支原体衣原体立克次体.ppt

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1、 第十八章支原体、衣原体、立克次体 第一节支原体n是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形性，能通过除菌滤器，在无生命培养基性，能通过除菌滤器，在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。由于它们能形成有分支的长丝，故称之由于它们能形成有分支的长丝，故称之为支原体。为支原体。支原体科分支原体属和脲原体属两个属。对支原体科分支原体属和脲原体属两个属。对人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体。生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体。除此之外，支原体还经常污染

2、细胞培养，给除此之外，支原体还经常污染细胞培养，给实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带来一定困难。来一定困难。一、肺炎支原体一、肺炎支原体n感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系统感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系统,借借滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，主要滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，主要粘附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白，称粘附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白，称Pl蛋白。蛋白。n是青少年急性呼吸道感染的主要病原体，表是青少年急性呼吸道感染的主要病原体，表现为上呼吸道感染综合征，占非细菌性肺炎现为上呼吸道感染综合征，占非细菌性肺炎的的1 13 3以上。过

3、去认为是温和的病原体，现以上。过去认为是温和的病原体，现在认为它也可引起严重的双侧肺炎和其他系在认为它也可引起严重的双侧肺炎和其他系统的肺外并发症，如心肌炎、心包炎、免疫统的肺外并发症，如心肌炎、心包炎、免疫性溶血性贫血、肾炎等。性溶血性贫血、肾炎等。微生物特性微生物特性1形形态态与与结结构构 类类似似酒酒瓶瓶状状，没没有有细细胞胞壁壁，仅仅有有细细胞胞膜膜。G-易易着着色色，Giemsa染染色色呈呈淡淡紫紫色色。细细胞胞膜膜中中胆胆固固醇醇含含量量多多。所所有有肺肺炎炎2株株共共同同具具有有P1蛋蛋白白，是是主主要要特特异异性性免免疫疫原原和血清学诊断的主要抗原。和血清学诊断的主要抗原。2.

4、抗原结构抗原结构 来自细胞膜，胞膜外层蛋白质是主要抗原，来自细胞膜，胞膜外层蛋白质是主要抗原，常用生长抑制试验常用生长抑制试验(GIT)与代谢抑制试验与代谢抑制试验 (MIT)鉴定。鉴定。GIT是将吸有型特异性抗血清是将吸有型特异性抗血清 的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上，的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上，经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长现经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长现 象。象。MIT是将支原体接种在含有抗血清培养是将支原体接种在含有抗血清培养 基中，若抗体与支原体型一致，则抑制该支基中，若抗体与支原体型一致，则抑制该支 原体不能分解葡萄糖产酸。此两种方法可将原体不能分

5、解葡萄糖产酸。此两种方法可将 支原体分成若干血清型。支原体分成若干血清型。3 3培养特性培养特性 以二分裂繁殖，繁殖较慢；生以二分裂繁殖，繁殖较慢；生 长需要胆固醇；反复传代后呈长需要胆固醇；反复传代后呈“荷包蛋荷包蛋”状菌落，可迅速溶解哺乳动物红细胞。状菌落，可迅速溶解哺乳动物红细胞。4 4生化反应生化反应 肺炎支原体可根据是否能利用肺炎支原体可根据是否能利用 葡萄糖、水解精氨酸和尿素来与其他支原葡萄糖、水解精氨酸和尿素来与其他支原 体进行鉴别。体进行鉴别。5.5.抵抗力抵抗力1.1.对热的抵抗力一般与细菌相似。耐冷，对热的抵抗力一般与细菌相似。耐冷，-70 -70或液氮可长期冻存或液氮可长

6、期冻存,4,4放置也不放置也不 要超过要超过3 3天。天。2.2.支原体对干燥敏感，干燥的标本难以分支原体对干燥敏感，干燥的标本难以分离出支原体。没有细胞壁青霉素不敏感。离出支原体。没有细胞壁青霉素不敏感。检验程序检验程序1.标本采集标本采集 肺炎支原体有粘附细胞作用，以肺炎支原体有粘附细胞作用，以 咽拭子标本为好，取材后宜立即接种。咽拭子标本为好，取材后宜立即接种。2.PCR法快速、敏感和特异，目前某些临床实法快速、敏感和特异，目前某些临床实 验室以特异性引物通过这一技术从患者痰中验室以特异性引物通过这一技术从患者痰中 检测肺炎支原体检测肺炎支原体DNA。3.电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌

7、鉴别。电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别。4.分离培养分离培养n以牛心消化液为基础以牛心消化液为基础,加加2020小牛血清及新小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。加入鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。加入青霉素青霉素,可防止杂菌生长。初次分离生长缓可防止杂菌生长。初次分离生长缓慢，在含慢，在含5 5C02C02下培养，下培养，1010天长出油煎蛋状天长出油煎蛋状菌落。能发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸菌落。能发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸与尿素，可还原美蓝。分离培养阳性率不高，与尿素，可还原美蓝。分离培养阳性率不高，对临床诊断意义不大对临床诊断意义不大,但对流行病学调查有但对流行病学

