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1、关于血清球蛋白的分离纯化与鉴定第一页，本课件共有27页一、目的和要求一、目的和要求n学习学习盐析法盐析法分离血清蛋白的原理和技术分离血清蛋白的原理和技术n掌握凝胶过滤掌握凝胶过滤层析法层析法脱盐的基本操作技术脱盐的基本操作技术n掌握用醋酸纤维膜掌握用醋酸纤维膜电泳法电泳法分离血清蛋白的原理分离血清蛋白的原理及方法及方法 第二页，本课件共有27页二、原理二、原理（一）盐析（一）盐析 1.概念和原理概念和原理n盐析是指溶液中加入盐析是指溶液中加入无机盐无机盐类而使某种物质溶解度降低而类而使某种物质溶解度降低而析出析出的过的过程。程。n蛋白质在纯水中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，蛋白质在
2、纯水中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为这种现象称为“盐溶盐溶”(salt in)。n而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为出，这种现象称为“盐析盐析”(salt out)。第三页，本课件共有27页“盐析盐析”破坏了蛋白质作为亲水胶体的两个稳定因素破坏了蛋白质作为亲水胶体的两个稳定因素n但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水化膜足够的水维
3、持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水化膜 n另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互排斥的电荷相互聚集沉淀出来另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互排斥的电荷相互聚集沉淀出来表面电荷表面电荷水化膜水化膜第四页，本课件共有27页2.常用中性盐：常用中性盐：n盐析可用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等盐析可用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐，其中运用最广的是中性盐，其中运用最广的是硫酸铵硫酸铵。n硫酸铵硫酸铵的优点的优点 1.1.在水中化学性质稳定，在水中化学性质稳定，2.2.溶解度大，溶解度大，3.3.溶解度的温度系数变化较小，溶解度的温度系数变化较小，4.4.硫酸铵价廉易得，分离效果好
4、，硫酸铵价廉易得，分离效果好，5.5.性质温和，高浓度时也不会影响蛋白质的生物学活性。性质温和，高浓度时也不会影响蛋白质的生物学活性。第五页，本课件共有27页3.盐浓度计算盐浓度计算 n各种各种蛋白质蛋白质“盐析盐析”出来所需的盐浓度出来所需的盐浓度各异各异，所需的最小盐量称做盐析浓度。所需的最小盐量称做盐析浓度。A，G AG 半饱和半饱和(NH4)2SO4饱和饱和(NH4)2SO4A 血清中清蛋白和球蛋白的分离血清中清蛋白和球蛋白的分离n按体积：按体积：1 2（50%）；1 4（25%）第六页，本课件共有27页(1)饱和硫酸铵溶液法饱和硫酸铵溶液法 将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为将饱和硫酸铵溶
5、液的饱和度定为100%或或1按体积：按体积：1 2（50%）；1 4（25%）(2)固体硫酸铵法固体硫酸铵法 可采用直接加入固体硫酸铵的方法。可采用直接加入固体硫酸铵的方法。n硫酸铵硫酸铵饱和度的计算饱和度的计算第七页，本课件共有27页n离心力离心力(F)等于被离心的物体等于被离心的物体质量质量与与向心加速度向心加速度的乘的乘积积 向心加速度向心加速度=42V2r （其中（其中V为每秒的转数，为每秒的转数，r为离心半径，单位为离心半径，单位cm）F=m 42V2rn相对向心加速度相对向心加速度=42V2r g 多少个多少个g（二）离心（二）离心(centrifugation)-分离分离1.离心
6、力离心力第八页，本课件共有27页2.离心机分类离心机分类 根据离心机的转数分类可以分为三类根据离心机的转数分类可以分为三类 5000rpm 普通离心机普通离心机 5,000-25,000rpm 高速离心机高速离心机 25,000-10,000rpm 超速离心机超速离心机n因离心时与空气摩擦产热很多，所以高速离心机有因离心时与空气摩擦产热很多，所以高速离心机有制冷装置制冷装置n超速离心机不但有超速离心机不但有制冷装置制冷装置，而且离心室，而且离心室密封真空密封真空第九页，本课件共有27页3.离心机的使用离心机的使用 0.1g 50g2000rpm r=12cm配平配平 在对称位置重量一致在对称位
7、置重量一致Balanced loading patterns for a 12-positon centrifuge rotor第十页，本课件共有27页三、操作三、操作2ml血清血清+2ml PBS逐滴加入逐滴加入饱和饱和(NH4)2SO4 2ml 2 6ml 33%弃上清，弃上清，2ml PBS+1ml 饱和饱和(NH4)2SO4 1 3ml 33%弃上清，弃上清，1ml PBS+0.5ml 饱和饱和(NH4)2SO4 0.5 1.5ml 33%弃上清，弃上清，洗涤洗涤0.5ml PBS 溶解溶解摇匀摇匀 混匀静置混匀静置30min，离心，离心3000rpm 10min 混匀静置混匀静置30
