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1、实验二实验二 蛋白质的性质实验（一）蛋白质的性质实验（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质及氨基酸的呈色反应12/5/20221西南大学药学院生物制药实验室实验目的实验目的n n了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式n n了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。n n学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。学习几种常用
2、的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。N 端端C 端端12/5/20222西南大学药学院生物制药实验室 定量测定蛋白质的方法：定量测定蛋白质的方法：n n凯氏定氮法n n双缩脲法n n茚三酮法n nFolin-酚（lowry法）n n考马斯亮蓝G250法n n紫外吸收法12/5/20223西南大学药学院生物制药实验室实验原理实验原理尿素尿素 双缩脲双缩脲 紫红色络合物紫红色络合物n n双缩脲反应双缩脲反应双缩脲反应双缩脲反应12/5/20224西南大学药学院生物制药实验室n n双缩脲反应双缩脲反应双缩脲反应双缩脲反应 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在
3、蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与碱性溶液中蛋白质与碱性溶液中蛋白质与碱性溶液中蛋白质与Cu2+Cu2+Cu2+Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深形成紫红色络合物，其颜色的深形成紫红色络合物，其颜色的深形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。分无
4、关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于时反应，并于时反应，并于时反应，并于540560nm540560nm540560nm540560nm下比色，可以通过标准蛋白质的下比色，可以通过标准蛋白质的下比色，可以通过标准蛋白质的下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结标准曲线求出未知的蛋
5、白质浓度，标准蛋白溶液可以用结标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。实验原理实验原理12/5/20225西南大学药学院生物制药实验室实验原理实验原理在弱酸条件下（在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和此反应为一切蛋白质和
6、-氨基酸所共有氨基酸所共有(亚氨亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物酸产生黄色化合物)。含有氨基的其他化合物含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。亦可发生此反应。12/5/20226西南大学药学院生物制药实验室实验原理实验原理n n黄色反应黄色反应 蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀加热则白色沉淀变成黄色再加碱颜色加深呈橙黄色这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化产生了黄色硝基苯衍生物(硝醌酸钠）。绝大多数蛋白质均含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应硝基酚硝基酚硝基酚硝基酚(黄色黄色黄色黄色)邻硝醌酸钠邻硝醌酸钠邻硝醌酸钠邻硝醌酸钠(橙黄色橙黄色橙黄色橙黄色)12/5/2022
7、7西南大学药学院生物制药实验室实验原理实验原理n n考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应 考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250G250G250在酸性溶液中以游离形式存在在酸性溶液中以游离形式存在在酸性溶液中以游离形式存在在酸性溶液中以游离形式存在(呈棕红色呈棕红色呈棕红色呈棕红色)，当与蛋白质通过疏水作用力结合后变，当与蛋白质通过疏水作用力结合后变，当与蛋白质通过疏水作用力结合后变，当与蛋白质通过疏水作用力结合后变为为为为蓝色蓝色蓝色蓝色。它的染色灵敏度比氨基黑高。它的染色灵敏度比氨基黑高。它的染色灵敏度比氨基黑高。它的染色灵敏度比氨基黑高 3 3 3 3 倍，反应速倍，反应速倍，
