别别于不同区域各于不同区域各连续连续计计数数200个个细细胞胞双人，每人于不同区域各双人，每人于不同区域各计计数数200个个细细
11、胞胞计计数数规规范范信号判信号判读误读误差差分离信号分离信号误误判判石蜡切片石蜡切片误误差差建立建立阈值阈值 选选取正常取正常样样本本1 10 0-20-20份建立份建立针对针对探探针针的假阳性率的假阳性率 统计统计方法方法 x+3SD 分布（分布（95%95%可信区可信区间间）结结合合临临床逐步建立生物参考区床逐步建立生物参考区间间结结果及果及报报告告临临床床应应用用FISHFISH临临床床应应用用检测检测染色体数目与染色体数目与结结构异常构异常疗疗效分析效分析鉴鉴定定标记标记染色体染色体检测检测早期复早期复发发鉴鉴定移植后早期复定移植后早期复发发鉴鉴定定肿肿瘤瘤细细胞的胞的细细胞系列胞系列
12、基因定位、病灶基因定位、病灶组织组织定位定位FISHFISH常常用用探探针针的的组组合合应应用用探探针针种种类类检测检测目的目的慢性粒慢性粒细细胞白血病胞白血病（CMLCML）：）：BCR/ABBCR/ABL L (融合探融合探针针)BCR/ABLBCR/ABL/A ASSSS1 1t(9;22)t(9;22)伴ASS1基因缺失探探针针种种类类检测检测目的目的急性髓系白血病急性髓系白血病（A AM ML L）：）：PMLPML/RARRARa a (融合探融合探针针)RARaRARat(15;17)AML1/ETAML1/ETO O (融合探融合探针针)t(8;21)MLMLL L（11q21
13、1q23 3）(分离分离探探针针)t(v;11)CBFCBFB B（16q16q2222）(分分离探离探针针)inv(16)；t(16;16)EVI1(3qEVI1(3q2 26 6)(分离探分离探针针)t(3;3);inv(3)探探针针种种类类检测检测目的目的急性淋系白血病（急性淋系白血病（A AL LL L）：）：BCR/ABBCR/ABL L (融合探融合探针针)t(9;22)TEL/AMLTEL/AML1 1 (融合探融合探针针)t(12;21)TCF3/PBTCF3/PBX X1 1 (融合探融合探针针)t(1;19)MLLMLL（11q211q23 3）(分离分离探探针针)t(v;
14、11)IGHIGH（14q314q32 2）(分离分离探探针针)t(v;14)探探针针种种类类检测检测目的目的骨髓增生异常骨髓增生异常综综合征合征（M MD DS S）：）：CEPCEP8 8 (位点探位点探针针)+8EGR1/D5EGR1/D5S S7 72121（5 5q q3 31 1;5 5p p1 15 5.2 2）(双位点探双位点探针针)-5；del(5q31)D7S486/D7S486/C CE EP7P7（7 7q q3 31 1;7 7p p1 11 1-7 7q q1 11 1）(双位点探双位点探针针)-7；del(7q31)D20S108D20S108（2 20 0q q
15、1 12 2）(位位点探点探针针)del(20q12)EVI1(3qEVI1(3q2 26 6)(分离探分离探针针)t(3;3);inv(3)探探针针种种类类检测检测目的目的淋巴瘤、慢性淋巴淋巴瘤、慢性淋巴细细胞白血胞白血病：病：RB-1RB-1（或（或D1D13 3S S3 31 19 9)（1 13 3q q1 14 4）(位位点点探探针针)del(13)(q14)IGHIGH（14q314q32 2）(分离分离探探针针)涉及IGH基因异常初筛P53P53（17p117p13 3.1 1）(位位点点探探针针)P53基因缺失CCND1/ICCND1/IG GH H (融合探融合探针针)CCN
16、CCND1D1t(11;14)MYCMYC（8q248q24）(分分离离探探针针)I IG GH H/C C-M MYCYC涉及MYC基因异常初筛ATMATM（11q211q22 2.3 3）(位位点点探探针针)ATM基因缺失CEP1CEP12 2 (位点探位点探针针)+12BCL6BCL6（3q23q27 7）(分离分离探探针针)涉及BCL6基因异常初筛BCL2BCL2（18q18q2 21 1）(分分离探离探针针)I IG GH H/B BC CL L2 2涉及BCL2基因异常初筛探探针针种种类类检测检测目的目的多多发发性骨髓瘤性骨髓瘤（M MM M）：（建：（建议议应应用用CDCD1 1
17、3 38 8分分选细选细胞）胞）R RB-1B-1（13q13q1414）(位位点探点探针针)RB-1基因缺失初初筛检测筛检测IGIGH H（14q314q32 2）(分离分离探探针针)涉及IGH基因异常初筛P5P53 3（17p117p13.3.1 1）(位位点点探探针针)P53基因缺失CKS1B/CCKS1B/CD DK KN2N2C C（1q1q2 21;1;1 1p p3 32.2.3 3）(双位点探双位点探针针)1q21扩增;del(1p32)FGFR3/IFGFR3/IG GH H (融合探融合探针针)t(4;14)IGHIGH阳性阳性标标 本后本后续检测续检测MAF/IGMAF/
18、IGH H (融合探融合探针针)t(14;16)CCND1/ICCND1/IG GH H (融合探融合探针针)t(11;14)MAFB/IGMAFB/IGH H (融合探融合探针针)t(14;20)探探针针种种类类检测检测目的目的伴嗜酸伴嗜酸细细胞增多的髓系或淋胞增多的髓系或淋系系肿肿瘤瘤、M MD DS S、M MPNPNFGFR1/DFGFR1/D8 8Z Z2(2(8 8p p1 11 1)(分离探分离探针针)PDGFRAPDGFRA（4 4q q1 12 2）PDGFRPDGFRB B（5 5q q3 32 2-q q3 33 3）t(8;13)4q12 t(5;12)移植排斥移植排斥检测检测：CEPX/CEPX/Y Y (双位点探双位点探针针)XX和XY结语结语精准精准方方法，法，细细致分致分析析新新技技术术及及多多学科学科技技术联术联合合探探讨讨特特征性征性染染色体色体异异常分常分子子机机制制疗疗效效判判断断预预后后评评估估，指指导导靶靶向和向和个体个体化治化治疗疗