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1、关于基因表达的检测第一页，讲稿共七十五页哦一、基因表达的概述：一、基因表达的概述：1.1.从基因到蛋白质从基因到蛋白质中心法则：中心法则：DNAmRNA蛋白质蛋白质转录转录逆转录逆转录翻译翻译复制复制1.2.教学目的：教学目的：1.了解检测基因表达主要方法的原理及大概操作要点了解检测基因表达主要方法的原理及大概操作要点2.理解各检测方法的优缺点理解各检测方法的优缺点3.懂得合理选择实验方法及对各实验结果的合理解释懂得合理选择实验方法及对各实验结果的合理解释第二页，讲稿共七十五页哦二、基因表达调控的基本概念与原理：二、基因表达调控的基本概念与原理：1.基因表达调控的概念及方式：基因表达调控的概念
2、及方式：1)基因：基因：一个遗传单位，是一段可表达的一个遗传单位，是一段可表达的DNA序列。序列。2)基基因因组组：一一个个单单倍倍体体细细胞胞或或病病毒毒颗颗粒粒的的全全套套基基因因。人人类类基基因因组组含含约约4万个基因。万个基因。3)基基因因表表达达：基基因因所所包包含含的的遗遗传传信信息息通通过过转转录录生生成成RNA，再再经经过过翻翻译译生生成成蛋蛋白白质质的的过过程程。一一般般而而言言，在在某某一一特特定定时时刻刻，高高等等生生物物仅仅有有不到不到15%的基因表达。的基因表达。4)基基因因表表达达调调控控：基基因因表表达达有有其其特特定定的的规规律律，并并受受到到机机体体各各种种因
3、因素素的的调调节节和和控控制制。对对基基因因的的表表达达实实施施精精确确的的控控制制，使使细细胞胞适适应应不不同同阶阶段段、不不同同环环境境条条件件下下的的生生长长与与发发育育的的需需要要，维维持持机机体体正正常常生生命命活活动动，有有着着重重要意义。要意义。可诱导基因：基因表达的时间特异性可诱导基因：基因表达的时间特异性 基因表达的空间特异性（组织特异性）基因表达的空间特异性（组织特异性）看家基因看家基因:第三页，讲稿共七十五页哦2.基因表达调控的基本原理：基因表达调控的基本原理：原原核核生生物物和和真真核核生生物物的的基基因因表表达达调调控控尽尽管管在在细细节节上上差差异异很很大大，但但两
4、者的调控模式和原理极为相似。两者的调控模式和原理极为相似。调调节节作作用用主主要要包包括括核核酸酸之之间间的的相相互互作作用用、核核酸酸与与蛋蛋白白质质之之间间的的相相互互作作用以及蛋白质之间的相互作用。用以及蛋白质之间的相互作用。调控作用可能是正向的或负向的。调控作用可能是正向的或负向的。调调控控点点可可以以位位于于基基因因表表达达过过程程的的各各个个环环节节，如如基基因因的的激激活活、转转录录起起始始、转转录录后后加加工工、mRNA降降解解、蛋蛋白白质质翻翻译译、翻翻译译后后加加工工和蛋白质降解等。和蛋白质降解等。1)特异特异DNA序列对基因表达的影响：序列对基因表达的影响：真真（原原）核
5、核生生物物DNA分分子子上上的的特特定定序序列列构构成成了了基基因因表表达达的的基基本本信信号号：起起始始密密码码、调调控控序序列列、编编码码序序列列、终终止止密密码码、单单拷拷贝贝序序列列、重重复复序列等。序列等。第四页，讲稿共七十五页哦2)DNA与蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：与蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：A.DNA上的特定序列可以与相应的蛋白质结合，这些蛋白质依其作用分为：上的特定序列可以与相应的蛋白质结合，这些蛋白质依其作用分为：阻遏蛋白（阻遏蛋白（repressor）：与操纵序列结合，阻遏基因的转录。）：与操纵序列结合，阻遏基因的转录。激活蛋白（激活蛋白（activat
6、or）：与启动子中的特定序列结合，增强转录。）：与启动子中的特定序列结合，增强转录。特异因子特异因子转转录录因因子子（transcription factor,TF）也也称称反反式式作作用用因因子子（trans-acting factor）：通过与顺式作用元件结合，调节转录活性）：通过与顺式作用元件结合，调节转录活性B.DNA-蛋蛋白白质质之之间间的的结结合合通通常常是是非非共共价价键键的的形形式式，通通过过蛋蛋白白质质分分子子中中特特殊殊的的结结构构域域与与DNA分子中双螺旋结构的大沟结合，调节基因的转录。常见的分子中双螺旋结构的大沟结合，调节基因的转录。常见的DNA-蛋白质结合域有：蛋白质
