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1、基因表达检测基因表达检测第三部分：RT-PCR (Reverse transcription PCR)Reverse Transcription PCRRNA抽提cDNA反转录反转录基因特异性引导基因特异性引导Oligo(dT)引导引导随机六核苷酸引物引导随机六核苷酸引物引导PCRNorthernBlotting基因表达分析基因表达分析NorthernBlottingAwardedNobelPrizeforChemistryin1993.基因表达水平（梁大成等，2006）表达增强克隆的表达增强克隆的RT-PCR和和Northern杂交分析杂交分析ladderc 1 3 5 7 c 1 3 5
2、7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 EI12I1EI22F22EI1K8EI35I3-actinABCDEA:IRBB10 叶片接种叶片接种白叶枯（白叶枯（PXO86）C:C101A51 叶接种叶接种稻瘟病（稻瘟病（V86013）B:IRBB13 叶片接叶片接 种种白叶枯（白叶枯（PXO99）D:MH63 叶片接种叶片接种稻瘟病（稻瘟病（V86013）E:MH63 叶片接种叶片接种稻瘟病（稻瘟病（1366）（周斌，2001，硕士论文）mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求
3、较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。实验原理实验原理被污染的试剂，缓冲液被污染的试剂，缓冲液移液器移液器使用的器皿及使用的器皿及tip等等操作者的手，头发等操作者的手，头发等 RNA操作中应注意的问题：操作中应注意的问题：防止防止RNase污染污染外源外源RNase的主要来源：的主要来源：1.1.当处理当处理RNARNA时，移液器专用时，移液器专用2.2.保证保证RNARNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用；等留出专用；3.3.溶液和试剂分装成小份保存；溶液和试剂分装成小份保存；4.4.RNARNA电泳装置专用（清洗、处理、
4、电泳装置专用（清洗、处理、DEPCDEPC处理过的处理过的水冲洗）；水冲洗）；防止外源防止外源RNase污染的主要措施污染的主要措施(一）：一）：5.5.准备所有的溶液和缓冲液时，使用无准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNARNA酶的玻酶的玻璃器皿，璃器皿，DEPCDEPC处理过的水，用于处理过的水，用于RNARNA的化学药品的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用用0.10.1的的DEPCDEPC在在3737C C处理溶液处理溶液1 1小时后在小时后在15psi(1.05kg/cm15psi(1.05kg/cm2 2高压蒸气灭菌高压蒸气
5、灭菌15min15min。6.6.180180300300C C烘烤玻璃器皿烘烤玻璃器皿4hrs4hrs以上或用其它灭活以上或用其它灭活RNARNA酶的商品化产品处理塑料制品；酶的商品化产品处理塑料制品；7.7.使用新的、无使用新的、无RNARNA酶的一次性酶的一次性tubes,tipstubes,tips等；等；8.8.在分离在分离RNARNA的过程中用的过程中用RNARNA酶抑制剂以抑制酶抑制剂以抑制RNARNA酶酶的活性。的活性。防止外源防止外源RNase污染的主要措施污染的主要措施(二）：二）：材料要新鲜材料要新鲜;裂解过程要同裂解过程要同RNaseRNase活性抑制同步活性抑制同步防
6、止内源防止内源RNARNA酶降解酶降解RNARNARNARNA酶抑制剂酶抑制剂RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：1.DEPC2.氧钒核糖核苷复合物3.RNA酶的蛋白质抑制剂DEPC:是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧基甲酸化形式破坏RNase的活性OCCOO-CH2-CH3-CH2-CH3氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物:能与多种能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制地抑制RNA酶的活性酶的活性RNA酶蛋白质抑制剂RibonucleaseInhibitor
7、可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。RNA EXTRACTION(mini prep)RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和节和cDNA的合成都是必须的，的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对的纯度和完整性对于于Northern blot,RT-PCR和和cDNA文库的构建等分子生文库的构建等分子生物学实验都至关重要。物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少的因素是尽量减少RNA酶的污染。酶的污染。实验目的：实验目的：学习学习RNA的