8、调查有重要意义重要意义 。5抗体检测抗体检测(1)ELISA：此此法法敏敏感感，特特异异性性高高，快快速速、经经济济，并并可可检检测测IgM和和IgG抗抗体体，为为目目前前诊诊断断的的可可靠靠方方法法。检检测测分分子子量量190kDa的的P1蛋蛋白白，3h可可完完成成试试验验，特特异异性性高高，敏敏感性为感性为10 4CFUl标本。标本。(2)(2)补体结合补体结合(CF)CF)试验试验n试验所用的抗原为氯仿试验所用的抗原为氯仿甲醇提取的糖甲醇提取的糖脂类抗原。脂类抗原。n双份血清试验，效价呈双份血清试验，效价呈4 4倍增长者，或单倍增长者，或单份血清效价份血清效价l l：128128者，者，

9、8080的病例表的病例表明近期有肺炎支原体感染。明近期有肺炎支原体感染。(3)(3)间接血凝试验间接血凝试验n操操作作简简便便，敏敏感感度度略略高高于于补补体体结结合合试试验验，感感染染发发病病后后7 7天天出出阳阳性性，10-3010-30天天达达高高峰峰，12-2612-26周逐渐降低。周逐渐降低。n本试验与补体结合试验类似，主要测本试验与补体结合试验类似，主要测lgMlgM 抗体，与生殖道支原体之间存在交叉反抗体，与生殖道支原体之间存在交叉反 应。应。(4)(4)冷凝集试验冷凝集试验 是一种非特异性试验。其方法是将患者血是一种非特异性试验。其方法是将患者血清与清与O型型Rh阴性红细胞在阴

10、性红细胞在4 下作凝集试下作凝集试验。有验。有3376肺炎支原体感染者为阳肺炎支原体感染者为阳性性(效价效价1：64)。效价越高或双份血清呈。效价越高或双份血清呈4倍以上升高，肺炎支原体近期感染的可能倍以上升高，肺炎支原体近期感染的可能性越大。性越大。二、解脲脲原体二、解脲脲原体n也也称称溶溶脲脲脲脲原原体体，是是1954年年Shepard首首先先从从非非淋淋菌菌性性尿尿道道炎炎(NGU)患患者者的的尿尿道道分分泌泌物物中中分分离离获获得得，因因其其分分解解尿尿素素的的特特性性命命名名为为解解脲脲脲脲原原体体。在在分分类类学学上上属属人人支支原原体体科科脲脲原原体体属属。是是人人类类泌泌尿尿生

11、生殖殖道道最最常常见见的的寄寄生生菌菌之之一一，近近年年来来研研究究发发现现，它它与与多多种种疾疾病病有有关关，故故引引起起国国内内外外有有关关学学者的广泛重视。者的广泛重视。1.寄寄居居泌泌尿尿生生殖殖道道，传传播播途途径径为为性性接接触触和和母母婴婴传传播播。致致病病机机制制与与侵侵袭袭性性酶酶有有关关。吸吸附附后后产产生生磷磷脂脂酶酶分分解解胞胞膜膜中中的的磷磷脂脂，脲脲酶酶分分解解尿尿素素产产氨氨，影影响响宿宿主主细细胞胞生生物物合合成成。产产生生IgA蛋蛋白白酶酶，破破坏坏IgA的的局局部部抗抗感感染染作作用用，有利于粘附和致病。有利于粘附和致病。2.引引起起非非淋淋菌菌性性尿尿道道

12、炎炎(NGU)，上上行行感感染染，可可引引起起前前列列腺腺炎炎或或附附睾睾炎炎；阴阴道道炎炎和和宫宫颈颈炎炎，并并可可导导致致流流产产。因因为为与与人人精精子子膜膜有有共共同同抗抗原，对精子可造成免疫损伤而致不育。原，对精子可造成免疫损伤而致不育。微生物特性微生物特性1形形态态结结构构 在在液液体体培培养养基基中中以以球球形形为为主主，直直径径约约50-300nm，单单个个或或呈呈双双排排列列，能能通通过过微微孔孔滤滤膜膜；G-但但不不易易着着色色，姬姬姆姆萨萨染染色色呈呈紫紫蓝蓝色色。无无细细胞胞壁壁，细细胞胞膜膜由由三三层层膜膜构构成成。内内、外外两两层层由由蛋蛋白白质质组组成成，中中层层

13、为为类类脂脂质质，胞胞内内含含核核糖糖体体和和双双股股DNA。DNA中中十十C含量为含量为269298mol。2 2培养特性培养特性n营营养养要要求求较较高高，需需要要供供给给胆胆固固醇醇和和酵酵母母，常常用用的的基基础础培培养养基基为为牛牛心心消消化化液液。37生生长长良良好好，22生生长长差差，42不不生生长长，最最适适pH为为55-65。在在含含95N2和和5C02气气体体环环境境下下培培养养2天天形形成成很很小小菌菌落落，呈呈“荷荷包包蛋蛋”样样，放放大大200倍倍才才能能观观察察到到，故故称称T株株。生生长长除除胆胆固固醇醇外外，尚尚需需尿尿素素，有有脲脲酶酶能能水水解解尿尿素素产产