7、结合域有：螺旋转角螺旋（螺旋转角螺旋（helix-turn-helix）锌指（锌指（zinc fingers）第五页，讲稿共七十五页哦3)蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：A.调调节节蛋蛋白白通通常常通通过过二二聚聚体体（dimer）或或多多聚聚体体（polymer）的的形形式式与与DNA结合结合B.不不同同的的调调节节蛋蛋白白也也可可以以相相互互作作用用或或结结合合后后，再再与与DNA特特定定部部位位结结合合，调节同一基因的不同转录水平，尤其多见于真核生物。调节同一基因的不同转录水平，尤其多见于真核生物。C.蛋白质之间相互作用的典型特征包括：蛋白质之间相
8、互作用的典型特征包括：亮氨酸拉链（亮氨酸拉链（leucine zipper）螺旋转角螺旋（螺旋转角螺旋（helix-loop-helix）4)RNA聚合酶对基因表达的影响：聚合酶对基因表达的影响：A.转转录录起起始始是是通通过过RNA聚聚合合酶酶与与启启动动子子的的结结合合来来实实现现的的，转转录录起起始始的的调控是基因表达调控中最重要、最基础的调控点之一。调控是基因表达调控中最重要、最基础的调控点之一。B.不不同同启启动动子子的的序序列列不不同同，因因而而影影响响它它们们与与RNA聚聚合合酶酶结结合合的的亲亲和和力力，亲亲和力的不同继而直接影响转录起始的频率。和力的不同继而直接影响转录起始的
9、频率。C.RNA聚聚合合酶酶和和启启动动子子的的结结合合也也会会受受到到调调节节蛋蛋白白的的影影响响,阻阻遏遏蛋蛋白白、激激活活蛋蛋白白、特特异异因因子子、转转录录因因子子等等均均可可通通过过增增强强或或者者干干扰扰RNA聚聚合合酶酶与与启启动动子之间的结合，调节基因的起始。子之间的结合，调节基因的起始。第六页，讲稿共七十五页哦三、原核生物的基因表达调控：三、原核生物的基因表达调控：原原核核生生物物结结构构简简单单、无无细细胞胞核核，转转录录和和翻翻译译过过程程耦耦联联在在一一起起，对对环环境境条条件件的的变变化化反反应应迅迅速速，可可以以根根据据环环境境因因素素的的变变化化迅迅速速调调整整自
10、自身身基基因因的的表表达达，满满足足其其生长和繁殖的需要。原核基因表达调控的特点为：生长和繁殖的需要。原核基因表达调控的特点为：普遍存在操纵子调控模式普遍存在操纵子调控模式通过特异的阻遏蛋白或激活蛋白调节基因的转录通过特异的阻遏蛋白或激活蛋白调节基因的转录转录与翻译的耦联转录与翻译的耦联1.转录水平的调控：转录水平的调控：1)乳糖操纵子的调控：乳糖操纵子的调控：第七页，讲稿共七十五页哦阻遏蛋白对乳糖操纵子的调节阻遏蛋白对乳糖操纵子的调节第八页，讲稿共七十五页哦2）其它转录调控机制：其它转录调控机制：转录衰减：转录衰减：基因重组：基因重组：2.翻译水平的调控：翻译水平的调控：1)SD序序列列对对
11、翻翻译译的的影影响响：SD序序列列是是原原核核生生物物mRNA起起始始密密码码子子AUG上上游游3-10碱碱基基的的由由3-9个个碱碱基基组组成成的的一一个个富富含含嘌嘌呤呤核核苷苷酸酸的的序序列列，能能与与核核糖糖体体小小亚亚基基16s rRNA3末末端端富富含含嘧嘧啶啶的的序序列列互互补补，从从而而使使核核糖糖体体与与mRNA结结合，开始翻译。合，开始翻译。2)mRNA的的稳稳定定性性：原原核核细细胞胞内内mRNA通通常常很很快快被被降降解解。例例如如：E.coli的的许许多多mRNA在在37时的平均寿命只有大约时的平均寿命只有大约2分钟。分钟。3)翻翻译译产产物物对对翻翻译译的的影影响响
12、：有有些些mRNA编编码码的的蛋蛋白白质质，本本身身就就是是在在蛋蛋白白翻翻译译过过程程中中发发挥挥作作用用的的因因子子。这这些些因因子子可可对对自自身身的的翻翻译译产产生生调调控控作作用用。如如起起始始因因子子3（IF-3），当当它它合合成成过过多多时时，能能有有效效地地校校正正和和抑抑制制其其自自身身的的起起始始密密码码子子与与起起始始tRNA的的配配对对而而抑抑制制翻翻译译的的起起始始。另另外外还还有有核核糖糖体体蛋蛋白、翻译终止因子等均可影响翻译过程。白、翻译终止因子等均可影响翻译过程。第九页，讲稿共七十五页哦四、真核生物的基因表达调控：四、真核生物的基因表达调控：真核生物基因表达调控
13、与原核不同点在于：真核生物基因表达调控与原核不同点在于：1.1.转录激活与染色体转录区特定结构相适应转录激活与染色体转录区特定结构相适应2.2.正性调节占主导正性调节占主导3.3.转录与翻译在空间上的分离转录与翻译在空间上的分离4.4.更多、更复杂的调控蛋白更多、更复杂的调控蛋白第十页，讲稿共七十五页哦（一）、DNADNA水平的调控（真核生物表达调控的次要水平的调控（真核生物表达调控的次要和辅助手段）：和辅助手段）：1.染色质（染色质（chromatin）结构对基因表达的调控作用：）结构对基因表达的调控作用：真真核核基基因因通通常常与与组组蛋蛋白白（histone）结结合合形形成成核核小小体体
