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1、关于细胞的破碎与分离关于细胞的破碎与分离1第一页，本课件共有59页2本章内容生物分离过程的一般流程第二页，本课件共有59页3主要内容主要内容概述细胞破碎概述细胞破碎细胞壁的结构和化学组成细胞壁的结构和化学组成细胞壁的破碎细胞壁的破碎 方法试剂设备方法试剂设备第三页，本课件共有59页41 概述概述不同类型的细胞分泌目标产物的类型：动物细胞多分泌到细胞外培养液植物细胞多为胞内产物微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。第四页，本课件共有59页51概述概述l大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。l有些目标产物存在于生物体中。l
2、尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。l脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。第五页，本课件共有59页61 概述概述胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物如氨基酸、抗生素谢物如氨基酸、抗生素细胞本身：细胞本身：单细胞蛋白单细胞蛋白 如面包酵母如面包酵母胞内产品：胞内产品：各种胞内酶各种胞内酶、基因工程产物、基因工程产物第六页，本课件共有59页71 概述概述目标产品位置目标产品位置第七页，本课件共有59页81.概述概述细细胞胞破破碎碎 指指采采用用一一定定的的方方法法，在在一一定定程程度度上上破破坏坏细细胞胞壁壁和和细细胞胞膜膜，设设法法使使
3、胞胞内内产产物物最最大大程程度度的的释释放放到到液液相相中中，破破碎碎后后的的细细胞胞浆浆液液经经固固液液分分离离除除去去细细胞胞碎碎片片后后，再再采用不同的分离手段进一步纯化。采用不同的分离手段进一步纯化。细胞破碎细胞破碎指选用物理、化学、酶或机械指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。的方法来破坏细胞壁或细胞膜。第八页，本课件共有59页9细胞破碎细胞破碎本质上是一种增溶作用，细胞破碎的阻力来本质上是一种增溶作用，细胞破碎的阻力来自于细胞壁的结构和组成的差异。自于细胞壁的结构和组成的差异。细胞的结构根据细胞种类而异，动物、植物细胞的结构根据细胞种类而异，动物、植物和微生物细胞的
4、结构差异很大。和微生物细胞的结构差异很大。动物细胞、嗜盐菌和支原体没有细胞壁，易于破碎；动物细胞、嗜盐菌和支原体没有细胞壁，易于破碎；植物细胞和微生物细胞有坚固的细胞壁，破碎困难，需用植物细胞和微生物细胞有坚固的细胞壁，破碎困难，需用强烈的破碎方法。强烈的破碎方法。第九页，本课件共有59页102细胞壁的结构和化学组成细胞壁的结构和化学组成原核生物原核生物细菌细菌 肽聚糖、多糖、磷壁酸，主要阻力来自肽聚糖、多糖、磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构；于肽聚糖的网状结构；革兰菌细胞壁结构图革兰菌细胞壁结构图真核生物真核生物酵母菌酵母菌 葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质，主要阻葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质，主
5、要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度；力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度；酵母细胞壁结构示酵母细胞壁结构示意图意图真菌真菌 多糖、蛋白质、脂类、葡聚糖、几丁质，主要阻力来多糖、蛋白质、脂类、葡聚糖、几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。自于壁强度和聚合物网状结构。第十页，本课件共有59页11革革兰兰菌菌细细胞胞壁壁结结构构图图第十一页，本课件共有59页12酵母细胞壁结构示意图酵母细胞壁结构示意图第十二页，本课件共有59页13各种微生物细胞壁的结构和组成各种微生物细胞壁的结构和组成微微生生物物的的细细胞胞壁壁都都由由网网状状的的高高分分子子聚聚合合物物构构成成，破破碎碎的的难难易易程程