8、简易制备过程，通过的简易制备过程，通过RNA电泳电泳带评价带评价RNA质量质量 实验材料：实验材料：水稻幼嫩叶片水稻幼嫩叶片 苯酚苯酚/氯仿反复抽提氯仿反复抽提，价廉但质不优，尤，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适其是对多酚等含量高的材料不适蛋白酶蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法配合酚、氯仿抽提的方法强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可 配合氯化铯离心或有机溶剂提取。配合氯化铯离心或有机溶剂提取。Trizol Reagent提取方法：提取方法：利用利用Trizol Trizol 试剂试剂 抽提植物总抽提植物总RNARNATrizol Trizol
9、试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总的快速抽提总RNARNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNARNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNARNA处于水处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNARNA。用这种方法得到的总用这种方法得到的总RNARNA中蛋白质和中蛋白质和DNADNA污染很少，污染很少，可以用来做可以用来做Northern,RT-PCR,Northern,RT-P
10、CR,分离分离mRNAmRNA，体外翻译，体外翻译和分子克隆等。和分子克隆等。1.75乙醇（乙醇（in DEPC-treated water)2.氯仿氯仿3.异丙醇（异丙醇（RNA专用）专用）4.RNase-free water：Draw water to RNase-free glass bottles.Add diethylpyrocarbonate（DEPC）to 0.1%.Let stand overnight and autoclave.5.5.防止外源防止外源RNaseRNase的污染：的污染：应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180180C C烘
11、烤烘烤3hrs3hrs以上；塑料制品以上；塑料制品DEPCDEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一水清洗，蛋白质变性剂处理；一次性用品如次性用品如tube,tiptube,tip等使用新的，无等使用新的，无RNARNA酶的产品。酶的产品。RNA抽提前应准备的其它试剂及物品：抽提前应准备的其它试剂及物品：操作步骤（一）操作步骤（一）液氮磨样，每管分装液氮磨样，每管分装0.1克样品；克样品；每管加每管加1毫升毫升Trizol 试剂（样品体积不超过试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积试剂体积的的10），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温
12、下净置冰上）；室温下净置510分钟以利于核酸蛋白质复合体分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；的解离；1.加加200 l的氯仿，用手剧烈摇荡的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置秒，室温下静置5分钟左分钟左右；右；4.2-8 ，12000g 离心离心10-15分钟；分钟；将水相（上清）转入一新离心管，加将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室异丙醇室温下沉淀温下沉淀10分钟；分钟；5.2-8 ，12000g 离心离心15分钟；分钟；6.弃上清，加弃上清，加1ml 75乙醇清洗乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干
13、净），7500g 离心离心5分钟，小心弃上清；分钟，小心弃上清；7.室温静置室温静置515分，使分，使RNA沉淀恰好干燥，加入沉淀恰好干燥，加入20 l DEPC水溶解，保存于水溶解，保存于-70 。8.取取2 l 琼脂糖电泳检测琼脂糖电泳检测RNA质量。质量。操作步骤（二）操作步骤（二）RNARNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳1.用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进行琼脂糖凝胶电泳2.用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在含6或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳3.检测0.5TBEIn1MOPS80150V40min1h30min电泳电泳有溴化乙锭存在时，电泳后28SrRNA和18