14、，从从而而保保护护DNA免免受受损伤，维持基因组稳定，抑制基因的表达。影响基因表达水平的主要有：损伤，维持基因组稳定，抑制基因的表达。影响基因表达水平的主要有：组蛋白的含量组蛋白的含量组蛋白的结构组蛋白的结构调调节节蛋蛋白白与与组组蛋蛋白白H1和和H5竟竟争争和和DNA的的结结合合，从从而而解解除除组组蛋蛋白白对对基基因表达的抑制作用。因表达的抑制作用。2.基因修饰对基因表达的调控作用：基因修饰对基因表达的调控作用：胞胞嘧嘧啶啶经经甲甲基基化化为为5-甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶（常常出出现现在在5端端侧侧翼翼序序列列的的GC丰丰富富区区），影影响响DNA特特异异序序列列与与转转录录因因子子的的结结合
15、合，使使基基因因不不能能转转录录或或阻阻止止转转录录复复合合物物的的形形成。成。第十一页，讲稿共七十五页哦3.3.基因丢失：基因丢失：1)1)在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除掉某些基因的活性。在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除掉某些基因的活性。2)2)染色体破碎所致的不均等分配。染色体破碎所致的不均等分配。3)3)仅仅发发生生在在低低等等生生物物中中（原原生生动动物物、线线虫虫、昆昆虫虫、甲甲壳壳类类动动物物等等），此此现现象象在高等生物中迄今尚未发现。在高等生物中迄今尚未发现。4.4.基因扩增：基因扩增：细细胞胞内内某某些些特特定定基基因因的的拷拷贝贝数数专专一一性
16、性地地大大量量增增加加的的现现象象，它它是是细细胞胞在在短短期期内内为为满满足足某某种种需需要要（发发育育需需要要、外外界界环环境境因因素素）而而产生足够的基因产物的一种调控手段。产生足够的基因产物的一种调控手段。第十二页，讲稿共七十五页哦5.5.基因重排：基因重排：基基因因重重排排是是指指某某些些基基因因片片段段改改变变原原来来的的存存在在顺顺序序，通通过过调调整整有有关关基基因因片片段段的的衔衔接接顺顺序序，重重新新组组成成为为一一个个完完整整的的转转录录单单位位。一一种种熟熟知知的的以以基基因因重重排排来来调节不同基因表达的例子是哺乳动物免疫球蛋白各编码区的连接：调节不同基因表达的例子是
17、哺乳动物免疫球蛋白各编码区的连接：1)1)一个免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链和重链。一个免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链和重链。2)2)轻轻链链：可可变变区区、恒恒定定区区、连连接接区区都都由由位位于于同同一一染染色色体体不不同同位位置置的的DNADNA片片段段编编码码，在在形形成成活活性性基基因因前前，上上述述各各一一个个基基因因通通过过染染色色体体内内重重组成连到一起。组成连到一起。3)3)重链：可变区、恒定区、连接区、歧化区重链：可变区、恒定区、连接区、歧化区第十三页，讲稿共七十五页哦（二）、转录水平的调控：（二）、转录水平的调控：转转录录水水平平的的调调控控是是真真核核基基因因表表达
18、达调调控控中中最最重重要要的的环环节节，大大多多数数生生物物基基因因在在转转录录水水平平的的调调控控是是决决定定细细胞胞质质中中mRNAmRNA水水平平的的一一个个最最重重要要方方式式，调调控控主主要要通通过过反反式式作作用用因因子子和和RNARNA聚聚合合酶酶的相互作用来实现。的相互作用来实现。反反式式作作用用因因子子是是一一类类细细胞胞核核内内存存在在的的蛋蛋白白质质，是是与与特特异异的的DNADNA序序列列（顺顺式式作作用用元元件件）结结合合的的调调控控蛋蛋白白。它它通通过过识识别别并并结结合合上上游游启启动动子子元元件件和和增增强强子子中中的的顺顺式式元件，激活或阻遏基因的表达。它包括
19、三个功能域：元件，激活或阻遏基因的表达。它包括三个功能域：DNADNA识别结合域（常有锌指结构）识别结合域（常有锌指结构）转录活性域（富含某些特定氨基酸如谷氨酰氨）转录活性域（富含某些特定氨基酸如谷氨酰氨）蛋蛋白白质质相相互互作作用用结结构构域域（常常具具有有亮亮氨氨酸酸拉拉链链结结构构和和螺螺旋旋环环螺螺旋结构等）。旋结构等）。第十四页，讲稿共七十五页哦转录起始复合物转录起始复合物:转录起始复合物的形成过程有三步：转录起始复合物的形成过程有三步：TATATATA因子结合因子结合TATATATA盒（形成盒（形成TATATATA因子因子DNADNA复合物）复合物）RNA RNA polpol识识
