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1、实验原理RNA的多聚酶反应（的多聚酶反应（RT-PCR）是以是以mRNA 为为模板进行逆转录反应（模板进行逆转录反应（reverse transcription，RT）与与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中可用于检测单个细胞或少数细胞中少于少于10个拷贝的个拷贝的RNA模板。模板。RNA扩增包括两个步骤：扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补的互补cDNA，加热后，加热后cDNA与与RNA链解离，链解离，然后与另一引物退火，并由然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物聚合酶催化引物延伸生成双链靶延伸生成双链靶DNA
2、，最后扩增靶最后扩增靶DNA.mRNAcDNAPCR产物第1页/共16页一步法：一步法：利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、引物、Taq酶、酶、4种种dNTP 直接进行直接进行mRNA反转录与反转录与PCR扩增。利用反转录酶和扩增。利用反转录酶和 Taq酶作用在同一体系中直接以酶作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使扩增，从而使mRNA的的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测度，临床小样品的检测非常
3、有利。用一步法扩增可检测出总出总RNA中小于中小于1ng的低丰度的低丰度mRNA。该法可用于低丰该法可用于低丰度度mRNA的的cDNA文库的构建及特异文库的构建及特异cDNA的克隆，并有的克隆，并有可能与可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。RT-PCR一步法和两步法一步法和两步法第2页/共16页两步法：由于单管反应时两步法：由于单管反应时RT和和PCR都不能在最都不能在最佳条件下进行并且佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物
4、扩增较短的基因，及定量基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR。两两步法则是将步法则是将RT和和PCR分别进行，这样使得两个分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的未知模板，以及多个基因的RT-PCR。RT-PCR一步法和两步法一步法和两步法第3页/共16页外源基因的转录表达第4页/共16页基因表达 基因表达指基因组中某基因在细胞中转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。基因表达的改变预示着细胞在分子水平上的变化。它往往是细胞形态
5、功能变化之前的变化。DNARNAProtein转录翻译第5页/共16页目前研究转基因植物外源基因转录表达的常用方法1、RT-PCR(RNA)2、Northern blot(RNA)3、real-time PCR(RNA）第6页/共16页反转录PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCROligo dT,逆转录酶特异性引物,Taq酶用途:获得所需cDNA片段；检测基因表达注意问题：1、PCR效率差异，重复性2、内参选定3、共同扩增4、扩增片段位置5、mRNA丰度第7页/共16页仪器 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电
6、泳系统，水漂，恒温水浴。试剂 RNA 反转录酶，3U/L Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌dd water。第8页/共16页实验操作步骤：1）RNA提取：关键 防止RNARNA降解RNA提取的成功与否是RT-PCR检测中最重要的步骤。第9页/共16页2)逆转录：RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物，Oligo dT;特异引物)5AAAAAAAA3TTTTTTTTmRNAcDNAA）在0.2mL微量离心管中，加入如下各成分总RNA 2L（1-5g）10PCR buffer 1L
7、dNTPmix（各2.5mM）2L 逆转录酶（200u/L）0.5L Oligo（dT）或randorm 9 mers 2LddH2O 至10L混匀后稍离心，42孵育30min，99 5min然后4 保温5min，终止反应后置冰上。第10页/共16页3)PCR特异性引物、模板、Taq 聚合酶。（B）在0.2mL PCR 微量离心管中配制20L反应体系 10PCR buffer（含MgCl2）3L 2.5mmol/L dNTP 2L 10mol/L Primer1 1L 10mol/L primer2 1L 模板CDNA 5L 3U/L Taq酶 0.5L dd water 补足至 20L（C）
8、根据具体的条件设置PCR仪的循环程序：（D）PCR结束后，取10L产物进行琼脂糖凝胶电泳。第11页/共16页RT-PCR全过程AAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5Transcripcin reversaPCR usando GSP+GSP1AAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5mRNA(sense)Primer Antisense:oligo(dT)o1ra cadena cDNAGSP1(sense)GSP(antisense)GSP1GSPRequiere el conocimiento de la secuencia para disear GSP and GSP1第12页/共16页【结果与分析】利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录；观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果第13页/共16页实验中应注意的问题RNA提取过程中防止降解去除DNA的污染实验中注意设置阴性对照在冰上操作第14页/共16页思考题结合实验结果，试论应用RT-PCR研究外源基因转录表达的优缺点。第15页/共16页感谢您的观看！第16页/共16页