14、SrRNA在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由tRNA，5.8SrRNA和5SrRNA组成的较模糊的迁移较快的带。如果RNA没有降解，28SrRNA的亮度应当是18SrRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。What does good or bad total RNA look like when separated in gel?CallusLeafDegradationContaminantGoodRNA产量低的原因产量低的原因1.样品研磨不彻底，没有混匀，裂解样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底不彻底2.RNA没有完全溶解没有完全溶解RNA降解的主要原因降解的主要原因取样后没有
15、立即抽提取样后没有立即抽提RNA；抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围；抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围；样品运输、保藏不当，或样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入保藏不当，应放入-70 ，而不是，而不是-20 ）使用的溶液或器皿有使用的溶液或器皿有RNase污染污染琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于值低于3.5DNA污染的原因污染的原因样品太多，所加试剂相对太少样品太多，所加试剂相对太少用来分离用来分离RNA的样品中含有机溶剂（乙的样品中含有机溶剂（乙醇，醇，DMSO等），或碱溶液等等），或碱溶液等RT-PCR (Reverse trans
16、cription PCR)实验目的：实验目的：学习学习RT-PCRRT-PCR的原理及其操作过程的原理及其操作过程实验材料：实验材料：水稻幼嫩叶片水稻幼嫩叶片RNARNA 目前目前PCRPCR技术只能扩增技术只能扩增DNADNA模板，对模板，对RNARNA模板不能模板不能直接扩增。直接扩增。mRNA mRNA 反转录生成的反转录生成的cDNAcDNA可作为可作为PCRPCR的模板的模板进行扩增，这种在进行扩增，这种在mRNAmRNA反转录后进行的反转录后进行的PCRPCR扩增称为扩增称为RT-PCRRT-PCR。RT-PCRRT-PCR比比NorthernNorthern杂交更灵敏，对杂交更灵
17、敏，对RNARNA的质量的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。空表达的常用方法。实验原理实验原理DNaseI:是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生成具有5P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。Mg2+存在时，能在双链上产生切口；而Mn2+存在下能将双链DNA同时切断，使DNA片断化。活性定义：以小牛胸腺DNA为底物，在25C、pH5.0的条件下，1分钟内使反应液的260nm吸光度增加0.001所需要的酶量定义为1个活性单位。用途：1.与DNAPolymeraseI一起用于切口平移2.体外转录后除去模板DNA3.M
18、n2+存在下为鸟枪法测序（shotgunsequencing)制作DNA文库4.用于足迹法（footprinting)分析DNA-蛋白质相互作用单链多肽，具有聚合酶和较弱的RNaseH活性（或RNaseH），最适反应条件：37C,pH8.3,反转录酶：依赖于反转录酶：依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶鼠白血病毒反转录酶鼠白血病毒反转录酶 M-MLVM-MLV：禽成髓细胞反转录酶禽成髓细胞反转录酶 AMVAMV2条多肽链，具有聚合酶活性和较强的RNaseH活性，最适反应条件41-45C，pH8.3比pH7.6活性高RNaseH：催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的降解，产生不同链长
19、带3羟基和5磷酸末端的寡核苷酸。RibonucleaseInhibitor单一多肽，可与RNaseA形成1：1非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。活性表达需要巯基化试剂（DTT）本实验以水稻叶片本实验以水稻叶片RNARNA为材料，检测转基因水为材料，检测转基因水稻稻gusgus基因的表达。实验中设置一个看家基因作为阳基因的表达。实验中设置一个看家基因作为阳性对照，判断性对照，判断RNARNA 的定量及反转录、的定量及反转录、PCRPCR等过程是否等过程是否有问题；设置一个不加模板有问题；设置一个不加模板RNARNA的阴性对照，主要是的阴性对照，主要是