20、别别并并结结合合TATATATA因因子子DNADNA复复合合物物（闭闭合合复复合合物物，DNADNA双双链链没有打开，不能启动转录）没有打开，不能启动转录）转转录录起起始始因因子子与与RNA RNA polpol结结合合，形形成成转转录录起起始始复复合合物物（开开放放复复合合物物，DNADNA双螺旋已打开，可以合成双螺旋已打开，可以合成RNARNA）转录起始的调控：转录起始的调控：基基因因表表达达的的转转录录水水平平调调控控主主要要通通过过反反式式作作用用因因子子、顺顺式式作作用用元元件件和和RNARNA聚聚合合酶酶的的相相互互作作用用来来完完成成。调调控控机机制制涉涉及及反反式式作作用用因因
21、子子的的激激活活及及反反式式作作用用因因子子的的作用等。作用等。1.1.反式作用因子的活性调节：反式作用因子的活性调节：1)1)表达调节：迅速合成、迅速降解表达调节：迅速合成、迅速降解2)2)共价修饰：磷酸化去磷酸化、糖基化共价修饰：磷酸化去磷酸化、糖基化3)3)配体结合：激素激素受体（是核内的反式作用因子）配体结合：激素激素受体（是核内的反式作用因子）4)4)蛋蛋白白质质与与蛋蛋白白质质相相互互作作用用：maxmax蛋蛋白白c-mycc-myc蛋蛋白白（核核内内的的反反式式作作用用因因子）子）第十五页，讲稿共七十五页哦2.2.反式作用因子与顺式元件结合的调节：反式作用因子与顺式元件结合的调节
22、：顺式作用元件包括：顺式作用元件包括：上游启动子元件上游启动子元件远远距距离离的的增增强强子子元元件件（上上游游增增强强子子元元件件、下下游游增增强强子元件）子元件）3.3.反式作用因子作用方式的调节：反式作用因子作用方式的调节：反反式式作作用用因因子子通通过过下下列列不不同同的的方方式式作作用用到到RNARNA聚聚合合酶酶结结合合位位点点从从而而影影响其转录活性：响其转录活性：成环成环扭曲扭曲滑动滑动连锁反应连锁反应4.4.反式作用因子的组合式调节：反式作用因子的组合式调节：几种不同的反式作用因子组合，发挥特定的作用。几种不同的反式作用因子组合，发挥特定的作用。第十六页，讲稿共七十五页哦（三
23、）、转录后水平的调控：（三）、转录后水平的调控：转录后水平的调控一般是指基因转录后对转录产物进行一系列转录后水平的调控一般是指基因转录后对转录产物进行一系列修饰、加工过程，主要包括修饰、加工过程，主要包括mRNAmRNA选择性剪切、胞内定位以及选择性剪切、胞内定位以及mRNAmRNA稳定性调节：稳定性调节：DNADNA（核内）（核内）转录转录 mRNAmRNA前体前体 加工加工成熟成熟mRNAmRNA 运输运输细胞质细胞质 第十七页，讲稿共七十五页哦1.1.mRNAmRNA前体加帽、加尾以调控其稳定性：前体加帽、加尾以调控其稳定性：55加帽（加帽（cappingcapping）：）：7 7甲基
24、鸟苷三磷酸甲基鸟苷三磷酸33端加尾（端加尾（tailingtailing）：多聚）：多聚A A（Poly APoly A）2.2.mRNAmRNA前体的选择性剪接（前体的选择性剪接（splicingsplicing）与拼接：）与拼接：1)1)选择性剪切：去除选择性剪切：去除mRNAmRNA前体中的内含子前体中的内含子2)2)选选择择性性拼拼接接：从从同同一一基基因因产产生生若若干干种种有有部部分分相相同同结结构构的的蛋蛋白白质质，即即通通过过MrnauMrnau前前性性的的选选择择性性拼拼接接而而产产生生不不同同的成熟的成熟mRNAmRNA，然后翻译成不同的蛋白质。，然后翻译成不同的蛋白质。3
25、)3)选选择择性性表表达达：多多基基因因的的基基因因家家族族中中的的各各成成员员在在特特定定的的细细胞胞中中，在一定的发育阶段和在一定的生理条件下选择性的表达。在一定的发育阶段和在一定的生理条件下选择性的表达。第十八页，讲稿共七十五页哦3.RNA编辑的调控：编辑的调控：RNA编编辑辑（editing）：是是指指转转录录后后的的mRNA前前体体在在编编码码区区发发生生核核苷苷酸酸改改变变的的现现象象，从从而而产产生生出出氨氨基基酸酸序序列列不不同同的的蛋白质。包括：蛋白质。包括：核苷酸的替换核苷酸的替换核苷酸的插入或缺失核苷酸的插入或缺失4.mRNA转运的调控：转运的调控：mRNA前前体体经经过
26、过加加帽帽、加加尾尾、剪剪切切等等加加工工后后通通过过核核膜膜孔孔从从核核内内运运至至胞胞浆。浆。大大约约只只有有20%的的mRNA进进入入胞胞浆浆，留留在在核核内内的的mRNA约约50%会会在在1小小时内降解。时内降解。第十九页，讲稿共七十五页哦（四）、翻译水平的调控：翻翻译译水水平平的的调调控控主主要要是是控控制制mRNAmRNA的的稳稳定定性性和和mRNAmRNA翻翻译译的的起起始始频频率率，是是一种迅速控制基因表达的方式，是各种高等生物广泛采用的调控方式。一种迅速控制基因表达的方式，是各种高等生物广泛采用的调控方式。1.1.mRNAmRNA的稳定性，取决于：的稳定性，取决于：1)1)m