8、min，离心，离心3000rpm 10min 混匀静置混匀静置30min，离心，离心3000rpm 10min第十一页，本课件共有27页n层析利用物质在固定相（层析利用物质在固定相（stationary phase）与流动相）与流动相（mobile phase）之间不同的分配比例，达到分离待测物）之间不同的分配比例，达到分离待测物质的技术。质的技术。(三三)层析层析(chromatography)-纯化纯化凝胶过滤层析法（凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography）离子交换层析法（离子交换层析法（ion exchange chromatography）亲和层析法
9、（亲和层析法（affinity chromatography）第十二页，本课件共有27页凝胶过滤层析法（凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography）第十三页，本课件共有27页葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（Sephadex）第十四页，本课件共有27页离子交换层析法（离子交换层析法（ion exchange chromatography）第十五页，本课件共有27页亲和层析法亲和层析法（affinity chromatography）第十六页，本课件共有27页n脱盐常用脱盐常用透析法透析法和和凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法n前者的优点是透析后样品终体积较小，但所需时间较长，且
10、盐前者的优点是透析后样品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽不易除尽n凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也明显缩短，但其凝胶过滤凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也明显缩短，但其凝胶过滤后样品体积较大。后样品体积较大。n本实验中样品体积较小，凝胶过滤后样品体积不会太增加，本实验中样品体积较小，凝胶过滤后样品体积不会太增加，所以选用所以选用凝胶过滤法凝胶过滤法。第十七页，本课件共有27页透析透析(dialysis)第十八页，本课件共有27页凝胶过滤层析法（凝胶过滤层析法（gel filtration chromatographygel filtration chromatography）第十九页
11、，本课件共有27页按按流流出出的的时时间间收收集集不不同同组组分分第二十页，本课件共有27页结果结果12345678910proteinNH4+11121314151617181920proteinNH4+-+-+-+-第二十一页，本课件共有27页(四四)电泳电泳(electrophoresis)-鉴定鉴定n带电粒子带电粒子在电场中移动的现象称为电泳在电场中移动的现象称为电泳n血清蛋白包括多种蛋白质，它们的等电点大都在血清蛋白包括多种蛋白质，它们的等电点大都在pH7.0以下，以下，清蛋白清蛋白的等电点为的等电点为4.6，球蛋白球蛋白为为5-7n在在PH高于它们等电点的缓冲液均带高于它们等电点的
12、缓冲液均带负电荷负电荷，在电场中，在电场中向向正极正极移动移动n由于各种蛋白质所带由于各种蛋白质所带电荷的数量电荷的数量和和分子的大小分子的大小有差有差别，在电场中泳动的别，在电场中泳动的速度速度也不同也不同第二十二页，本课件共有27页n血清中血清中清蛋白清蛋白电荷数量较多，分子量小，泳动最快。电荷数量较多，分子量小，泳动最快。n球蛋白球蛋白则相反，泳动最慢，适当的时间电泳后，不则相反，泳动最慢，适当的时间电泳后，不同的蛋白泳动到不同的位置。同的蛋白泳动到不同的位置。Albumin 1 2 +-血清血清样品样品电泳法可以将血清蛋白质分成多条区带电泳法可以将血清蛋白质分成多条区带 第二十三页，本
13、课件共有27页原理原理 1.蛋白的分离蛋白的分离2.纯化纯化3.鉴定鉴定 利用醋酸纤维薄膜为支持物可将血清蛋白分开，经染色可显示五条区带，从正极端起，依次为清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白。第二十四页，本课件共有27页操作方法操作方法一、仪器和薄膜的准备一、仪器和薄膜的准备1将醋酸纤维薄膜浸泡于将醋酸纤维薄膜浸泡于TEB缓冲液中，一小时缓冲液中，一小时以上备用。以上备用。2在电泳槽内加在电泳槽内加TEB缓冲液每槽缓冲液每槽100ml（视槽的（视槽的大小而定）。放置好滤纸桥。大小而定）。放置好滤纸桥。第二十五页，本课件共有27页点样线点样线2cm5cm样品样品血清血清二、点样二、点样 1.夹取一张薄膜，平铺于滤纸上，吸去其上多余的缓冲液。夹取一张薄膜，平铺于滤纸上，吸去其上多余的缓冲液。2.用加样器蘸取准备好的用加样器蘸取准备好的血清血清，点在薄膜予定的，点在薄膜予定的点样线点样线上。上。第二十六页，本课件共有27页感谢大家观看第二十七页，本课件共有27页