14、氨氨，不分解葡萄糖和精氨酸。不分解葡萄糖和精氨酸。3.3.抗原构造抗原构造n有脂多糖、脲酶和蛋白质抗原，有有脂多糖、脲酶和蛋白质抗原，有16个血清个血清型划分为型划分为A、B两大群，其中以两大群，其中以4型引起疾病型引起疾病频率高。频率高。A群各型均含有群各型均含有16kD和和17kD多肽；多肽；B群各型仅含群各型仅含17kD多肽；而多肽；而13血清型只含有血清型只含有16kD多肽，以能识别多肽，以能识别16kD和和17kD多肽的单多肽的单抗，为区别血清群特异性标志。抗，为区别血清群特异性标志。4 4抵抗力抵抗力n由于无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易由于无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易被脂类溶

15、媒、清洁剂、酒精、特异性抗体被脂类溶媒、清洁剂、酒精、特异性抗体和补体溶解。对热抵抗力差。在和补体溶解。对热抵抗力差。在4存活约存活约2周左右，周左右，70中可存活中可存活 2-3年。年。n对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对影响胞浆蛋白合成的抗生素敏感：对强对影响胞浆蛋白合成的抗生素敏感：对强力霉素、红霉素、交沙霉素、白霉素、螺力霉素、红霉素、交沙霉素、白霉素、螺旋霉素、氯霉素、麦迪霉素、链霉素、丁旋霉素、氯霉素、麦迪霉素、链霉素、丁胺卡那霉素等敏感。胺卡那霉素等敏感。微生物检验微生物检验 1标本采集标本采集 用用无无菌菌瓶瓶收收集集诊诊断断为为非非

16、淋淋菌菌性性尿尿道道炎炎患患者者中中段段尿尿，慢慢性性前前列列腺腺炎炎按按摩摩后后的的前前列列腺腺液液，原原因因不不明明的的不不育育症症患患者者的的精精液液，阴阴道道炎炎与与宫宫颈颈炎炎患患者者的的炎炎性性分分泌泌物物，羊羊水水和和血血液液等等。尿尿标标本以无菌方法取本以无菌方法取10ml，离心沉渣作接种物。离心沉渣作接种物。2 2标本直接检查标本直接检查(1)核酸检测核酸检测n16个个血血清清型型均均有有460bp的的DNA片片段段。通通过过对对PCR产产物物的的核核酸酸杂杂交交和和序序列列分分析析，可可将将各各种种支支原原体体鉴鉴别别分分类类。鉴鉴于于本本法法敏敏感感性性高高、稳稳定定可可

17、靠靠、快快速速简简便便，将将成成为为临临床床快快速速诊诊断的重要实验手段。断的重要实验手段。nDNA探探针针技技术术法法敏敏感感，可可测测出出50100pg的的DNA。(2)ELISA 可可测测定定血血清清型型别别，还还可可测测出出Ig的的类类型型(IgM、IgG)，较较敏敏感感、特特异异性性强强，有有诊诊断意义。断意义。(3)免疫斑点试验免疫斑点试验(IDT)检检测测抗抗原原提提取取物物和和培培养养物物。此此法法敏敏感感，特特异异性性，不不需需特特殊殊仪仪器器，易易于于推推广广，可可作作为为临临床床感感染染者者病病原原检检查查的的特特异异诊诊断断方方法。法。3 3分离与鉴定分离与鉴定n取标本

18、取标本O102ml接种于接种于pH60含有酚红含有酚红和尿素的液体培养和尿素的液体培养37孵育，颜色由黄变红孵育，颜色由黄变红者为阳性。阳性者转种于固体培养基上，琼者为阳性。阳性者转种于固体培养基上，琼脂培养基中有尿素、脂培养基中有尿素、005molHEPES缓冲液缓冲液和和MgS04，菌落呈黑褐色易辨认菌落呈黑褐色易辨认，95N25C02或微厌氧环境中作次代培养，以低倍或微厌氧环境中作次代培养，以低倍镜观察菌落形态。镜观察菌落形态。n经形态和生化反应等检测可作出初步鉴定。经形态和生化反应等检测可作出初步鉴定。只分解尿素，不分解葡萄糖和精氨酸。用只分解尿素，不分解葡萄糖和精氨酸。用特异抗血清作