27、RNAmRNA的二级结构（不易受外切酶攻击）的二级结构（不易受外切酶攻击）2)2)帽子及其种类帽子及其种类3)3)polyApolyA尾的长短尾的长短4)4)与与mRNAmRNA结合的蛋白质的种类结合的蛋白质的种类2.2.mRNAmRNA翻译起始的调控（即控制翻译起始的调控（即控制mRNAmRNA的可翻译性）：的可翻译性）：1)1)许许多多蛋蛋白白质质因因子子可可以以影影响响蛋蛋白白质质合合成成的的起起始始，如如真真核核生生物物起起始始因因子子2 2（eukaryotic eukaryotic initiation initiation factorfactor，eIF-2eIF-2）的的磷磷
28、酸酸化化会会使使其其活活性性降降低低，从从而而减少蛋白质合成。减少蛋白质合成。2)2)Recruitment factorRecruitment factor可使可使masked mRNAmasked mRNA与核糖体、氨酰基与核糖体、氨酰基-tRNA-tRNA、蛋白质结合。、蛋白质结合。3.3.真核生物蛋白质合成的自体调控：真核生物蛋白质合成的自体调控：某些蛋白可抑制其自身某些蛋白可抑制其自身mRNAmRNA的翻译的翻译 第二十页，讲稿共七十五页哦（五）、翻译后水平的调控：mRNA翻译的产物新生多肽链大多是没有生物学活性的，翻译的产物新生多肽链大多是没有生物学活性的，必须经过加工、修饰才能成
29、为有活性的蛋白质，加工、修饰过必须经过加工、修饰才能成为有活性的蛋白质，加工、修饰过程包括：程包括：1.信号肽的切除：由信号肽的切除：由1530个疏水氨基酸组成的信号肽可使个疏水氨基酸组成的信号肽可使蛋白质从内质网膜进入高尔基体。蛋白质从内质网膜进入高尔基体。2.新生肽链的修饰：磷酸化、羟基化、糖基化、乙酰化等。新生肽链的修饰：磷酸化、羟基化、糖基化、乙酰化等。3.肽链的剪切与正确折叠肽链的剪切与正确折叠第二十一页，讲稿共七十五页哦五、蛋白表达水平的检测方法及选择五、蛋白表达水平的检测方法及选择1.DNA水平的检测：水平的检测：Southern blotPCRDNA测序测序2.蛋白质表达水平的
30、检测：蛋白质表达水平的检测：SDSPAGE与与Western blotELISA流式细胞仪（流式细胞仪（FACS）检测）检测免疫组化免疫组化蛋白质芯片蛋白质芯片3.mRNA水平的检测：水平的检测：Northern blot基因芯片基因芯片Nuclei run-on原位杂交原位杂交RT-PCR实时荧光定量实时荧光定量RTPCR半定量半定量RTPCR第二十二页，讲稿共七十五页哦Southern Blot1.原理：原理：DNADNA杂交杂交2.操作过程：操作过程：1)基因组基因组DNA经过一种或多种限制性内切酶消化经过一种或多种限制性内切酶消化2)消化后的消化后的DNA片段在标准的琼脂糖凝胶上经电泳
31、按照大小进行分离片段在标准的琼脂糖凝胶上经电泳按照大小进行分离3)DNA经原位变性后从凝胶中转移到固定支持物上（通常为尼龙膜或硝经原位变性后从凝胶中转移到固定支持物上（通常为尼龙膜或硝酸纤维素膜）酸纤维素膜）4)变性的变性的DNA可以与标记的可以与标记的DNA、RNA或寡核苷酸探针杂交或寡核苷酸探针杂交5)通过特定的检测方法（如放射自显影）来确定与探针互补的带的位置；或通过特定的检测方法（如放射自显影）来确定与探针互补的带的位置；或通过对经过不同限制性内切酶（单一或联合使用的）消化过的基因组通过对经过不同限制性内切酶（单一或联合使用的）消化过的基因组DNA产生的带的大小及数量的估计来判断结果产
32、生的带的大小及数量的估计来判断结果第二十三页，讲稿共七十五页哦 重物（重物（400克）克）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶滤纸滤纸滤纸桥滤纸桥尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板支持物支持物20XSSC上行毛细管转移示意图上行毛细管转移示意图第二十四页，讲稿共七十五页哦Polymerased Chain Reaction(PCR)1.原理：原理：高温下双链高温下双链DNA变性为单链变性为单链DNA低温下单链低温下单链DNA与引物寡核苷酸复性与引物寡核苷酸复性中温下由中温下由DNA聚合酶进行互补链的修复复聚合酶进行互补链的修复复制过程制过程第二十五页，讲稿共七十五页哦2.方法方法1)10 X 反应缓