6、度度主主要要取取决决于于构构成成细细胞胞壁壁的的聚聚合合物物的的种种类类及及细细胞胞壁壁的的厚厚度度和和强强度。度。第十三页，本课件共有59页14植物植物细细胞壁的胞壁的结结构构l对于已生长结束的植物细胞壁可分为对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁。初生壁和次生壁。l初初生生壁壁是是细细胞胞生生长长期期形形成成的的。初初生生壁壁一一般般较较薄薄(13m)，富富有有弹弹性性。由由多多糖糖和和蛋蛋白白质质构构成成，多多糖糖主主要要成成分分为为纤纤维维素素、半半纤纤维维素素和和果果胶胶类类物物质质。纤纤维维素素是是长长链链D-葡葡聚聚糖糖，许许多多这这样样的的长长链链形形成成微微纤纤丝丝，
7、构构成成细细胞胞壁壁的的骨骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。l某某些些植植物物细细胞胞，当当生生长长停停止止后后，在在细细胞胞质质和和初初生生细细胞胞壁壁之之间间形形成成了了次次生生细细胞胞壁壁。次次生生壁壁一一般般较较厚厚(4m以以上上)，纤纤维维素素和和半半纤纤维维素素含含量量比比初初生生壁壁增增加加很很多多，纤纤维维素素的的微微纤纤丝丝排排列列得得更更紧紧密密和和有有规规则则，而而且且存存在在木木质质素素的的沉沉积积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机
8、械强度。第十四页，本课件共有59页153 细胞壁的破碎细胞壁的破碎第十五页，本课件共有59页163.1破碎率的评价（三种）破碎率的评价（三种）破破碎碎率率：被被破破碎碎细细胞胞的的数数量量占占原原始始细细胞胞数量的百分比数。数量的百分比数。Y(%)=(N0-N)/N0100N0:原始细胞数量；原始细胞数量；N：t时间操作后未损害完整细胞数量；时间操作后未损害完整细胞数量；第十六页，本课件共有59页171）直接测定法）直接测定法利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞的量。整细胞的量。染色法染色法例如，破碎的革兰氏阳性菌可染色成革兰氏例如，破碎的革兰氏阳
9、性菌可染色成革兰氏阴性菌的颜色，利用革兰染色法使未受损害阴性菌的颜色，利用革兰染色法使未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。呈现亮红色。第十七页，本课件共有59页182)目的产物测定法目的产物测定法 蛋白质量或酶的活力蛋白质量或酶的活力细细胞胞破破碎碎后后，测测定定悬悬浮浮液液中中细细胞胞内内含含物物的的增量来估算破碎率。增量来估算破碎率。通通常常将将破破碎碎后后的的细细胞胞悬悬浮浮液液离离心心，测测定定上上清清液液中中蛋蛋白白质质的的含含量量或或酶酶的的活活力力，并并与与100%破碎所获得的标准值直接比较。破碎所获得的标准值直接比较。
10、第十八页，本课件共有59页193)导电率测定法导电率测定法细细胞胞破破碎碎后后，大大量量带带电电荷荷的的内内含含物物被被释释放放到到水相，使导电率上升。水相，使导电率上升。第十九页，本课件共有59页203.2 细胞破碎的方法细胞破碎的方法分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法高压匀浆法液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性
11、菌丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作不适合大规模操作非非机机械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差溶酶价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改变细胞膜的渗透性改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差低，通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融
12、化法冻结融化法反复冻结反复冻结-融化融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法干燥法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活条件变化剧烈，易引起大分子物质失活第二十页，本课件共有59页211)机械法机械法珠磨法珠磨法高压匀浆法高压匀浆法超声波法超声波法第二十一页，本课件共有59页221)1固体剪切方法固体剪切方法 珠磨法珠磨法(bead mill)原原理理：进进入入珠珠磨磨机机的的细细胞胞悬悬浮浮液液与与极极细细的的玻玻璃璃小小珠珠、石石英英砂砂、氧氧化化铝铝等等研研磨磨剂剂（直直径径小小于于1mm）一一起起快快速速搅搅拌拌或或