19、特异抗血清作MIT和和GIT作进一步鉴定。作进一步鉴定。三、穿通支原体三、穿通支原体 n能能粘粘附附、穿穿入入淋淋巴巴细细胞胞和和单单核核吞吞噬噬细细胞胞中中大大量量复复制制，导导致致宿宿主主细细胞胞受受损损和和死死亡亡。能能促促进进HIVHIV的的复复制制和和病病程程的的发发展展，是是艾艾滋滋病病的辅助致病因素。的辅助致病因素。n为为杆杆状状，一一端端为为尖尖形形结结构构。营营养养要要求求高高，菌菌落落呈呈荷荷包包蛋蛋样样，生生长长较较慢慢，初初代代多多在在1010天天以以上上，发发酵酵葡葡萄萄糖糖，水水解解精精氨氨酸酸，但但不不分分解解尿尿素素，液液体体培培养养基基生生长长时时无无明明显显

20、混混浊浊或沉淀。或沉淀。n对对红红霉霉素素、四四环环素素、林林可可霉霉素素敏敏感感，但但对对青霉素不敏感。青霉素不敏感。微生物检验微生物检验1标本采集标本采集 取材对象是取材对象是AIDS患者或患者或HIV 感染者。用咽拭子。感染者。用咽拭子。2选选SP-4培养基分离培养，培养基分离培养，37温箱培养，温箱培养，每天观察颜色有无变化，若由红变黄透明每天观察颜色有无变化，若由红变黄透明 无沉淀，视无沉淀，视“培养可疑阳性培养可疑阳性”，再用滤膜，再用滤膜过过 滤。滤液转种传代，当培养基颜色再度由滤。滤液转种传代，当培养基颜色再度由 红变黄，则认为红变黄，则认为“初代培养阳性初代培养阳性”。3.3

21、.鉴定鉴定 生化反应生化反应 (1)培养物接种于含培养物接种于含1葡萄糖的葡萄糖的SP-4培养基培养基 (发酵葡萄糖试验发酵葡萄糖试验)，若能分解它，培养基，若能分解它，培养基 颜色由红变黄。颜色由红变黄。(2)培养物接种于含有精氨殿培养物接种于含有精氨殿(不含葡萄糖不含葡萄糖)的的SP-4培养基培养基(水解精氨酸试验水解精氨酸试验)中，若中，若 能水解它，能水解它，pH上升。上升。(3)培养物接种于仅含尿素的培养物接种于仅含尿素的SP-4培养基培养基(分分 解尿素试验解尿素试验)中，观察中，观察 pH变化。变化。代谢抑制试验代谢抑制试验(MIT)n取取104CFUml阳性培养物分别加入阳性培

22、养物分别加入2支含支含3ml改良的改良的SP-4培养基中，其中培养基中，其中1支加入适支加入适量抗量抗Mpe标准血清作为试验管，另标准血清作为试验管，另1支不加支不加抗血清作为对照管，抗血清作为对照管，37培养。培养。n试验管颜色不变试验管颜色不变(生长被抑制生长被抑制)，对照管颜，对照管颜色由红变黄色由红变黄(支原体生长支原体生长)。生长被杭血清。生长被杭血清抑制的管为抑制的管为MIT阳性，该培养物则为阳性，该培养物则为Mpe，根据抗血清的型别进行根据抗血清的型别进行Mpe分型分型。PCR 用用Mpe套套式式PCR(nPCR)，靶靶基基因因为为Mpe的的16SrRNA基基因因特特异异性性片片

23、段段。Mpe-nPCR最最终终扩扩增增长长度度为为410bp，按按试试剂剂盒盒说说明明书书操操作作，能能扩扩增增出出特特异异性性MpeDNA，认认为为此此法法更灵敏、特异、快速的更灵敏、特异、快速的Mpe检测方法。检测方法。抗体检测抗体检测n国国外外学学者者在在HIV感感染染者者中中用用ELISA法法检检测测出出大大量量Mpe抗抗体体，其其中中无无症症状状者者的的阳阳性性率率为为20，有有艾艾滋滋病病者者为为40，阴阴性性对对照照0.3。第二节 衣 原 体 n是一类专性细胞内寄生、有独特发育周是一类专性细胞内寄生、有独特发育周期、能通过细菌滤器的原核细胞型微生期、能通过细菌滤器的原核细胞型微生

24、物。归属于广义的细菌范畴。物。归属于广义的细菌范畴。n衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种。鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种。一、沙眼衣原体一、沙眼衣原体n不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病。统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病。n近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医学界的重视。学界的重视。n沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽沙眼衣

25、原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽肿生物变种（肿生物变种（LGV）和鼠生物变种等和鼠生物变种等3个生个生物变种。物变种。1沙眼亚种沙眼亚种(1)沙眼：沙眼：通过眼通过眼-手手-眼途径直接或间接密切接触传眼途径直接或间接密切接触传 播。由播。由A、B、Ba和和C血清型引起。结膜引血清型引起。结膜引 起局部炎症。有滤泡增生。后期出现瘢痕起局部炎症。有滤泡增生。后期出现瘢痕 及角膜血管翳，影响视力。及角膜血管翳，影响视力。(2)(2)包涵体结膜炎：包涵体结膜炎：由由B B、BaBa、D D、DaDa等血清型引起。婴儿通过等血清型引起。婴儿通过 产道感染，引起滤泡性结膜炎，不出现角产道感染，引起滤泡性结