33、冲液：反应缓冲液：PH8.8-8.3Mg2+0.5-5.0mmol/L，K+50-100mmol/L，2)dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）3)模板模板DNA4)引物（引物是引物（引物是PCR反应成功与否的关键之一）反应成功与否的关键之一）上游引物上游引物下游引物下游引物5)TaqDNA聚合酶聚合酶6)ddH2O95 C 1min55 C 1min72 C 1min4 C 35X第二十六页，讲稿共七十五页哦DNA 序列测定1.Sanger双脱氧未端终止法测序原理：双脱氧未端终止法测序原理：聚聚合合酶酶扩扩增增：PCR扩扩增增的的同同时时在在部部分分产产物物末末端端掺掺入入四四
34、色色荧荧光光标标记记的的四四种种ddNTPs电泳分离、激光读序电泳分离、激光读序 2.ABI 377全自动测序仪进行全自动测序仪进行DNA核苷酸序列测定方法：核苷酸序列测定方法：1)引物准备：引物准备：纯度：须事先用纯度：须事先用PAGE胶纯化过胶纯化过浓度：配制成浓度：配制成5-10pmol/uL5-10pmol/uL 第二十七页，讲稿共七十五页哦2)模板准备：模板准备：纯度：推荐使用试剂盒进行纯化纯度：推荐使用试剂盒进行纯化模板量：模板量：PCR产物产物 100-200bp 2-4ng 单链单链 50-100ng 200-500bp 4-10ng 双链双链 200-500ng 500-10
35、00bp 6-20ng 粘粒、粘粒、BAC 0.5-1ug 1000-2000bp 10-40ng 细菌基因组细菌基因组DNA 2-3ug 2000bp 80-2000ng3)测序测序PCR：用于：用于PCR产物，单、双链产物，单、双链加样：加样：Terminator Ready Reaction Mix 8.0ul模板模板 不定量不定量引物引物 3.2pmolddH2O 不定量不定量 合计合计 20ul反应：反应：96 C 10sec50 C 5sec60 C 4min4 C 70X第二十八页，讲稿共七十五页哦4)纯化测序产物：纯化测序产物：加加50ul 95%乙醇，混匀乙醇，混匀置室温（置
36、室温（25度）度）15分钟，分钟，12000g离心离心20分钟，弃上清分钟，弃上清加加150ul 75%乙醇洗乙醇洗1-2次，同上离心次，同上离心10分钟。分钟。弃上清，抽干。弃上清，抽干。5)5)制备测序电泳用制备测序电泳用PAGPAG变性胶变性胶 6)6)预电泳（预电泳（Pre-runPre-run）7)7)电泳电泳8)8)数据分析数据分析 第二十九页，讲稿共七十五页哦SDSPAGE与与Western blot(蛋白凝胶电泳及免疫印迹法蛋白凝胶电泳及免疫印迹法)1.原理：原理：1)确保蛋白质解离为单个多肽亚确保蛋白质解离为单个多肽亚基（基（SDS）2)通过分离胶的筛分作用，将蛋白通过分离胶
37、的筛分作用，将蛋白质多肽按分子量的大小不同得到质多肽按分子量的大小不同得到分离分离3)将蛋白质固定于尼龙膜上将蛋白质固定于尼龙膜上4)以抗体识别待检蛋白（抗原）以抗体识别待检蛋白（抗原）固定物1Ab2AbE 蛋白质蛋白质（抗原）（抗原）第三十页，讲稿共七十五页哦2.操作过程操作过程1)样品制备：样品制备：A.收集细胞收集细胞B.PBS洗涤并离心沉淀细胞洗涤并离心沉淀细胞C.加入适量细胞裂解液重悬细胞，置冰上加入适量细胞裂解液重悬细胞，置冰上30分钟分钟D.高速离心，取上清（蛋白溶液）高速离心，取上清（蛋白溶液）E.加入等量加入等量2XSDSPAGE样品缓冲液样品缓冲液F.煮沸煮沸5分钟后上样（
38、或保存于分钟后上样（或保存于20）2)制胶（不连续缓冲胶系统）：制胶（不连续缓冲胶系统）：A.胶的成份：胶的成份：压缩胶压缩胶分离胶分离胶第三十一页，讲稿共七十五页哦B.胶浓度的选择：胶浓度的选择：丙烯酰氨浓度蛋白线性分离范围/KDa1512107.551043126020803694572123)加样与电泳：加样与电泳：A.加适量的样品（加适量的样品（2001000ug总蛋白量）、对照及蛋白分子总蛋白量）、对照及蛋白分子量量markerB.180200volts电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（Bio-Rad电泳装置）电泳装置）第三十二页，讲稿共七十五页哦4)凝胶染色：凝胶染色
39、：A.考马斯亮蓝（考马斯亮蓝（R250）染色）染色B.银染银染5)印迹转移：印迹转移：A.原理：带正电荷的蛋白质在电场作用下从负极（凝胶）向正极（尼龙原理：带正电荷的蛋白质在电场作用下从负极（凝胶）向正极（尼龙膜或硝纤膜）迁移，蛋白质通过疏水作用结合到膜上膜或硝纤膜）迁移，蛋白质通过疏水作用结合到膜上B.4条件下，条件下，300mA电泳电泳13小时（小时（Bio-Rad电泳装置）电泳装置）6)封闭：封闭：5%脱脂牛奶或脱脂牛奶或5%BSA，室温下，室温下1小时（或小时（或4过夜）过夜）7)一抗反应：一抗反应：A.选择合适的第一抗体选择合适的第一抗体B.适量抗体以适量抗体以5%脱脂牛奶或脱脂牛奶