13、研研磨磨，研研磨磨剂剂、珠珠子子与与细细胞胞之之间间的的互互相相剪剪切切、碰碰撞撞，使使细细胞胞破破碎碎，释释放放出出内内含含物物。在在珠珠液液分分离离器器的的协协助助下下，珠珠子子被被滞滞留留在在破破碎碎室室内内，浆浆液液流流出出从从而而实实现现连连续续操操作作。破破碎碎中中产产生生的的热热量量一一般般采采用用夹夹套冷却的方式带走。套冷却的方式带走。适适于于绝绝大大多多数数微微生生物物细细胞胞的的破破碎碎，更更适适合合于于真真菌菌菌丝和藻类。菌丝和藻类。第二十二页，本课件共有59页23WSK卧式高效全能珠磨机ZM系列卧式密闭珠系列卧式密闭珠(砂砂)磨机磨机第二十三页，本课件共有59页24珠磨
14、法珠磨法(bead mill)实实验验室室规规模模的的细细胞胞破破碎碎设设备备有有Mickle高高速速组组织织捣捣碎碎机机、Braun匀浆器；匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；在在工工业业规规模模中中，可可采采用用高高速速珠珠磨磨机机(瑞瑞士士WAB公公司司和和德国西门子机械公司制造德国西门子机械公司制造)。珠珠磨磨法法的的破破碎碎率率一一般般控控制制在在80%以以下下：降降低低能能耗耗、减减少少大大分分子子目目的的产产物物的的失失活活、减减少少由由于于高高破破碎碎率率产产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。生的细胞小碎片不易分离而给后续
15、操作带来的困难。第二十四页，本课件共有59页25 珠磨法珠磨法(bead mill)特点：特点：适用对象较广适用对象较广工业化、实验室中应用工业化、实验室中应用细胞完全破碎细胞完全破碎需冷却需冷却第二十五页，本课件共有59页261）2 液体剪切方法液体剪切方法 高压匀浆法高压匀浆法High-pressure homogenization大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法采采用用高高压压匀匀浆浆器器（由由高高压压泵泵和和匀匀浆浆阀阀组组成成，英英国国APV公公司司和和美美国国 Microfluidics公司均有产品出售）。公司均有产品出售）。利利用用高高压压使使细细胞胞悬悬浮浮液液
16、通通过过针针形形阀阀，由由于于突突然然减减压压和和高高速速冲冲击击撞撞击击环环使使细细胞胞破破碎碎，细细胞胞悬悬浮浮液液自自高高压压室室针针形形阀阀喷喷出出时时，每每秒秒速速度度高高达达几几百百米米，高高速速喷喷出出的的浆浆液液又又射射到到静静止止的的撞撞击击环环上上，被被迫迫改改变变方方向向从从出出口口管管流流出出。细细胞胞在在这这一一系系列列高高速速运运动动过过程程中中经经历历了了剪剪切切、碰碰撞撞及及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。第二十六页，本课件共有59页27高压匀浆器示意图高压匀浆器示意图第二十七页，本课件共有59页28高压匀浆法高压匀浆
17、法High-pressure homogenization特点：特点：适用对象广，最适合于酵母和细菌；适用对象广，最适合于酵母和细菌；工业化、实验室中应用工业化、实验室中应用细胞完全破碎细胞完全破碎易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）匀浆阀）不宜采用高压匀浆法。第二十八页，本课件共有59页291）-3 X挤压器法挤压器法 X-press法法改改进进的的高高压压方方法法：将将浓浓缩缩的的菌菌体体悬悬浮浮液液冷冷却却至至-25形形成成冰冰晶晶体
18、体，利利用用500MPa以以上上的的高高压压冲冲击击，使使冷冷冻冻细细胞从高压阀小孔中挤出。胞从高压阀小孔中挤出。细细胞胞破破碎碎是是由由于于冰冰晶晶体体的的磨磨损损，使使包包埋埋在在冰冰中中的的微微生物变形而引起的。生物变形而引起的。此此法法主主要要用用于于实实验验室室，适适应应范范围围广广、破破碎碎率率高高、细细胞胞碎碎片片粉粉碎碎程程度度低低及及活活性性保保留留率率高高等等优优点点，但但不不适适应应于于对对冷冷冻敏感的生化物质。冻敏感的生化物质。第二十九页，本课件共有59页301)-4 超声波法超声波法 Ultrasonicationl利利用用超超声声波波振振荡荡器器发发射射的的15-2