20、消除消除DNADNA及及PCRPCR试剂方面引起的假阳性；试剂方面引起的假阳性；PCR PCR 时设置时设置一个以叶片一个以叶片DNADNA为模板的阳性对照，检验扩增带型是为模板的阳性对照，检验扩增带型是否来源于反转录的否来源于反转录的cDNA,cDNA,实验设计实验设计操作步骤（一）操作步骤（一）RNA Preparation1.Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent.2.Dilute the Total RNA to the final concentration of 1 g/l by DU640.3.Combine the follo
21、wing in a 0.5 ml sterile eppendorf tube:Total RNA 3 l(2-5 g)RNase-free DNase l(u/l)10 DNase buffer 1 l add DEPC-treated ddH2O 5 l4.Incubate at 37 for 15 min,then 70 for 10 min.操作步骤（二）操作步骤（二）Reverse Transcriptase Reaction 1.Add 1 l 500 g/ml oligo(dT)15 primer,mix the contents of the tube by gently vo
22、rtexing and collect the reaction by brief centrifugation.2.Heat the mixture at 70 dry bath for 10 minutes,then put on ice for 5 minutes.3.Add the following contents:5 first strand buffer4 lRRI1 l10 mM dNTP 1 l M-MLV(200 U/l)1 l DEPC H2O 2 l操作步骤（二）操作步骤（二）4.incubate at 37 for 1 h.(The total volume sho
23、uld now be 20 l)5.Inactive the reaction by heating at 70 for 15 min,then add 20 l ddH2O and the first strand of cDNA can be used as a template to amplification in PCR.6.To remove the RNA complementary to the cDNA,add 1 l(2 units)of RNase H and incubate at 37 for 20 min.PCR技术技术PCR（多聚酶链式反应（多聚酶链式反应是一种体
24、外扩增特异是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板之一，是在模板DNA、引物和、引物和dNTPs的存在下依赖的存在下依赖于于DNA聚合酶的酶促反应。聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为于引物和模板结合的特异性。反应分为变性变性（denaturation，），）退火退火（annealing）、）、延伸延伸（extension）三步，经过一定的循环，介于两个引）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异物之间的特异DNA片段得到大量扩增。片段得到大量扩增。TheIn
25、ventionofPCRInventedbyKaryMullisin1983.Firstpublishedaccountappearedin1985.AwardedNobelPrizeforChemistryin1993.模板模板DNA：一般：一般102105个拷贝个拷贝Mg2：Mg2能能影影响响反反应应的的特特异异性性和和扩扩增增片片段段的的产产率率。一般反应体系中一般反应体系中1.5-2.5 mmol/L 反反应应反反冲冲液液：使使Taq DNA聚聚合合酶酶的的作作用用环环境境维维持持偏偏碱性。碱性。dNTP：在在PCR反反应应体体系系中中其其浓浓度度一一般般为为 20200 mol/L，
26、浓度过高、过低都不利。，浓度过高、过低都不利。Taq DNA聚聚合合酶酶：在在7075 C具具最最高高活活性性。具具有有53的的聚聚合合酶酶活活性性和和53的的外外切切酶酶活活性性，无无校校正正功功能。是镁依赖性酶。能。是镁依赖性酶。引物：引物：PCR反应中引物浓度一般为反应中引物浓度一般为0.10.5 mol/L。PCR反应体系中的主要成分及其作用：反应体系中的主要成分及其作用：变变性性：模模板板DNA由由双双链链变变成成单单链链，使使有有利利于于与与引引物物结结合合。可可根根据据模模板板的的复复杂杂程程度度调调整整变变性性温温度度和和时时间间，一一般般情情况况下下94 C 30秒秒可可使使
27、各各种种复复杂杂的的DNA分分子子完完全全变变性性（过过高高的的温温度度或或高高温温持持续续时时间间过过长长，可可对对Taq DNA聚聚合酶活性和合酶活性和dNTP分子造成损害）。分子造成损害）。退退火火：变变性性的的DNA快快速速冷冷却却至至4060 C可可使使引引物物和和模模板板DNA发发生生结结合合。可可根根据据引引物物的的长长度度和和GC的的含含量选择复性温度。退火时间量选择复性温度。退火时间30秒。秒。延延伸伸：一一般般是是7075 C，此此时时Taq DNA聚聚合合酶酶活活性性最高。最高。1kb的可适当延长时间。的可适当延长时间。循循环环次次数数：理理论论上上2025个个循循环环P