40、或5%BSA稀释稀释C.室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应第三十三页，讲稿共七十五页哦8)二抗反应：二抗反应：A.选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体B.适量抗体以适量抗体以5%脱脂牛奶或脱脂牛奶或5%BSA稀释稀释C.室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应9)加生色底物显色加生色底物显色A.HRP的底物：的底物：生色：生色：4氯氯1萘酚萘酚/H2O2发光：发光：ECL溶液（鲁米诺溶液（鲁米诺/4碘代酚碘代酚/H2O2）B.AP的底物：的底物：生色：氮蓝四唑生色：氮蓝四唑/5溴溴4氯吲哚磷酸氯吲哚磷酸发光：发光：AMPPD10)拍
41、片或曝光、洗片拍片或曝光、洗片第三十四页，讲稿共七十五页哦0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrp53p21-TubulinTime after irradiationDNA damage induces down-regulation of histone gene transcription which parallels cell cycle arrest第三十五页，讲稿共七十五页哦3.优缺点：优缺点：1)优点：优点：不须纯化而直接反映其中单个蛋白表达水平的变化不须纯化而直接反映其中单个蛋白表达水平的变化用于观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实用于
42、观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实实验简单可靠、重复性好实验简单可靠、重复性好2)缺点：缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程不能反映蛋白质变化的中间过程灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质的变化灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质的变化对抗体的依赖度高对抗体的依赖度高4.应用应用：1)直接检测蛋白质的有无、变化直接检测蛋白质的有无、变化2)可直接检测部分蛋白的功能可直接检测部分蛋白的功能3)与其它方法结合后，可检测蛋白蛋白相互作用与其它方法结合后，可检测蛋白蛋白相互作用第三十六页，讲稿共七十五页哦酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）1.原理：原理：1
43、)将将可可溶溶性性蛋蛋白白质质（单单一一组组分分或或混混合合组组分分）固固定定于于酶酶标标板板壁壁上上抗抗原原或抗体或抗体2)检检测测待待检检蛋蛋白白抗抗体体或抗原或抗原固定物1Ab2AbE 蛋白质蛋白质（抗原）（抗原）第三十七页，讲稿共七十五页哦2.操作过程（间接法、双抗体夹心法）操作过程（间接法、双抗体夹心法）1)样品处理：样品处理：A.已知样品必须是可溶性蛋白溶于已知样品必须是可溶性蛋白溶于PBS、水等、水等B.样品可以是单一组分或混合组分样品可以是单一组分或混合组分2)包板：包板：A.适量的抗原以高适量的抗原以高PH溶液（溶液（PH7.67.8的碳酸盐缓冲液）或低的碳酸盐缓冲液）或低P
44、H溶液（溶液（PH4.8枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板B.4反应反应12天天C.PBS洗涤后，即可使用该板或可较长期保存洗涤后，即可使用该板或可较长期保存3)封闭：封闭：4%脱脂牛奶或脱脂牛奶或4%BSA，室温下，室温下1小时（或小时（或4过夜）过夜）第三十八页，讲稿共七十五页哦4)一抗反应：一抗反应：A.选择合适的第一抗体选择合适的第一抗体B.适量抗体以适量抗体以4%脱脂牛奶或脱脂牛奶或4%BSA稀释稀释C.室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应8)二抗反应：二抗反应：A.选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体B.