26、膜炎，不出现角 膜血管翳。膜血管翳。(3)(3)泌尿生殖道感染：泌尿生殖道感染：由由D-KD-K血清型引起。在性接触传播引起的血清型引起。在性接触传播引起的 非淋菌性泌尿生殖道感染（非淋菌性泌尿生殖道感染（50506060）。）。易发展为持续感染或无症状携带者。易发展为持续感染或无症状携带者。2.2.性病淋巴肉芽肿亚种，由性病淋巴肉芽肿亚种，由L L血清型引起血清型引起性病淋巴肉芽肿。侵犯腹股沟淋巴结，性病淋巴肉芽肿。侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。3.3.鼠生物变种为鼠间传播，不侵犯人，与鼠生物变种为鼠间传播，不侵犯人，与鼠肺炎有关。

27、鼠肺炎有关。微生物特性微生物特性1发育周期与形态染色发育周期与形态染色 衣原体具有特殊的发衣原体具有特殊的发育周期。育周期。原体是细胞外存在形式，卵圆形，原体是细胞外存在形式，卵圆形，有胞壁和拟核有胞壁和拟核,是发育成熟的衣原体，具有高是发育成熟的衣原体，具有高度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增大形成网状体；大形成网状体；网状体或称始体，圆形，网状体或称始体，圆形，二分裂增殖为繁殖型，无感染性。于感染二分裂增殖为繁殖型，无感染性。于感染24h后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，再感染其他细胞，每个发育周期约需再感

28、染其他细胞，每个发育周期约需4872h。抗原结构抗原结构复杂，有属、种、型等特异性抗原。复杂，有属、种、型等特异性抗原。(1)属特异性抗原：为胞壁属特异性抗原：为胞壁LPS，属特异性补属特异性补 体结合抗原，应用于血清学诊断。体结合抗原，应用于血清学诊断。(2)种特异性抗原：位于主要外膜蛋白种特异性抗原：位于主要外膜蛋白 （MOMP）上，可用补体结合试验和中和上，可用补体结合试验和中和 试验检测。试验检测。(3)型特异性抗原：也位于型特异性抗原：也位于MOMP上，用单上，用单 克隆抗体作微量免疫荧光试验能识别沙眼克隆抗体作微量免疫荧光试验能识别沙眼 体的体的18个型别。个型别。培养特性培养特性

29、n沙眼衣原体专性活细胞内寄生，用沙眼衣原体专性活细胞内寄生，用68d龄龄鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养。一般培鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养。一般培养养4872h后可在细胞内查到包涵体及原体后可在细胞内查到包涵体及原体和始体颗粒。和始体颗粒。n近近年年多多采采用用细细胞胞培培养养衣衣原原体体，常常用用的的细细胞胞株为株为Hela-299和和McCoy。抵抗力抵抗力n沙眼衣原体感染材料在沙眼衣原体感染材料在37条件下，经条件下，经48h左右即失去活力，左右即失去活力，566 min灭活。灭活。-70可保存数年，冷冻干燥可保存可保存数年，冷冻干燥可保存30年以上仍年以上仍有活性。有活性。O.1甲醛或甲

30、醛或O.5石炭酸溶液石炭酸溶液24h杀死沙眼衣原体，杀死沙眼衣原体，2来苏仅需来苏仅需5min。n红霉素、四环素、强力霉素或青霉素对衣红霉素、四环素、强力霉素或青霉素对衣原体有抑制作用。原体有抑制作用。沙沙眼眼和和包包涵涵体体结结膜膜炎炎病病人人，用用拭拭子子在在结结膜膜上上穹穹窿窿涂涂擦擦或或取取结结膜膜刮刮片片。性性病病淋淋巴巴肉肉芽芽肿肿：采采淋淋巴巴结结脓脓汁汁，也也可可取取直直肠肠拭拭子子或或活活检检材材料料送检。送检。用用光光学学显显微微镜镜观观察察包包涵涵体体有有诊诊断断意意义义，特特别别在在眼眼结结膜膜、尿尿道道及及子子宫宫颈颈上上皮皮细细胞胞内内发发现现典型包涵体更有沙眼衣原

31、体感染的参考。典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考。免疫学方法免疫学方法1)免免疫疫荧荧光光检检查查：用用荧荧光光抗抗体体检检测测上上皮皮细细胞胞内内衣衣原原体体抗抗原原。标标记记抗抗衣衣原原体体LPS抗抗体体，可可与与所所有有衣衣原原体体反反应应；而而抗抗MOMP抗抗体体有有种种、型型特特异异性性。可可在在1h内内即即作作出出诊诊断断并并可可分型。分型。2)酶免疫检测：能在数小时内检测出衣原体酶免疫检测：能在数小时内检测出衣原体可溶性抗原，并适用于同时检测大量标本。可溶性抗原，并适用于同时检测大量标本。核酸检测核酸检测1)核核酸酸杂杂交交：用用125I标标记记的的衣衣原原体体rDNA探探针针检