19、5kHz的的超超声声波波探头处理细胞悬浮液。探头处理细胞悬浮液。l超超声声波波振振荡荡器器以以可可分分为为槽槽式式和和探探头头直直接接插插入入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。l超超声声波波的的细细胞胞破破碎碎效效率率与与细细胞胞种种类类、浓浓度度和和超声波的声频、声能有关。超声波的声频、声能有关。第三十页，本课件共有59页31电声超声波发生器电声超声波发生器 示意图示意图第三十一页，本课件共有59页32JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机第三十二页，本课件共有59页33超声波法超声波法Ultrasonication其原理可能与空化现
20、象其原理可能与空化现象(cavitation phenomena)引起引起的冲击波和剪切作用有关。的冲击波和剪切作用有关。空空穴穴泡泡由由于于受受到到超超声声波波的的迅迅速速冲冲击击而而闭闭合合，从从而而产产生生一一个个极极为为强强烈烈的的冲冲击击波波压压力力，由由它它引引起起的的粘粘滞滞性性旋旋涡涡在在介介质质中中的的悬悬浮浮细细胞胞上上造造成成了了剪剪切切应应力力，促促使使细细胞胞液液体体发发生生流流动动，从而使细胞破碎。从而使细胞破碎。操操作作过过程程产产生生大大量量的的热热，因因此此操操作作需需在在冰冰水水或或外外部部冷冷却却的容器中进行。的容器中进行。第三十三页，本课件共有59页34
21、超声波破碎的适用范围超声波破碎的适用范围超超声声波波破破碎碎是是很很强强烈烈的的破破碎碎方方法法，适适用用于于多多数数微微生生物物的破碎。的破碎。一一般般杆杆菌菌比比球球菌菌易易破破碎碎，G-细细菌菌比比G+细细菌菌易易破破碎碎，对对酵酵母菌的效果较差。母菌的效果较差。但但超超声声波波产产生生的的化化学学自自由由基基团团能能使使某某些些敏敏感感性性活活性性物物质质失失活；活；超声波破碎的有效能量利用率极低；超声波破碎的有效能量利用率极低；由由于于对对冷冷却却的的要要求求相相当当苛苛刻刻，所所以以不不易易放放大大，但但在在实实验验室小规模细胞破碎中常用。室小规模细胞破碎中常用。第三十四页，本课件
22、共有59页35不同机械破碎方法的比较技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例匀匀浆浆法法(孔型孔型)须须使使细细胞胞通通过过的的小小孔孔，使使细细胞胞受受到到剪剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈适中适中细细胞胞悬悬浮浮液液大大规规模模处理处理珠珠 磨磨 破破碎法碎法细细胞胞被被玻玻璃璃珠珠或或铁铁珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈便宜便宜细细胞胞悬悬浮浮液液和和植植物物细胞的大规模处理细胞的大规模处理超超 声声 波波法法用用超超声声波波的的空空穴穴作作用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中昂贵昂贵细细胞胞悬悬浮浮液液小小规规模模处理处理第三十五页，本课件共有59页36机械破碎法机械破碎法需需要要高高能能量量，且且产产
23、生生高高温温和和高高剪剪切切力力，易易使使不稳定产品变性失活；不稳定产品变性失活；破破碎碎的的有有机机体体或或释释放放的的产产物物，不不专专一一，并并且且产生碎片的尺寸范围大，后处理难度大；产生碎片的尺寸范围大，后处理难度大；第三十六页，本课件共有59页372）非机械法）非机械法I 酶酶法法溶溶胞胞 Enzymatic Lysis，酶酶解解法法，酶酶溶法溶法利利用用酶酶反反应应，分分解解破破坏坏细细胞胞壁壁上上特特殊殊的的键键，从从而而达达到到破碎的目的。破碎的目的。外加酶法外加酶法自溶法自溶法第三十七页，本课件共有59页383.3 非机械法非机械法外加酶法外加酶法利利用用溶溶酶酶系系统统处处
24、理理细细胞胞时时必必须须根根据据细细胞胞壁壁的的结结构构和和化化学学组组成成选选择择适适当当的的酶酶，并并确确定定相应的次序。相应的次序。第三十八页，本课件共有59页39I 外加酶法外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等溶菌酶主要用于细菌类溶菌酶主要用于细菌类细胞壁溶解酶是几种酶的复合物第三十九页，本课件共有59页40重要微生物细胞壁的降解酶重要微生物细胞壁的降解酶第四十页，本课件共有59页41外加酶法外加酶法溶溶菌菌酶酶能能专专一一性性地地分分解解细细胞胞壁壁上上肽肽聚聚糖糖分分子子的的-1,41,4糖糖苷