45、适量抗体以适量抗体以4%脱脂牛奶或脱脂牛奶或4%BSA稀释稀释C.室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应9)加生色底物显色：加生色底物显色：HRP的底物：的底物：H2O2/TMB10)终止：终止：2M H2SO411)结果判断：结果判断：目测法目测法仪器法仪器法第三十九页，讲稿共七十五页哦3.优缺点：优缺点：1)优点：优点：用于观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实用于观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实方法简单（多样）、快速方法简单（多样）、快速可大批量检测标本可大批量检测标本敏感性较高敏感性较高2)缺点：缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程不能反映蛋白质变化的中间过程
46、多用于检测细胞表达量较大的可溶性蛋白质的变化多用于检测细胞表达量较大的可溶性蛋白质的变化特异性相对较低，重复性相对较差特异性相对较低，重复性相对较差对所用抗体的依赖度高对所用抗体的依赖度高4.应用应用：大批量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化大批量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化第四十页，讲稿共七十五页哦What is Flow Cytometry?Flow Cytometry is a powerful technique for cell counting,sorting and surface marker analyzingFlow Cytometry can provide qua
47、ntitative information about cell surface markersBased on immunofluorescence technique and computer-aided analysis流式细胞仪（流式细胞仪（FACS）检测）检测第四十一页，讲稿共七十五页哦1.原理：基于单个细胞水平的检测原理：基于单个细胞水平的检测第四十二页，讲稿共七十五页哦Fluorescence-activated cell sorter(FACS)FACS is one version of Flow Cytometry,which can sort cells by their
48、 surface markersIndividual cell is positively or negatively charged based on their fluorescence colorWhen charged cells pass through an electric field,they are deflected and hence separated第四十三页，讲稿共七十五页哦2.FASC的应用：的应用：1)细胞表面标志细胞表面标志2)细胞组分：细胞组分：DNA含量含量RNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量3)细胞动力学参数细胞动力学参数细胞增殖细胞增殖细胞凋亡细胞凋亡细
49、胞分化细胞分化4)其它：其它：1.白血病免疫分型白血病免疫分型2.造血干细胞造血干细胞3.血小板血小板4.机体免疫功能机体免疫功能5.各种基因各种基因1.癌基因和抑癌基因癌基因和抑癌基因2.调节基因调节基因3.肿瘤转移相关基因肿瘤转移相关基因4.多药耐药基因多药耐药基因第四十四页，讲稿共七十五页哦Use Flow Cytometry to examine CD4 and CD8 expression during T cell maturationTreat T cell population with anti-CD4 monoclonal antibody(coupled with dye
50、 1)and anti-CD8 monoclonal antibody(coupled with dye 2)at different maturation stages,then subject the cell population to FACS.Flow Cytometry dot plots will be generated.第四十五页，讲稿共七十五页哦0.111010010000.11101001000dye 1 intensity(for CD4)dye 2 intensity(for CD8)Double Negative(CD4-,CD8-)Doublepositive(C