32、检测测宫宫颈颈标标本本的的敏敏感感性性和和特特异异性性，与与培培养养相相比比分别为分别为82.8和和99.4。2)PCR：具有高度敏感性和特异性。一般按沙具有高度敏感性和特异性。一般按沙眼衣原体眼衣原体75kb质粒、质粒、MOMP序列及序列及16SrRNA基因序列设计引物。基因序列设计引物。分离培养分离培养n将将标标本本拭拭子子，用用含含抗抗生生素素的的稀稀释释液液制制成成10-20悬悬液液。分分离离的的细细胞胞有有McCoy、HeLa-229细胞等。置细胞等。置5CO2下培养。下培养。n初初代代分分离离培培养养72-96h后后传传代代或或盲盲传传。有有症症状状病病人人90标标本本第第1代代即

33、即可可见见包包涵涵体体，而而无无症症状病人需传代后才得到阳性。状病人需传代后才得到阳性。n敏敏感感性性为为80-90，特特异异性性100，是是目目前前确确诊诊最最可可靠靠的的方方法法，而而且且是是评评价价实实验验室室诊诊断断法的标准。法的标准。鸡胚培养鸡胚培养n有细菌污染的临床标本加适当的抗生素有细菌污染的临床标本加适当的抗生素(如链霉素、庆大霉素和制霉菌素等如链霉素、庆大霉素和制霉菌素等)肉肉汤，在室温中作用汤，在室温中作用lh后，接种后，接种3-4只孵育只孵育7天的鸡胚卵黄囊，天的鸡胚卵黄囊，35孵育，观察至孵育，观察至13天，收获卵黄囊涂片，作天，收获卵黄囊涂片，作Gimenez染染色，

34、镜检原体。色，镜检原体。鉴定鉴定1.将细胞培养盖片用将细胞培养盖片用Giemsa或碘染色镜检或碘染色镜检胞质内包涵体。胞质内包涵体。Giemsa染色比碘染色敏染色比碘染色敏感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考。感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考。2.可用型特异性荧光血清鉴定其型别。对可用型特异性荧光血清鉴定其型别。对于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧光法鉴定原体或补体结合抗原光法鉴定原体或补体结合抗原。抗体检测抗体检测n目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价值很小。值很小。n原因是不易获得双份血清，而且性传播疾病的高原因是不

35、易获得双份血清，而且性传播疾病的高危人群多有慢性重复感染，原有的抗体水平较高，危人群多有慢性重复感染，原有的抗体水平较高，因而限制了血清学方法的诊断价值。因而限制了血清学方法的诊断价值。n方法有补体结合试验方法有补体结合试验(CF)、微量免疫荧光试验微量免疫荧光试验(MIF)、酶免疫法等。其中酶免疫法等。其中CF敏感性和特异性较敏感性和特异性较差，而差，而MIF敏感性和特异性较高。敏感性和特异性较高。三、鹦鹉热衣原体三、鹦鹉热衣原体n鹦鹦鹉鹉热热衣衣原原体体是是鹦鹦鹉鹉热热的的病病原原体体，主主要要引引起起禽禽畜畜感感染染，也也可可由由动动物物传传染染到到人人，引引起起肺炎和毒血症，亦有引起心

36、内膜炎的报道。肺炎和毒血症，亦有引起心内膜炎的报道。n也也有有衣衣原原体体独独特特的的生生活活周周期期，包包涵涵体体较较致致密密，形形态态不不一一，碘碘染染色色阴阴性性，是是与与沙沙眼眼衣衣原原体体鉴鉴别别要要点点(沙沙眼眼衣衣原原体体含含糖糖原原，碘碘染染色阳性色阳性)。抗原检测抗原检测1)免免疫疫荧荧光光检检查查：以以衣衣原原体体属属、种种或或型型的的单单克克隆隆抗抗体体与与荧荧光光素素结结合合后后中中衣衣原原体体抗抗原原的的存存在在，用用微微量量免免疫疫荧荧光光法法还还可可用用于于衣衣原原体体的分型。的分型。2)酶酶免免疫疫法法(EIA)检检测测：将将衣衣原原体体单单克克隆隆抗抗体体与与

37、酶酶结结合合，用用于于组组织织或或细细胞胞的的染染色色，枪枪测测衣衣原原体体抗抗原原。E1A法法比比免免疫疫荧荧光光法法准准确确性略高，且可避免主观因素的影响。性略高，且可避免主观因素的影响。核酸检测核酸检测1)核核酸酸探探针针检检测测法法：将将衣衣原原体体MOMP基基因因、特特异异LPS表表位位基基因因，及及其其他他决决定定鹦鹦鹉鹉热热衣衣原原体体抗抗原原的的基基因因片片段段做做成成探探针针，对对衣衣原原体体DNA进进行行斑斑点点杂杂交交或或Southern印印迹迹杂杂交交试试验验，可可准准确确灵灵敏敏测测出出鹦鹦鹉鹉热热衣衣原原体体，也也可可用用于于种种内株系的鉴别。内株系的鉴别。2)PC