8、反应速倍，反应速度也快度也快度也快度也快(2 min(2 min(2 min(2 min 内即可达到平衡点内即可达到平衡点内即可达到平衡点内即可达到平衡点)。在在在在 0.011.0 mg Pr 0.011.0 mg Pr 0.011.0 mg Pr 0.011.0 mg Pr 范围内，范围内，范围内，范围内，Pr Pr Pr Pr 与与与与 A A A A595595595595 nm nm nm nm 值成值成值成值成正比。正比。正比。正比。12/5/20228西南大学药学院生物制药实验室实验仪器及试剂实验仪器及试剂n n考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250G250G2
9、50n n0.5%0.5%0.5%0.5%苯酚苯酚苯酚苯酚n n浓硝酸浓硝酸浓硝酸浓硝酸n n0.1%0.1%0.1%0.1%茚三酮茚三酮茚三酮茚三酮n n尿素尿素尿素尿素n n1%1%1%1%硫酸铜硫酸铜硫酸铜硫酸铜n n2%2%2%2%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液12/5/20229西南大学药学院生物制药实验室实验步骤实验步骤双缩脲反应双缩脲反应双缩脲反应双缩脲反应n n 取少量尿素结晶于干燥的试管中，用微火取少量尿素结晶于干燥的试管中，用微火取少量尿素结晶于干燥的试管中，用微火取少量尿素结晶于干燥的试管中，用微火加热熔化加热熔化加热熔化加热熔化 尿素重又开始硬化时尿素
10、重又开始硬化时尿素重又开始硬化时尿素重又开始硬化时停止加热停止加热停止加热停止加热 可见到氨气释出可见到氨气释出可见到氨气释出可见到氨气释出 冷冷冷冷却后却后却后却后加入加入加入加入 10%10%10%10%NaOHNaOHNaOHNaOH 溶液约溶液约溶液约溶液约 1 ml1 ml1 ml1 ml，振荡混匀，振荡混匀，振荡混匀，振荡混匀 加加加加 1%1%1%1%CuSO4 CuSO4 CuSO4 CuSO4 溶液溶液溶液溶液 1 1 1 1 滴，振荡滴，振荡滴，振荡滴，振荡 观察颜色变化观察颜色变化观察颜色变化观察颜色变化n n取取取取 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 卵清蛋白溶液
11、于干燥的试管中卵清蛋白溶液于干燥的试管中卵清蛋白溶液于干燥的试管中卵清蛋白溶液于干燥的试管中 加加加加 10%10%10%10%NaOHNaOHNaOHNaOH 溶液约溶液约溶液约溶液约 2 ml2 ml2 ml2 ml，摇匀，摇匀，摇匀，摇匀 加加加加 1%CuSO4 1%CuSO4 1%CuSO4 1%CuSO4 溶液溶液溶液溶液 2 2 2 2 滴，随加滴，随加滴，随加滴，随加随振荡随振荡随振荡随振荡 观察颜色变化观察颜色变化观察颜色变化观察颜色变化 茚三酮反应茚三酮反应茚三酮反应茚三酮反应 取取取取两只试管两只试管两只试管两只试管，分别加入，分别加入，分别加入，分别加入 2%2%2%2
12、%的的的的卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液和和和和0.5%0.5%0.5%0.5%的的的的 GlyGlyGlyGly 溶液溶液溶液溶液 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 各各各各加加加加 0.5 ml 0.1%0.5 ml 0.1%0.5 ml 0.1%0.5 ml 0.1%的水合茚三酮溶液的水合茚三酮溶液的水合茚三酮溶液的水合茚三酮溶液，混匀，混匀，混匀，混匀 在在在在沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴中加热中加热中加热中加热 12 min 12 min 12 min 12 min 观察颜色变化观察颜色变化观察颜色变化观察颜色变化 在一小块滤纸上滴一滴在一小块滤纸上滴一滴在一小块
13、滤纸上滴一滴在一小块滤纸上滴一滴 0.5%0.5%0.5%0.5%的的的的 GlyGlyGlyGly 溶液溶液溶液溶液 风干风干风干风干 在在在在原处原处原处原处滴一滴滴一滴滴一滴滴一滴 0.1%0.1%0.1%0.1%的茚三酮的茚三酮的茚三酮的茚三酮-乙醇乙醇乙醇乙醇溶液溶液溶液溶液 将滤纸在微火旁将滤纸在微火旁将滤纸在微火旁将滤纸在微火旁烘干烘干烘干烘干 观察颜色变化观察颜色变化观察颜色变化观察颜色变化12/5/202210西南大学药学院生物制药实验室管号123456材料(滴)鸡蛋清溶液 4 滴指甲少许头发少许0.5%苯酚4 滴0.3%Trp4 滴0.3%Tyr4 滴浓硝酸(滴)24040
14、444待个试管出现黄色后，在室温下逐滴加入10%NaOH 溶液至碱性，观察颜色变化.现象解释黄色反应黄色反应12/5/202211西南大学药学院生物制药实验室管号管号试剂试剂1 12 2蛋白质溶液蛋白质溶液(ml)(ml)0 00.10.1蒸馏水蒸馏水(ml)(ml)1 10.90.9考马斯亮蓝考马斯亮蓝染液染液(ml)(ml)5 55 5现象现象解释解释考马斯亮蓝12/5/202212西南大学药学院生物制药实验室实验结果实验结果n n按要求填写四张表格按要求填写四张表格n n（一）双缩脲反应（一）双缩脲反应n n（二）茚三酮反应（二）茚三酮反应n n（三）黄色反应（三）黄色反应n n（四）考马斯亮蓝反应（四）考马斯亮蓝反应12/5/202213西南大学药学院生物制药实验室