25、苷键键，因因此此主主要要用用于于细细菌菌类类细细胞胞壁壁的的裂裂解解。革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌悬悬浮浮液液中中加加入入溶溶菌菌酶酶，很很快快就就产产生生溶溶壁壁现现象象。但但对对于于革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌，单单独独采采用用溶溶菌菌酶酶无无效效果果，必必须须与与螯合剂螯合剂EDTAEDTA一起使用。一起使用。放放线线菌菌的的细细胞胞壁壁结结构构类类似似于于革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌，以以肽肽聚聚糖糖为为主主要要成成分分，所所以以也也能能采采用用溶溶菌菌酶酶;酵酵母母和和真真菌菌由由于于细细胞胞壁壁的的组组分分主主要要是是纤纤维维素素、葡葡聚聚糖糖、几几丁丁质质等等，常常用用蜗蜗牛牛酶酶、纤纤维维
26、素素酶酶、多多糖糖酶酶等等;植植物物细细胞胞壁壁的的主主要要成成分分是是纤纤维维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。第四十一页，本课件共有59页42外加酶法外加酶法有有时时采采用用几几种种酶酶的的混混合合物物会会产产生生更更好好的的效效果果，加加入入时时需需确确定相应的次序。定相应的次序。对对酵酵母母细细胞胞采采用用酶酶法法破破碎碎时时，先先加加入入蛋蛋白白酶酶作作用用蛋蛋白白质质-甘甘露露聚聚糖糖结结构构，使使二二者者溶溶解解，再再加加入入葡葡聚聚糖糖酶酶作作用用裸裸露露的的葡葡聚聚糖糖层层，最最后后只只剩剩下下原原生生质质体体，这这时时若若缓缓冲冲液液的
27、的渗渗透透压压变变化化，则则细细胞胞膜膜破裂，释出胞内产物。破裂，释出胞内产物。第四十二页，本课件共有59页43外加酶法外加酶法优优点点：产产品品释释放放的的选选择择性性高高；抽抽提提的的速速率率和和收收率率高高；产产品品的的破破坏坏最最少少；对对pH值值和和温温度度等等外界条件要求低；不残留细胞碎片。外界条件要求低；不残留细胞碎片。费用费用高，通用性差。高，通用性差。适用性适用性：小规模的实验室研究。小规模的实验室研究。第四十三页，本课件共有59页44酶法溶胞酶法溶胞 自溶法自溶法 Autolysis自自溶溶作作用用是是酶酶解解的的另另一一种种方方法法，所所需需溶溶胞胞的的酶酶是是由由微微生
28、生物物本本身身产产生生的的。微微生生物物代代谢谢过过程程中中，大大多多数数都都能能产产生生一一种种能能水水解解细细胞胞壁壁上上聚聚合合结结构构的的酶酶，以以便便使使生生长长过程进行下去。过程进行下去。改改变变微微生生物物的的环环境境，可可诱诱发发产产生生过过剩剩的的这这种种酶酶或或激激发产生其他的自溶酶，以达到自溶目的。发产生其他的自溶酶，以达到自溶目的。影影响响因因素素 温温度度 时时间间 pH缓缓冲冲液液浓浓度度、细细胞胞代代谢谢途途径径等等缺缺点点：对对不不稳稳定定的的微微生生物物，易易引引起起所所需需蛋蛋白白质质的的变变性性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。自溶后细胞悬浮液粘度
29、增大，过滤速度下降。第四十四页，本课件共有59页45II 化学渗透法化学渗透法 Chemical permeation化化学学法法 用用某某些些化化学学试试剂剂溶溶解解细细胞胞壁壁或或抽抽提提细细胞中某些组分的方法胞中某些组分的方法 化学渗透法化学渗透法某某些些化化学学试试剂剂，如如有有机机溶溶剂剂、变变性性剂剂、表表面面活活性性剂剂、抗抗生生素素、金金属属螯螯合合剂剂等等，可可以以改改变变细细胞胞壁壁或或膜膜的的通通透透性性（渗渗透透性性），从从而而使使胞胞内内物物质质有选择地渗透出来。有选择地渗透出来。该该法法取取决决于于化化学学试试剂剂的的类类型型以以及及细细胞胞壁壁膜膜的的结结构与组成
30、。构与组成。第四十五页，本课件共有59页46II 化学渗透法化学渗透法(1)酸碱法酸碱法 调节调节pH值值酸酸处处理理可可以以使使蛋蛋白白质质水水解解成成氨氨基基酸酸，通通常常采采用用6mol/L HCl。碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。成本低，反应激烈，不具选择性。第四十六页，本课件共有59页47II 化学渗透法化学渗透法(2)有机溶剂法有机溶剂法能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。丁醇、丙酮、氯仿、甲苯破裂，胞内物质