38、R：检测检测3种衣原体的种衣原体的MOMP基因序列是基因序列是简便、微量、快速、敏感的检测力法。简便、微量、快速、敏感的检测力法。分离培养分离培养(1)鸡鸡胚胚培培养养：鹦鹦鹉鹉热热衣衣原原体体的的分分离离常常用用鸡鸡胚胚卵卵 黄囊接种与传代，可取得满意效果。黄囊接种与传代，可取得满意效果。(2)小小鼠鼠分分离离：选选择择腹腹腔腔接接种种、颅颅内内接接种种和和滴滴鼻鼻 接种进行试验。最具特征性的发现小鼠嗜眠接种进行试验。最具特征性的发现小鼠嗜眠 和麻痹，胀气的十二指肠上覆盖一层薄的粘和麻痹，胀气的十二指肠上覆盖一层薄的粘 性渗出物，全肺叶有实变。性渗出物，全肺叶有实变。(3)细胞培养：细胞培养

39、常用细胞培养：细胞培养常用PL细胞、细胞、BHK细细 胞、胞、Vero细胞等，鹦鹉热衣原体均能生长。细胞等，鹦鹉热衣原体均能生长。但直接用于临床标本的分离培养效果不好，但直接用于临床标本的分离培养效果不好，最好先接种鸡胚卵黄囊，经繁殖后再细胞培最好先接种鸡胚卵黄囊，经繁殖后再细胞培 养容易成功。养容易成功。抗体检测抗体检测方法有补体结合试验方法有补体结合试验(CF)、间接血凝试验间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试和酶联免疫吸附试(ELISA)等。等。补体结合试验：主要用于鹦鹉热和性病淋巴肉补体结合试验：主要用于鹦鹉热和性病淋巴肉芽肿以及肺炎的试验。芽肿以及肺炎的试验。CF抗体效价呈抗体效价

40、呈4倍增长倍增长者可作诊断。一次者可作诊断。一次CF抗体结果，需效价高于抗体结果，需效价高于1：64才可能作临床诊断。才可能作临床诊断。四、肺炎衣原体四、肺炎衣原体 n肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种，只肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种，只有一个血清型，是一种重要的呼吸道病原有一个血清型，是一种重要的呼吸道病原体。主要引起青少年急性呼吸道感染，可体。主要引起青少年急性呼吸道感染，可引起肺炎、支气管炎、咽炎和鼻窦炎等。引起肺炎、支气管炎、咽炎和鼻窦炎等。n还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎。肺还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎。肺炎衣原体性感染与急性心肌梗死和慢性冠炎衣原体性感染与急性心肌梗死和慢性

41、冠心病的关系，越来越引起人们的注意。心病的关系，越来越引起人们的注意。微生物特性微生物特性1有衣原体独特的生活周期，原体在电镜下呈有衣原体独特的生活周期，原体在电镜下呈 型的梨形，并有清晰的周浆间隙。型的梨形，并有清晰的周浆间隙。2全基因组测序已完成，与鹦鹉热衣原体、沙全基因组测序已完成，与鹦鹉热衣原体、沙 眼衣原体的眼衣原体的DNA同源性同源性10，而不同来，而不同来 擗擗TWAR株都具有株都具有94以上的以上的DNA同源性，同源性，其限制性内切酶的图谱相同。其单克隆抗体其限制性内切酶的图谱相同。其单克隆抗体 与沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体无交叉反应。与沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体无交叉反应。3用用

42、HEp-2和和HL细胞系较易分离和传代。细胞系较易分离和传代。抗体检测抗体检测以微量免疫荧光试验以微量免疫荧光试验(MIF)最为敏感，该试验最为敏感，该试验阳性者阳性者5070可分离出可分离出 TWAR，用此法用此法检测特异性的检测特异性的IgM和和IgG抗体，有利于区别近抗体，有利于区别近期感染和既往感染，也有利于区别原发感染期感染和既往感染，也有利于区别原发感染和再感染，和再感染，TWAR的再感染相当常见，特别的再感染相当常见，特别是老年人，再感染时一般不出现是老年人，再感染时一般不出现lgM和补体结和补体结合抗体。合抗体。第三节第三节 立克次体立克次体 对人致病的立克次体有五个属立克次体

43、属、对人致病的立克次体有五个属立克次体属、柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴通体属。通体属。共同特点共同特点大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出疹性疾病；疹性疾病；以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性；性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性；除了少数外全是专性活细胞内寄生；除了少数外全是专性活细胞内寄生；菌体内同时含有菌体内同时含有DNADNA和和 RNARNA两类核酸；两类核