28、CR产产物物的的累累计计即即可可达达到到最最大大值值、实实际际操操作作中中2530较较合合理理。循循环环次次数越多，非特异性产物的量也会增加。数越多，非特异性产物的量也会增加。循环条件的设定：循环条件的设定：ThermalCyclersPCRmachineavailablefrommanysuppliers.Manyblockformatsandmulti-blocksystems.Reactionsintubesor96-wellmicro-titreplates.1.在冰上配制下列反应体系在冰上配制下列反应体系:First strand cDNA 2 lTaKaRa Ex Taq(5 u/
29、1 l)0.5 l10 Ex Taq buffer2 ldNTP mixture(2 mM)2 lPrimer F(10 mM)0.5 lPrimer R(10 mM)0.5 l ddH2O12.5 l 混匀后，短暂离心，每管加一滴矿物油。混匀后，短暂离心，每管加一滴矿物油。操作步骤（三）操作步骤（三）PCR3.PCR反应循环条件设置：反应循环条件设置：根据引物及基因的表达水平设置循环参数：如引物序列、引物长度、扩增片段的长度及mRNA的丰度等4.检检测测：加加2 l溴溴酚酚蓝蓝，混混匀匀，取取15 l反反应应产产物物电泳；电泳；5.5.在在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；的琼脂糖凝胶上点样电泳；
30、EB染色，紫染色，紫外观察。外观察。引物序列引物名称引物名称引物序列引物序列扩增片段大小扩增片段大小GUSFCCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC1573bpGUSRGAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACCGAPDH_F1CGACCCGTTCATCACCACCGAC基因组1444bp,cDNA515bpGAPDH_R1AGCTAGCAGCCCTTCCACCTCTCCAGUSF-1GGtgattgatgaaactgctgctgTCG554bpGUSR-1acatatccagccatgcacactGATAC-actinFTGCTATGTACGTCGCCATCCAG基因组75
31、0bp，cDNA250bp-actinRAATGAGTAACCACGCTCCGTCA反应程序：94度45秒，58度45秒，72度60秒，27CYCLES.Genome:750bpcDNA:250bp2KBcDNAZH11H2O-actin本次RT-PCR实验使用的引物：报告基因：GUS组成型基因：GAPDH1.Taq酶过多；酶过多；2.Mg2+浓度不合适；浓度不合适；3.引物浓度过高或设计不合理；引物浓度过高或设计不合理；4.复性温度过低；复性温度过低；5.循环次数过多；循环次数过多；6.模板量过多；模板量过多；PCR产物的电泳检测时出现拖带或非产物的电泳检测时出现拖带或非特异性扩增带的可能原
32、因：特异性扩增带的可能原因：PCR扩增产物电泳检测扩增产物电泳检测Optimising the Annealing TemperaturePrimers have a calculated annealing temperature(e.g.54).Temperature must be confirmed practically.Temperature steps of 2 above and below.Use gradient cycler.Optimising the Mg2+ConcentrationThe fidelity of the PCR depends on Mg2+.Op
33、timize Mg2+in a ladder of 0.5 mM.Sometimes a compromise between yield and specificity.引物问题引物问题引物浓度过高：与模板错配，非特异扩增；产生引物浓度过高：与模板错配，非特异扩增；产生引物二聚体引物二聚体引物长度：一般引物长度：一般1828 bp；GC含量约含量约5060配对引物的配对引物的Tm值要相当值要相当引物引物3端应尽量避免互补，以免产生引物二聚体端应尽量避免互补，以免产生引物二聚体引物引物3端端3个或个或3个以上的个以上的GC，容易结合到基因组，容易结合到基因组GC丰富区域，导致错误扩增丰富区域，
34、导致错误扩增1.点样或染胶问题点样或染胶问题2.反反应应体体系系中中忘忘记记加加入入某某种种成成分分(无无扩扩增增产产物物）或或分分装装mixture时时出了问题；出了问题；3.目的片段太大，使用的目的片段太大，使用的DNA Polymerase 无法扩增出目的片段；无法扩增出目的片段；4.DNA溶溶液液中中或或反反应应体体系系中中含含有有Taq 酶酶抑抑制制剂剂，抑抑制制了了Taq DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。5.退火温度太高；退火温度太高；6.Taq 酶活力不够或其他试剂有问题；酶活力不够或其他试剂有问题；7.引物设计不合理，与模板不配对等。引物设计不合理，与模板不配对等。导致导致PCR产物很少或无扩增产物的原因产物很少或无扩增产物的原因凝胶电泳检测凝胶电泳检测PCR产物时，目的扩增带很弱或看不到目的扩增带，产物时，目的扩增带很弱或看不到目的扩增带，应从以下几个方面寻找原因：应从以下几个方面寻找原因：