31、被释放出来。丁醇、丙酮、氯仿、甲苯(3)表表面面活活性性剂剂法法 无无论论表表面面活活性性剂剂是是阴阴离离子子、阳阳离离子子还还是是非非离离子子型型，都都是是两两性性的的，既既能能和和水水作作用用也也能能和和脂脂作作用用，能能与与细细胞胞壁壁上上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解细胞破碎常用的表面活性剂：细胞破碎常用的表面活性剂：胆酸盐、磷脂等胆酸盐、磷脂等十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；非离子型如，阴离子型）；非离子型如Triton X-100和吐和吐温（温（Tween）等）等;对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合
32、并溶解磷脂，破坏内对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。第四十七页，本课件共有59页48II 化学渗透法化学渗透法(4)EDTA螯合剂螯合剂处理处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-细细菌菌的的壁壁外外层层结结构构通通常常靠靠二二价价阳阳离离子子Ca2+或或Mg2+结结合合脂脂多多糖糖和和蛋蛋白白质质来来维维持持，一一旦旦EDTA将将Ca2+或或Mg2+螯螯合合，大大量量的的脂脂多多糖糖分分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。第四
33、十八页，本课件共有59页49II 化学渗透法化学渗透法 Chemical permeation优点：优点：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。步提取。缺点：缺点：通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过率不超过50%；有些化学试剂有毒；有些化学
34、试剂有毒；化学试剂的加入常化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度并影响最终产物纯度。第四十九页，本课件共有59页50III 物理法物理法渗透压冲击法渗透压冲击法 冻融法冻融法干燥法干燥法第五十页，本课件共有59页51渗透压冲击法渗透压冲击法Osmotic pressure渗透压冲击是较温和的一种破碎方法渗透压冲击是较温和的一种破碎方法将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的
35、突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。胀，甚至破裂。仅仅适适用用于于细细胞胞壁壁较较脆脆弱弱的的细细胞胞或或细细胞胞壁壁预预先先用用酶酶处处理理或或在在培培养养过过程程中中加加入入某某些些抑抑制制剂剂（如如抗抗生生素素等等），使使细胞壁有缺陷，强度减弱。细胞壁有缺陷，强度减弱。第五十一页，本课件共有59页52冻融法冻融法将将细细胞胞放放在在低低温温下下突突然然冷冷冻冻(约约-15)，而而在在室室温温下下缓缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。慢融化，反复多次而达到破壁作用。由由于于冷冷冻冻，一一方方面面使使细细胞胞膜膜的的疏疏水水键键
36、结结构构破破裂裂，另另一一方方面面胞胞内内水水结结晶晶，使使细细胞胞内内外外溶溶液液浓浓度度变变化化，引引起细胞膨胀而破裂。起细胞膨胀而破裂。适适用用于于细细胞胞壁壁较较脆脆弱弱的的菌菌体体，破破碎碎率率较较低低，需需反反复复多多次次，此此外外，在在冻冻融融过过程程中中可可能能引引起起某某些些蛋蛋白白质质变变性。性。第五十二页，本课件共有59页53干燥法干燥法将将细细胞胞用用不不同同的的方方法法干干燥燥，细细胞胞膜膜渗渗透透性性发发生生变变化化而而破破裂裂，然然后后用用丙丙酮酮、丁丁醇醇或或缓缓冲冲液液等等溶溶剂剂抽抽提提胞胞内物质。内物质。干干燥燥方方法法：空空气气干干燥燥、真真空空干干燥燥
37、、喷喷雾雾干干燥燥、冷冷冻冻干干燥等燥等气气流流干干燥燥主主要要适适用用于于酵酵母母菌菌，一一般般在在25-30的的气气流流中中吹吹干干；真真空空干干燥燥多多用用于于细细菌菌；冷冷冻冻干干燥燥适适用用于于不不稳稳定定的的生生化物质。化物质。第五十三页，本课件共有59页54细胞破碎方法的比较细胞破碎方法的比较分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可可达达较较高高破破碎碎率率，可可较较大大规规模模操操作作，大大分分子目的产物易失活，浆液分离困难子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法高压匀浆法液体剪切作用液体剪切作用可可达达较较高高破破碎碎