44、酸；以二分裂方式进行繁殖；以二分裂方式进行繁殖；对抗生素敏感。对抗生素敏感。一、斑疹伤寒立克次体(一一)临床意义临床意义 1普氏立克次体是流行性斑疹伤寒普氏立克次体是流行性斑疹伤寒(又称虱传又称虱传 斑疹伤寒斑疹伤寒)的病原体。的病原体。病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介，病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介，而非储存宿主。而非储存宿主。传播方式为虱传播方式为虱-人人-虱，体虱仅是传染媒介。虱，体虱仅是传染媒介。莫氏立克次体莫氏立克次体n地方性斑疹伤寒地方性斑疹伤寒(又称鼠型斑疹伤寒又称鼠型斑疹伤寒)的病原的病原体。啮齿类动物是主体。啮齿类动物是主宿主，传播媒介是鼠宿主，传播媒介是鼠蚤或

45、鼠虱。蚤或鼠虱。n鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤寒立克次体从抓破的伤口进入人体。若有人寒立克次体从抓破的伤口进入人体。若有人虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地在人群中传播。在人群中传播。致病物质致病物质n有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖(LPS)；其二为磷脂酶其二为磷脂酶A,能损伤宿主细胞膜能损伤宿主细胞膜及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿主细胞并在其中生长。主细胞并在其中生长。n普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相普氏

46、和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相似，以高热、头痛、全身皮疹为主要特征。似，以高热、头痛、全身皮疹为主要特征。伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性器官损伤。器官损伤。(二二)微生物特性微生物特性1.比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚 集成团集成团,分布在胞质内分布在胞质内,Gimenez法染色后法染色后 呈红色，外表含有微荚膜结构。呈红色，外表含有微荚膜结构。2.必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时 需需要要C02。通通常常采采用用5-9日日龄龄鸡鸡胚胚作作卵卵黄黄囊囊接接种种，于

47、于32-35孵孵育育413d内内死死亡亡，鸡鸡胚胚死死亡亡时时间间与与接接种种剂剂量量大大小小呈呈直直接接相相关关。普普氏氏和和莫莫氏氏立立克克次次体体能能在在多多种种单单层层细细胞胞上上生生长长繁殖。豚鼠可作立克次体的初代分离。繁殖。豚鼠可作立克次体的初代分离。3.有有群群特特异异性性和和种种特特异异性性两两种种抗抗原原。大大部部分分立立克克次次体体与与普普通通变变形形杆杆菌菌X菌菌株株的的菌菌体体耐耐热热多多糖糖抗抗原原有有共共同同的的抗抗原原性性，故故可可用用这这些些菌菌株株代代替替立立克克次次体体抗抗原原进进行行凝凝集集反反应应去去检检测测抗抗体体，这这种种交交叉叉凝凝集集试试验验被被

48、称称为为外外斐斐反反应，可供辅助诊断。应，可供辅助诊断。外斐反应外斐反应 立克次体病立克次体病 变形杆菌变形杆菌 OX19OX19变形杆菌变形杆菌 OX2OX2变形杆菌变形杆菌 OXkOXk流行性斑疹伤寒流行性斑疹伤寒+-地方性斑疹伤寒地方性斑疹伤寒+-斑点热斑点热+/+/+/+/+-恙虫病恙虫病-+腺热腺热-+(三三)微生物检验微生物检验1.1.标本采集标本采集(1)(1)病人血液标本：发热期均有立克次体血症，病人血液标本：发热期均有立克次体血症，在急性期较易检出立克次体。争取在用抗生在急性期较易检出立克次体。争取在用抗生 素前采血，立即床侧接种。素前采血，立即床侧接种。(2)(2)活检或尸

49、检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心 瓣膜等标本。瓣膜等标本。2.2.标本直接检查标本直接检查(1)免免疫疫荧荧光光检检测测 用用于于脏脏器器检检查查。制制备备标标本本片片薄薄而而均均匀匀，组组织织结结构构清清晰晰，固固定定后后用用荧荧光光抗抗体体染染色色,常常见见脾脾、肺肺及及心心瓣瓣膜膜中中有有立立克克次次体体，也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。(2)核核酸酸检检测测 PCR敏敏感感性性高高，所所需需样样品品量量只只需需ELISA实实验验的的15。以以编编码码17kD蛋蛋白白的的基基因因和和编编码码普普氏氏和和莫莫氏氏立立克

50、克次次体体169kD蛋蛋白白的的基基因因作为扩增靶区。作为扩增靶区。n引引物物R17-1、-2在在65条条件件下下能能扩扩增增普普氏氏和和莫莫氏氏立立克克次次体体DNA。在在琼琼脂脂凝凝胶胶上上产产生生一一条条340bp的核酸带；的核酸带；n引引物物R169-1、-2仅仅能能扩扩增增普普氏氏立立克克次次体体DNA，产产生生一一条条432bp的的核核酸酸带带。两两种种引引物物同同时时使使用用，扩扩增增后后普普氏氏可可产产生生340bp和和432bp两两条条带带，而莫氏只产生而莫氏只产生340bp一条带。一条带。n该该法法敏敏感感性性可可达达005ngDNA水水平平，重重复复性性好好，操操作作方方