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1、关于细胞组分的分离与关于细胞组分的分离与鉴定鉴定第一页，本课件共有8页一、实验目的一、实验目的 了解用细胞匀浆和差速离心的方法分级分离了解用细胞匀浆和差速离心的方法分级分离 细胞组分的原理及过程。细胞组分的原理及过程。熟悉离心机、匀浆器的使用方法。熟悉离心机、匀浆器的使用方法。第二页，本课件共有8页二、实验内容二、实验内容 实验原理实验原理 细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，一离心场
2、内的沉降速度也不相同，根据这一原理，一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞内各种常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞内各种常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞内各种常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。组分分级分离出来。组分分级分离出来。组分分级分离出来。此法是通过组织细胞匀浆、分级分离（密度此法是通过组织细胞匀浆、分级分离（密度梯度离心或差速离心）和分析三个步骤完成的。梯度离心或差速离心）和分析三个步骤完成的。第三页，本课件共有8页 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分
3、离不同大小的细胞和细胞器。于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核蛋白体。为核蛋白体。为核蛋白体。为核蛋白体。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 1.1.差速离心差速离心（differential centr
4、ifugation）第四页，本课件共有8页 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。常用的介质为力或离心力场的作用使细胞分层、分离。常用的介质为力或离心力场的作用使细胞分层、分离。常用的介质为力或离心力场的作用使细胞分层、分离。常用的介
5、质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。2.2.密度梯度离心密度梯度离心(density gradient centrifugation)第五页，本课件共有8页实验方法实验方法 1.1.处死家兔处死家兔：耳缘静脉空气栓塞法：耳缘静脉空气栓塞法：耳缘静脉空气栓塞法：耳缘静脉空气栓塞法2.2.制备肝细胞匀浆制备肝细胞匀浆制备肝细胞匀浆制备肝细胞匀浆:n n 家兔处死后，立即剖腹取肝，迅速浸入预冷的家兔处死后，立即剖腹取肝，迅速浸入预冷的家兔处死后，立即剖腹取肝，迅速浸入预冷的家兔处死后，立即剖腹取肝，迅速浸入预冷的 生理盐水中洗去血污，用
6、滤纸吸干。生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。n n 按每克肝重加按每克肝重加按每克肝重加按每克肝重加9ml冷的冷的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液匀浆蔗糖溶液匀浆蔗糖溶液匀浆蔗糖溶液匀浆 化。（化。（20g9ml/g=180ml）n n 用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润），过滤匀用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润），过滤匀用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润），过滤匀用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润），过滤匀 浆液于烧杯中。浆液于烧杯中。制备一张滤液涂片制备一张滤液涂片，做好标，做好标 记，自然干燥。记，自然干燥。第六页，本课件共有8页 每组取每组取10ml10ml10ml10ml滤液，滤液，30
7、00r/min3000r/min离心离心离心离心10min10min，制备一制备一张上清液涂片张上清液涂片，做好标记，自然干燥。，做好标记，自然干燥。吸去上清，用吸去上清，用10ml 0.25 mol/L 10ml 0.25 mol/L 蔗糖液悬浮沉淀蔗糖液悬浮沉淀蔗糖液悬浮沉淀蔗糖液悬浮沉淀物，用吸管混匀，配平后以物，用吸管混匀，配平后以物，用吸管混匀，配平后以物，用吸管混匀，配平后以3000r/min3000r/min3000r/min3000r/min离心离心离心离心10 min10 min。吸。吸去上清液，加入去上清液，加入0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml蔗糖溶液，用吸管吹打成悬液，蔗糖溶液，用吸管吹打成悬液，蔗糖溶液，用吸管吹打成悬液，蔗糖溶液，用吸管吹打成悬液，制备一张涂片制备一张涂片制备一张涂片制备一张涂片，做好标记，自然干燥。，做好标记，自然干燥。，做好标记，自然干燥。，做好标记，自然干燥。3.3.3.3.差速离心法分离细胞器差速离心法分离细胞器 n n 低速离心分离细胞核低速离心分离细胞核n n 高速离心分离线粒体高速离心分离线粒体高速离心分离线粒体高速离心分离线粒体第七页，本课件共有8页感谢大家观看第八页，本课件共有8页