38、率率，可可大大规规模模操操作作，不不适适合合丝状菌和革兰氏阳性菌丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对对酵酵母母菌菌效效果果较较差差，破破碎碎过过程程升升温温剧剧烈烈，不适合大规模操作不适合大规模操作X-press法法固体剪切作用固体剪切作用破破碎碎率率高高，活活性性保保留留率率高高，对对冷冷冻冻敏敏感感目目的产物不适合的产物不适合非非机机械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具具有有高高度度专专一一性性，条条件件温温和和，浆浆液液易易分分离离，溶酶价格高，通用性差溶酶价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改变细胞膜的渗透性改变细胞膜的渗透性具具一一定定选选择择性性
39、，浆浆液液易易分分离离，但但释释放放率率较较低，通用性差低，通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法冻结融化法反复冻结反复冻结-融化融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法干燥法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活条件变化剧烈，易引起大分子物质失活第五十四页，本课件共有59页55破碎方法选择准则破碎方法选择准则1)细胞的处理量细胞的处理量2)细胞壁的强度和结构细胞壁的强度和结构3)目标产物对破碎条件的敏感性目标产物对破碎条件的敏感性4)破
40、碎程度破碎程度第五十五页，本课件共有59页56破碎技术的未来发展方向破碎技术的未来发展方向多种破碎方法相结合；多种破碎方法相结合；与下游过程相结合；与下游过程相结合；与上游过程相结合；与上游过程相结合；化学法、酶法、机械法相结合。化学法、酶法、机械法相结合。如如用用溶溶解解酶酶预预处处理理面面包包酵酵母母，然然后后高高压压匀匀浆浆，95MPa压压力力下下匀匀浆浆4次次，总总破破碎碎率率接接近近100%。而而单单独独采采用用高高压压匀匀浆浆法法，同同样条件下破碎率只有样条件下破碎率只有32%。v在在发发酵酵培培养养过过程程中中，培培养养基基、生生长长期期、操操作作参参数数(如如pH、温温度度、通
41、通气气量量、搅搅拌拌转转速速、稀稀释释率率等等)等等因因素素都都对对细细胞胞壁壁膜膜的的结结构构与与组组成成有有一一定定的的影影响响。细胞的破碎与上游培养过程有关。细胞的破碎与上游培养过程有关。v用用基基因因工工程程的的方方法法对对菌菌种种进进行行改改造造，以以提提高高胞胞内内物物质质的的提提取取率率也也是非常重要的。是非常重要的。v在在生生长长后后期期，加加入入某某些些能能抑抑制制或或阻阻止止细细胞胞壁壁物物质质合合成成的的抑抑制制剂剂(如如青青霉霉素素、环环丝丝氨氨酸酸等等)，继继续续培培养养一一段段时时间间后后，新新分分裂裂的的细细胞胞其其细细胞胞壁壁有缺陷，利于破碎；有缺陷，利于破碎；
42、v选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；v在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件(如温度等如温度等)，激，激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。细胞破碎与固液分离紧密相关细胞破碎与固液分离紧密相关。第五十六页，本课件共有59页573.4 基因工程包含体的纯化方法基因工程包含体的纯化方法 包包含含体体：一一种种蛋蛋白白质质的的聚聚集集体体，其其中中大大部部分分是是克克隆隆表表达达的的目目标标产产物物蛋蛋白白，其其次次还
43、还有有大大肠肠杆杆菌菌的的菌菌体体蛋蛋白白和和质质粒粒编编码码蛋白等。蛋白等。步骤：步骤：收收集集菌菌体体细细胞胞细细胞胞破破碎碎包包含含体体的的洗洗涤涤目目标标蛋蛋白白的的变变性性溶溶解解目标蛋白的复性目标蛋白的复性第五十七页，本课件共有59页58作业作业1、细胞破碎主要有哪几种方法？、细胞破碎主要有哪几种方法？2、机机械械法法细细胞胞破破碎碎方方法法与与非非机机械械破破碎碎方方法法相比有何特点？相比有何特点？3、珠珠磨磨法法破破碎碎大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞，破破碎碎速速率率常常数数k=0.048 min-1。若若采采用用间间歇歇破破碎碎操操作作，试计算破碎率达到试计算破碎率达到90%所需的时间。所需的时间。第五十八页，本课件共有59页感感谢谢大大家家观观看看第五十九页，本课件共有59页